パートⅠネズミモデルでスタチンと組み合わせて使用した場合のハーブシスタンチのアジュバント値
Mar 07, 2022
Elaine Wat、Chun Fai Ng、Chi Man Koon、Cheng Zhang、Si Gao、Brian Tomlinson、Clara Bik San Lau
1香港中文大学中文大学、沙田、新界、香港。
2香港中文大学、沙田、新界、香港、中国西部の植物化学および植物資源の国家重点実験室。
3香港中文大学、沙田、新界、香港の医学および治療学科の臨床薬理学部門。 ElaineWatとChunFaiNgは、この作業に等しく貢献しました。 資料の連絡および要求は、CBSL宛てに送信する必要があります（電子メール：claralau@cuhk.edu.hk）
Cistancheの詳細については、ここをクリックしてください
概要
スタチンは、筋肉毒性の問題があることでよく知られています。ハーブホンオニク（HC）は、腰や膝の痛みに伝統的に使用される中国のハーブです。 私たちの以前のinvitro研究は、それがスタチン誘発性の筋肉毒性から保護できることを示唆しました。 ただし、invivoでの保護効果は調査されていません。 この研究の目的は、ハーブCistanche（HCE）は、ラットのシンバスタチン誘発性筋毒性を予防し、Herba Cistanche Eが高脂肪食誘発性高コレステロール血症および肝臓コレステロール上昇の減少に有益な効果を発揮し、それによって併用療法で使用した場合のシンバスタチンの用量を減少させることができるかどうかを防ぐことができます。 私たちの結果から、Herba Cistanche Eは、シンバスタチンによって誘発された筋肉重量の減少を有意に回復させ、ラットの血漿クレアチンキナーゼの上昇を減少させました。ハーブCistancheEはまた、シンバスタチンによって誘発される筋肉グルタチオンレベルの低下、筋ミトコンドリア膜電位、およびシンバスタチンによって誘発される筋肉の炎症を改善しました。 さらに、HCEは、高脂肪食マウスの肝臓重量、総肝臓脂質レベル、および血漿脂質レベルを低下させる可能性があります。 結論として、私たちの研究は、ハーブ CistancheEは、筋肉におけるシンバスタチン誘発毒性に対する潜在的な保護効果、および単独で、または低用量のシンバスタチンと組み合わせて使用した場合の食事誘発性非アルコール性脂肪肝および高脂血症に対する有益な効果もあります。
スタチンとしても知られるHMG-CoAレダクターゼ阻害剤は、中等度および高心血管疾患のリスクを伴う高コレステロール血症患者に有益であることが十分に立証されています1。 世界で最も売れている処方薬クラスの1つであるスタチンは、メバロン酸経路の初期段階でHMG-CoAのメバロン酸への還元を阻害することで作用し、内因性コレステロール合成を低下させます2、3。 、最も重要でよく知られている臨床的悪影響の1つは、良性の筋痛から重度の筋障害にまで及ぶ可能性のある骨格筋の異常です4、5。電話インタビューを通じて実施された10,409人のフランス人被験者に関する大規模な調査では、患者の10％がスタチン治療は筋肉症状を報告し、これらの症候性患者の30％が治療中止をもたらしました6。 National Lipid Association Statin Safety Task Forceは、スタチン療法を受けている患者の筋肉関連症状の管理に関する推奨事項を提供しています。 一般に、5×ULNを超えるクレアチンキナーゼ（CK）の上昇などの重度の症状のある患者では、CKレベルが再び正常化するまでスタチンを控えるべきであるとアドバイスされています5。 これらの副作用が発生し、スタチン誘発性の筋肉毒性に対する効果的な治療法が存在しないため、スタチン誘発性の筋肉の問題を管理するための新しい治療法を探すことが求められています。
メカニズムのメドレーが提案されており、スタチンの副作用の原因となる可能性がありますが、ミトコンドリアのメカニズムは、スタチンの筋毒性の副作用に関係していると考えられています1。 メバロン酸はコレステロール前駆体であるだけでなく、セレノプロテイン、ドリコール、ユビキノンなどの重要な化合物の前駆体でもあります7。効果4。 スタチンはまた、ユビキノンの枯渇を引き起こし、酸素消費量とATP合成の低下を引き起こす可能性があります9。 さらに、invitroおよびinvivo研究の増加は、スタチンが組織ミトコンドリアにも直接作用して、活性酸素種（ROS）およびミトコンドリアの酸化ストレスを増加させ、細胞死を引き起こし、したがって肝臓および筋肉の損傷に寄与する可能性があることを示しました10、11。
ハーブホンオニク、乾燥した植物全体CistancheニクジュヨウYC Ma（ハマウツボ科）は、主に中国北部と北東部の砂漠地帯で成長する寄生植物です12。 漢方薬の理論によると、Herba Cistanchesは甘く、暖かく、塩辛い味がします13。 これは、主にインポテンス、不妊症、早漏などの症状を伴う腎臓の欠乏症を治療するために使用される、ヤンを活気づける中国の強壮ハーブです。 それはまた、腰や膝の痛みのために患者に伝統的に処方され、筋肉の問題の治療のための中国の製剤で一般的に使用されている中国のハーブです12、14。興味深いことに、これはまた、 -運動後のラットにおけるHerbaCistanchesの多糖類およびフェニルエタノイドに富む抽出物の疲労活動。筋肉の損傷を減らし、ATP貯蔵を改善します15。 さらに、最近の研究では、HerbaCistanchesのメタノール抽出物がミトコンドリアのATP生成を促進する可能性があることが示されました16。ハーブホンオニクまた、さまざまな臓器で強力な抗酸化物質およびフリーラジカルスカベンジャーであることが証明されており、invivo研究で酸化ストレスとROS活性を低下させます17、18。ハーブホンオニク水性抽出物は、L6骨格筋細胞におけるシンバスタチン誘発毒性を有意に予防し、L6細胞におけるATP産生の用量依存的に回復したシンバスタチン誘発性の低下を示唆し、ハーブホンオニクスタチン誘発性の筋肉毒性から保護するための水性抽出物19。 それにもかかわらず、invivoでの証拠は不足しています。
したがって、私たちは次のように仮定しましたハーブホンオニク水性抽出物（HCE）は、シンバスタチン誘発性の筋肉毒性に有益な効果を発揮する可能性があります。 したがって、この研究は、HCEの使用がin vivo動物モデルを使用してシンバスタチン誘発性筋毒性を低減できるかどうか、さらに、HCEが高脂肪食誘発性高コレステロール血症および肝臓コレステロール上昇の低減に有益な効果を発揮できるかどうかを判断することを目的とした、それによって使用されるシンバスタチンの用量を減らします。
材料および方法
ハーブ素材の認証と抽出。
の生ハーブ素材ハーブホンオニク（内モンゴルから供給されたCistanchedeserticola）は中国広州の有名なサプライヤーであるZiXinから購入しました。 Herba Cistanchesは、前述のように中国薬局方201013に従って、薄層クロマトグラフィーと超高性能液体クロマトグラフィーを使用して化学的に認証されました。ベルバスコシドとエキナコシド（中国の医薬品および生物学的製品の管理のための国立研究所から購入）化学マーカーとして。 化学認証の際、植物標本の標本ハーブホンオニク香港中文大学の中国医学研究所の博物館にバウチャー標本番号2014-3434で寄託されました。
ハーブホンオニク水性抽出物は以前に記載されたように調製された19。 簡単に説明すると、1 kgの生薬草を1時間浸した後、10倍の蒸留水を使用して100度の還流下で1時間加熱することにより、2回抽出しました。 次に、水性抽出物（ＨＣＥ）を合わせて濾過し、濾液を減圧下、６０度で濃縮した。 Te濃縮抽出物を凍結乾燥して乾燥させた。 収量のパーセンテージは50.1パーセントw/wでした。 抽出した粉末はすべて真空パックし、使用するまで保管しました。
実験動物。
シンバスタチンはSRPharmasolutionsLtdから購入しました。オスのSpragueDawleyラット（180〜200 g）とオスのC57Bl / 6Jマウス（8-週齢）は、香港中文大学の実験動物サービスセンターから提供されました。 動物実験は、香港中文大学の動物実験倫理委員会によって承認されました（参照番号12/074 / MIS）。 すべての実験方法は、香港中文大学の動物実験倫理委員会によって指定された承認されたガイドラインに従って実施されました。 すべてのラット（ケージあたり3匹の動物）とマウス（ケージあたり5匹の動物）を、12-時間の明暗サイクルで21度の一定温度で通常の標準ケージに収容しました。 各標準ケージには、敷料としてアスペンが含まれていました。 すべての動物は、食事と水を自由に摂取できるようにした。
ラットにおけるスタチン誘発性筋毒性の研究。
すべてのラットをランダムに5つのグループに分けました（n =5 –1 0）。 すべての動物は通常の固形飼料を摂取していた。 彼らはまた、蒸留水またはシンバスタチンを毎日、そして胃内でのHCE治療の有無にかかわらず与えられた。 シンバスタチンとHCEの両方を投与する必要がある動物の場合、直接的な薬草と薬物の化学的相互作用を防ぐために、シンバスタチン投与の3時間後にHCEを投与しました。 ハーブ抽出物またはシンバスタチンを、既知の濃度で蒸留水中の0.5パーセントのメチルセルロースに溶解しました。 計算された体積が必要とされる提案された用量の量を含むように、事前に計算された体積が、個体の体重に従って各動物に胃内に与えられた。 これらのグループの詳細は次のとおりです。
グループa）通常食と蒸留水（通常対照群）
グループb）通常食とシンバスタチン（640mg / kg）
グループc）通常食餌+シンバスタチン（640mg / kg）+低用量HCE（1.1 g / kg動物）
グループd）通常食餌+シンバスタチン（640mg / kg）+高用量HCE（2.2 g / kg動物）
グループe）通常食餌と高用量HCE（2.2 g / kg動物）
食物摂取量を毎日記録し、体重を週に2回測定しました。 治療は4週間行われました。 その後、ケタミン（100mg / kg）とキシラジン（10mg / kg）の混合物を腹腔内投与して動物に麻酔をかけた。 心臓穿刺により血液を採取し、凝固させた。 次に、血漿を遠心分離（3、000 rpmで10分間）によって分離しました。 さまざまな筋肉（大腿四頭筋、腓腹筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、総指伸筋）を切除し、分析まで-80度で保存しました。
血漿クレアチンキナーゼ測定。 血漿クレアチンキナーゼ（CK）活性は、StanbioCKLiqui-UV®キット（2910-430、Stanbio Laboratory、USA）を製造元の指示に従って使用して決定しました。
筋肉グルタチオンペルオキシダーゼの測定。 筋肉グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）は、市販のキット（703102、Cayman Chemical、USA）を使用して、製造元の指示に従って測定しました。 簡単に説明すると、筋肉組織をpH 7.4のPBSでリンスして赤血球を除去し、5〜10 mlの冷溶解緩衝液でホモジナイズした後、ホモジネートを10000gで15分間4度で遠心分離しました。 次に、上清を除去し、市販のキットを使用してGPx活性をアッセイしました。
筋肉ミトコンドリアおよびサイトゾル画分の調製。 筋肉サンプルからのミトコンドリアおよびサイトゾル画分は、ミトコンドリア分離キット（MITOISO、Sigma-Aldrich Corporation、米国）を製造元の指示に従って使用して調製しました。 簡単に説明すると、新鮮な筋肉サンプルを抽出バターで前処理し、小片に切断し、抽出バッファーでホモジナイズしました。 次に、組織ホモジネートを遠心分離した。 上清を回収し、細胞質画分分析用に保存しました。 次に、ミトコンドリアペレットを洗浄して再度遠心分離し、ミトコンドリア画分分析に使用しました。
筋肉ミトコンドリアの活性酸素種（ROS）の測定。 ROSは、以前の文献から変更されたプロトコルで測定されました20。 簡単に説明すると、ROSは、DCFDA溶液（C6827、Invitrogen、USA）を使用して、ミトコンドリア画分（50 µgタンパク質/ ml）から測定されました。 混合物を暗所で37度で10分間インキュベートし、その後、光活性化のために基質溶液（10 mMピルビン酸、15 mMリンゴ酸）とインキュベートした。 蛍光強度は、BioRad Fluostar Optima413-101BMG蛍光マイクロプレートリーダーによって485nmの励起と520nmの発光で5分ごとに60分間測定されました。 ROS生成の測定のために蛍光強度を計算した。
筋ミトコンドリア膜電位。 筋肉サンプルからのミトコンドリア画分のミトコンドリア膜電位は、製造元のプロトコル（MITOISO、Sigma-Aldrich Corporation、米国）に従って決定されました。 この手順は、J凝集体の形成を伴うJC-1の取り込みを測定する固定小数点アッセイです。 簡単に説明すると、ミトコンドリア懸濁液を20 µgのタンパク質を含むように希釈し、JC-1染色液とともに室温で7分間インキュベートしました。 この7-分は、さまざまな化合物を使用して製造業者によって最適化および検証された時間です（製造元のプロトコルに記載されています）。これは、観察された溶液の蛍光が5〜10分後にプラトーに上昇し、その後大幅に減少するためです。ミトコンドリアマトリックスの内側と外側のJC-1濃度の均等化によるJC-1蛍光。 蛍光強度は、BioRad Fluostar Optima413-101BMG蛍光マイクロプレートリーダーによって490nmの励起と590nmの発光で測定されました。 電位勾配の測定のために蛍光強度を計算した。
筋肉組織学および炎症評価。 筋肉内の炎症細胞の免疫組織化学は、前述のようにCD68およびCD163染色によって評価されました21–23。 5μmのParafn切片を切り取り、Superfrost™Plusガラススライド（Menzel-Gläser、ドイツ）に接着しました。 一次マウス抗ラットCD68、ED1、およびCD163抗体、ED2（Bio-Rad、USA）を1：100希釈で切片に適用しました。 特異的染色は、二次抗体であるEnVision-HRPポリマー結合抗マウスIgGを1：200希釈で使用して、EnVision™Systems（Dako、デンマーク）によって検出され、DAB溶液（Dako、デンマーク）を使用して検出されました。ヘマトキシリンで対比染色する。 次に、切片をヒストン中のフタル酸ジブチル（DPX）にマウントしました。 筋肉内の好中球の存在は、ImageJソフトウェアを使用した定量的免疫組織化学によって検出されました。
筋肉遺伝子発現分析。 酸化ストレスに関連する遺伝子をプロファイリングするPCRアッセイは、ラット酸化ストレスおよび抗酸化防御PCRアレイ（PARN -065 Z、SABiosciences、フレデリック、米国）を使用して実行されました。 PCRアレイは、製造元の指示に従って実行されました。 簡単に説明すると、変性グアニジンチオシアン酸塩バッファー（RNeasyキット、Qiagen）で筋肉サンプルを溶解およびホモジナイズした後、シリカゲルベースのメンブレンに選択的に結合することにより、トータルRNAを単離しました。 RT2 First Strand Kit（SABiosciences、Frederick、USA）を使用して、RNAをcDNAに逆転写しました。 次に、このcDNAをRT2 SYBR Green qPCRマスターミックス（SABiosciences、フレデリック、米国）に追加しました。 次に、各サンプルをラット酸化ストレスおよび抗酸化防御PCRアレイ（SABiosciences、フレデリック、米国）に分注しました。 すべてのステップは、製造元のプロトコルに従って実行されました。
マウスにおける高脂肪食誘発性高脂血症および脂肪肝の研究。
すべてのマウスをランダムに5つのグループ（n =8 –1 0）に分け、以下を投与しました。 グループbからe）高脂肪食（21パーセントの脂肪と0。15パーセントのコレステロールを含む）（表2）。 動物が肥満を誘発するために食事を8週間与えた。 8週間後、すべての高脂肪食群に、シンバスタチン投与の3時間後に、蒸留水またはシンバスタチンを毎日投与するか、胃内にHCE治療を行いました。 ハーブ抽出物またはシンバスタチンを、蒸留水中の0.5％メチルセルロース（Sigma-Aldrich Corporation、USA）に既知の濃度で溶解しました。 計算された体積が必要とされる提案された用量の量を含むように、事前に計算された体積が、個体の体重に従って各動物に胃内に与えられた。 これらのグループの詳細は次のとおりです。
グループa）通常食と蒸留水
グループb）高脂肪食と蒸留水
グループc）高脂肪食とシンバスタチン（50mg / kg）
グループd）高脂肪食とHCE（4.4 g / kg）
グループe）高脂肪食+シンバスタチン（25mg / kg）+ HCE（4.4 g / kg）
食物摂取量を毎日記録し、体重を週に2回測定しました。 16-週間の研究の終わりに、16-時間の一晩の絶食後にすべてのマウスを犠牲にしました。 ケタミン（100mg / kg）とキシラジン（10mg / kg）の混合物を腹腔内投与して動物を麻酔した。 心臓穿刺により血液を採取し、凝固させた。 血漿を遠心分離（3、000 rpmで10分間）によって分離しました。 肝臓を切除し、分析まで-80度で保存した。
血漿および肝臓の脂質測定。
血漿トリグリセリド、コレステロール（11488872216および11489232216、Roche Diagnostics、スイス）、高密度および低密度リポタンパク質コレステロール（L-TypeHDL-CおよびL-TypeLDL-C、和光純薬工業、日本）の濃度は、製造元の指示に従って市販のキットを使用する酵素法。 血漿クレアチンキナーゼ（CK）活性は、StanbioCKLiqui-UV®キット（2910-430、Stanbio Laboratory、USA）を使用して決定されました。 Bligh and Dyer24の方法で抽出した後、総肝臓脂質を重量分析で測定しました。 個々の肝脂質は、イソプロパノール（Sigma-Aldrich、USA）に可溶化した後、酵素的に（上記のように）定量化されました25。
肝臓の組織病理学および炎症の評価。 ヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E染色）。 パラフィン包埋組織のダニ切片（5μm）をミクロトームで切断し、SuperFrostPlus®顕微鏡スライド（Thermo Scientific、USA）に配置しました。 ハリスらの方法に従って切片をH＆E染色にかけた。 26ヒストン（DPX）にフタル酸ジブチルを添加（Sigma-Aldrich、米国）25。
Mac-3の染色と定量化。 パラフィン包埋組織の厚い切片（5μm）をミクロトームを使用して切断し、SuperFrostPlus®顕微鏡スライド（Thermo Scientific、USA）に配置しました。 抗原の回収を行い、続いてペルオキシダーゼブロック（Dako Cytomation、デンマーク）でブロックしました。 一次精製抗マウスMac-3抗体（BD Pharmingen、USA）を1:50希釈で切片に適用しました。 EnVision™Systems（Dako、デンマーク）を使用して特異的染色を検出しました。 スライドを二次抗体であるEnVision-HRPポリマー結合抗ウサギIgGと1：200の希釈でインキュベートしました。 Mac -3は、DAB溶液（Dako、デンマーク）を使用して検出され、ヘマトキシリンで対比染色されました。 次に、セクションをDPXにマウントしました。 肝臓におけるマクロファージの存在は、ImageJソフトウェアを使用した定量的免疫組織化学によって検出されました。
統計分析。 治療群と対照群の違いは、一元配置分散分析（ANOVA）と、それに続く事後ボンフェローニの多重比較検定でテストされました。 すべての統計分析は、GraphPadPrismバージョン6.0（GraphPad、USA）を使用して実行されました。 pの確率<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">
結果
の効果ハーブCistancheラットにおけるシンバスタチン誘発性筋毒性に関するE。 筋肉重量と血漿クレアチンキナーゼの測定。 処理したすべてのラットから、5種類の筋肉（大腿四頭筋、腓腹筋、ヒラメ筋、前脛骨筋、長指伸筋）を分離しました。 筋肉重量に対するさまざまな治療の効果を図1aに示します。 シンバスタチン（640mg / kg）は、ラットの大腿四頭筋、腓腹筋、前脛骨筋で有意な体重減少を誘発しましたが、これらの減少は、大腿四頭筋と腓腹筋でHCEによって用量依存的に有意に回復しました。 それでもハーブCistancheEは、シンバスタチン治療ラットの前脛骨筋の重量を回復する傾向を示しましたが、これらの治療グループはいずれも統計的有意性に達していませんでした。 対照ラットと比較した場合、筋肉重量に対するHCE単独治療の有意な効果は観察されなかった（図1a）。
図1bは、ラットの血漿クレアチンキナーゼ（CK）レベルに対するさまざまな治療の効果を示しています。 シンバスタチンはラットのクレアチンキナーゼ活性の有意な増加を誘発しましたが、これは両方の用量でのHCE同時治療によって有意に減少しました。 対照群と比較して、CKレベルに対するHCE単独治療の有意な効果もありませんでした。 腓腹筋はシンバスタチン治療に敏感であるように見え、質量によって分離された最大の筋肉であるため、筋肉グルタチオンペルオキシダーゼ測定（GPx）、ミトコンドリアMMPおよびROS測定、筋肉組織学および炎症評価を含むさらなる分析のためにこの筋肉を選択しました。
筋肉グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）測定。 筋肉のグルタチオンペルオキシダーゼレベルを測定し、図2aに示しました。 シンバスタチン投与は、ラットの筋肉グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）測定値の減少傾向を誘発しました。 ただし、HCEは、1.1 g/kgと2.2g/ kgの両方の用量で、シンバスタチンによって誘発される筋肉GPxの低下を改善する傾向を示しました。 正常な対照ラットと比較して、筋肉のGPxレベルに対するHCE治療単独の有意な効果もありませんでした。
ミトコンドリア膜電位（MMP）およびROS測定。 シンバスタチン（640mg / kg）治療は、筋肉MMPの有意な減少を誘発しました（図2b）。 この減少は、HCEとシンバスタチンの同時治療を受けたラットで用量依存的に改善されました（図2b）。 一方、興味深いことに、シンバスタチン単独治療群では、正常対照群と比較して、筋ミトコンドリアのROSレベルが有意に低下していました（図2c）。 しかし、シンバスタチン治療ラットに与えられたHCE治療は、筋肉ミトコンドリアのROSレベルを正常レベルに回復させるために用量依存的な傾向を示しました。 ミトコンドリアのMMPとROSの両方の測定について、正常な対照群と比較して、ラットにおけるHCE治療単独の有意な効果もありませんでした。
筋肉組織学および炎症評価。 異なる治療を受けたラットの腓腹筋をさらに組織学的に分析し、代表的な染色切片を図3aに示します。 対照群の動物は、正常な筋肉の組織学的切片を示した。 対照的に、シンバスタチンで治療された動物のH＆E切片は、炎症マーカーの浸潤を明らかにしました（黄色の矢印）。これは、シンバスタチンとHCEの組み合わせを与えられたラットの筋肉切片で有意に減少しました。 免疫組織化学的分析もまた、それぞれ図４ａおよび５ａのマクロファージＣＤ６８およびＣＤ１６３の存在について実施され、それぞれのマクロファージの定量化が図４ｂおよび５ｂに示されている。 筋肉切片の免疫組織化学的分析により、シンバスタチンで治療したラット（茶色の着色）にマクロファージ（CD68）が存在することが明らかになりました。これは、両方の用量でHCEを併用したラットで有意に減少しました（図4b）。 また、HCE単独で治療した動物では有意な炎症は観察されませんでした。 同様に、筋肉切片の免疫組織化学的分析により、シンバスタチン治療ラット（茶色の着色）におけるCD 163-陽性マクロファージの存在が明らかになりました。これは、2.2 g / kgのHCE同時治療を受けたラットで有意に減少しました（図5b）。 ）。 また、HCE単独で治療した動物では有意な炎症は観察されませんでした。
筋肉遺伝子発現分析。 筋肉内の酸化ストレスに関連する遺伝子に対するシンバスタチンとHCEの効果を決定するために、酸化ストレスに関連する遺伝子をプロファイルするPCRアッセイを、ラット酸化ストレスと抗酸化防御PCRアレイを使用して実行しました。 シンバスタチン処理によって有意に影響を受けた遺伝子を分析し、図6に示しました。抗酸化剤を調節する遺伝子の発現プロファイルについて、シンバスタチン（640mg / kg）処理ラットは抗酸化剤を調節する遺伝子の発現を増加させました。 Teseには、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）GPx1とGPx7、およびSerpinb1bとクラブを含む他のペルオキシダーゼが含まれます（図6a）。 両方の用量（1.1または2.2 g / kg）のHCEは、これらのシンバスタチン誘発性のGPxおよび他のペルオキシダーゼの増加を正常レベルに減少させました。 一方、HCE治療のみでは、GPx1の発現レベルが有意に増加しました。 ROS代謝を調節する遺伝子の発現に関して、シンバスタチンは、Cyba、Ncf1、Ncf2、Scd1、およびUcp2を含む他のスーパーオキシド代謝遺伝子の発現を有意に誘導しました。 同様に、両方の用量のHCEは、これらの増加を有意に減少させました（図6b）。 さらに、シンバスタチンは、Apoe、Ccl5、およびTxn1を含む酸化ストレス応答性遺伝子の発現を誘導しましたが、これらの発現は、両方の用量でHCE同時処理動物で有意に減少しました（図6c）。 一方、シンバスタチンは、Txnipの遺伝子発現の有意な減少を引き起こしました。 Txnip遺伝子発現のシンバスタチン誘発性減少に対するHCEの有意な効果はありませんでした（図6c）。 シンバスタチンはまた、Slc38a1やVimなどの酸素トランスポーターを調節する遺伝子の発現を大幅に増加させました。 HCEの併用治療は、両方の用量でこれらの遺伝子の発現を減少させました（図6d）。
シンバスタチンとHCEの併用がマウスの摂餌量と体重に及ぼす影響。 図7aは、すべての治療グループのマウスの毎日の摂餌量を示しています。 高脂肪食は、飼料を与えられた動物と比較して、動物の毎日の食物摂取量の有意な増加を誘発しました（p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">
毎週の体重測定。 16週間の高脂肪給餌後、HF給餌動物は、固形飼料給餌動物よりも有意に体重が増加しました（図7b）。 しかし、HFを与えられたマウスとすべてのHFを与えられた治療群との間に有意な効果はありませんでした。 また、シンバスタチンとHCEの同時治療を受けたHF給餌マウスと、HCEまたはシンバスタチン治療のみを受けたHF給餌マウスとの間に有意差はありませんでした（図7b）。
マウスの高脂血症と脂肪肝に対するシンバスタチンとHCEの併用の効果。 血漿脂質およびクレアチンキナーゼ活性の測定。 すべてのマウスの血漿脂質レベルを図8に示します。通常の固形飼料を与えたマウスと比較して、HFを与えたマウスは血漿総コレステロール（TC）のレベルが有意に上昇し、すべての治療群で有意に減少しました（図8a）。 。 シンバスタチンおよびHCEで治療されたHF給餌マウスは、シンバスタチンのみを投与されたHF動物またはHCEのみを投与されたHF動物と比較して、血漿TCが有意に低かった（p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">
シンバスタチン治療のみを与えられたHF給餌マウスと比較して低い血漿TG（p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">iver脂質測定。
HF誘発性肝腫大（肝臓の肥大）に対するさまざまな治療群の効果は、肝臓あたりの脂質のミリグラムとして表される総肝臓脂質含有量の有意な減少と関連していました（図9a）。 総肝臓脂質含有量は、通常の固形飼料を与えられたマウスと比較して、HFを与えられたマウスで有意に高かった（3。0-倍高い、p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">
図9bおよびcに示すように、肝臓の総コレステロール（TC）および肝臓のトリグリセリド（TG）を測定すると、HFを与えたマウスは、通常の固形飼料を与えたマウスと比較して、両方の脂質のレベルが上昇していることがわかりました（つまり、3。{{4}）。 } TCの倍増、p<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">
肝臓の炎症の評価。 マクロファージ（Mac -3）の存在を染色するために免疫組織化学的染色を行った（図10a）。 肝臓切片の免疫組織化学的分析により、高脂肪食マウスと通常の固形飼料飼育マウスの両方にMac -3が存在することが明らかになりました（茶色の着色）。 この炎症は、シンバスタチンで治療された動物でさらに増加したが、そのような増加は統計的有意性に達しなかった。 興味深いことに、シンバスタチンの併用治療の有無にかかわらず、HCE治療は、高脂肪食マウスの炎症を有意に軽減しました。 すべての治療群を比較すると、シンバスタチン併用治療の有無にかかわらず、HCE治療もシンバスタチン治療群と比較して有意に低い炎症を示しました（p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">
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