パートⅠ：炎症過程は、腎臓の損傷につながる有足細胞におけるWT1の発現と局在化を調節します
Mar 23, 2022
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MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ、PABLO ZAPATA-BENAVIDES＆ETAL。
序章
ウィルムス腫瘍-1遺伝子（WTI）は、有足細胞の生存と非効率的な腎濾過に関与する主要な遺伝子の1つです。 炎症過程は肝臓失敗これは、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）。 WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）は、エクソン5（17AA±）とエクソン9（KTS±）（1）の選択的スプライシングによって4つの主要なアイソフォームを持つジンクフィンガータンパク質である転写因子をコードします。 KTSアイソフォームはDNAに対してより高い親和性を持ち、KTSプラスは細胞質内のスプライセオソームタンパク質と共局在します（2、3）。WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）胚発生、主に性腺および肝臓発達; 成人では、その発現は、肝臓（有足細胞）そして、ポドカリキシン、ネフリン（NPHS1）、ペアボックス転写因子（4-6）などのいくつかの遺伝子の維持と調節に不可欠です。 WT1発現の変異または低下は、ネフリンおよびポドカリキシンの発現低下につながる可能性があり、糸球体硬化症などの腎症に関連しています（5、7-10）。
ネフローゼ症候群は小児期に最も頻度の高いネフローゼ症候群であり、その組織学的分類は最小限のネフローゼ変化、巣状分節性糸球体硬化症、およびびまん性メサンギウム硬化症であり、ステロイドに対する反応の程度に応じて、感受性および耐性ネフローゼ症候群として分類されます（11） 。
WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）は、ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の子供によく報告されています。これは、ネフローゼ症候群の患者の10-15パーセントに影響を与えるまれな疾患です（12,13）。 散発性ネフローゼ症候群の全小児の約80％がステロイド治療に反応しますが、WT1には変異は見られませんでした（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）大規模コホート研究（14）で、ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の発現が減少し、ステロイド感受性ネフローゼ症候群の患者ではそれほどではありません（15）。リポ多糖（LPS）によって誘発される全身性炎症のマウスモデルでは、 LPS投与の24時間後、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）は細胞質に移行し、足細胞のスリット膜を維持するための重要な成分であり、正しい糸球体濾過に不可欠なネフリンの発現の減少と関連しており、それによってWT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）ネフリン遺伝子をアップレギュレートするための転写因子として機能します（16）。
腫瘍壊死因子-α（TNFa）で治療されたA459肺がん細胞では、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）タンパク質から細胞質への変化が観察されており、炎症性刺激がその細胞内局在と転写機能を変化させる可能性があることを示唆しています（17）。 リン酸化は、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）核転座への干渉、およびWT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）ジンクフィンガードメインにおけるSer-365およびSer-393のcAMP依存性プロテインキナーゼ媒介リン酸化によるDNA結合（18）（19）。
敗血症は全身性炎症反応の結果であり、感染によって誘発される炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの放出を特徴とします。 急性腎障害は、急性炎症の存在下で重症患者によく見られ、慢性腎障害の進行と強い関連があります（20,21）。 炎症が以下を含むさまざまな臓器への損傷に重要な役割を果たしているという証拠があります腎臓（22）。この研究では、WT1（の調節に対する炎症性サイトカインの影響を評価しました。ウィルムス腫瘍-1遺伝子）発現およびその細胞質への転座。
カンカニクジュヨウの利点：antit-cncerおよびanti-腫瘍
材料および方法
動物モデル。 雌のBALB/cマウス（8-10週齢）は、ハーランドメキシコ（メキシコシティ、メキシコ）から入手しました。 マウスは、制御された室温、湿度、および光（12 / 12時間の明暗サイクル）の下で、水および食物を自由に摂取させてケージに入れました。大腸菌O111：B4（Sigma Aldrich、トルカ、メキシコシティ、メキシコ）のLPSおよび単一のLPSの注射は、腹腔内に8 mg / kgの用量で投与されました（16）。 生理食塩水は、対照の未処理のマウスに使用された。 マウスは、12、24、36、48および72時間に200mg / kgのペントバルビタールナトリウム溶液の腹腔内注射で犠牲にされ、各時点でn =5、その後肝臓組織と血液を採取しました。 動物を犠牲にする前に尿を集めた。
のための2匹のマウス肝臓外植片に2日ごとに1mg/ kgのLPSを注射して、慢性を誘発した肝臓 けがポジティブコントロールとして（21）。 すべての実験は、生物科学部（CEIBA -2016-034）の施設内動物管理使用委員会からの事前の承認に従って実施されました。
肝臓外植片。 から肝臓BALB / cマウスの場合、厚さ250-300 umの組織スライスをKrumdieck組織スライサー（Alabama Research and Development、Munford、AL、USA）を使用して、クレブスヘンセライト重炭酸塩（KB）のバッファーを一定流量で4度で調製しました。それは5パーセントのCO2で曝気されました。 スライスをKBバッファーに4度で回収しました。肝臓外植片を、10％ウシ胎児血清および5％抗生物質-抗真菌剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地/ F12培地を含む12-ウェルプレートにプレーティングし、37℃、5％CO、25℃で撹拌しました。 rpm。 外植片を10ng/ mlのTNFa（R＆D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、米国）、20 ng / mlのインターロイキン1（IL1; R＆D Systems）、および100 ng / mlのLPSで処理し、6、12で分析しました。そして24時間後。
尿タンパク質。 上記の各時点で尿サンプルを収集した。 タンパク質濃度はDCProteinAssayキット（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して測定し、アルブミン尿はドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してウシ血清アルブミンのバンドサイズに基づいて評価しました（16）。
炎症性サイトカイン。 IL6、IL1、およびTNFaのレベルは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定キット（PeproTech、メキシコシティ、メキシコ）を使用して測定しました。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）。 全RNAは、Trizolw Reagent（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を製造元の指示に従って使用して、腎臓組織から単離しました。 一本鎖cDNAは、High Capacity cDNA逆転写キット（Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）を製造元の指示に従って使用して、逆転写により合成しました。 リアルタイムPCRは、7500リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）とTaqMan遺伝子発現アッセイを使用して実行されました。 比較リアルタイムPCRアッセイは、各サンプルに対して3回実行されました。 WT1のプライマー（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）転送されました：5- TCTGCGG AGCCCAATACAG -3'; 逆：5- CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA -3';およびプローブFAM：5- CACCGTGCGTGTGTATT -3' NFQ;プロトコルは95度で10分間、40サイクルで94度で実行されました30秒間、64℃で30秒間。 WT1（の相対式ウィルムス腫瘍-1遺伝子）遺伝子は、式2- AACT（23）を使用して計算され、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子（Applied Biosystems）が正規化に使用されています。
腎臓病のシスタンチェ抽出物を治療する
ネフリンmRNAの発現は、3 ugのcDNAと次のプライマーを使用して測定しました。順方向：5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT -3'および逆方向：5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG -3'、94度で30秒間、60 30秒間の度と30サイクルの72度（372 bp）（16）GAPDHの発現に使用したプライマーは、フォワード：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'、リバース：5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA -3'、次の反応条件で：40秒で94度、30秒で60度、35サイクル（452 bp）で40秒で72度。WT1の発現（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）：順方向5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG -3'、逆方向5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA -3' 94度で40秒間、64度で30秒間、72度で30秒間35サイクル（160 bp）。 WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）アイソフォームKTS±および17AA±（17AAプラス/-を検出するためのF2-R2プライマーおよびKTSプラス/-スプライシングアイソフォームを検出するためのF3-R3）は、王子らによる従来のPCRによって実行されました。 .al。（24）。 -アクチンの発現の決定は、Lauxetal。に従って実施された。 （25）。 生成物は、KTS±アイソフォームには10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、17AA±アイソフォームには2％アガロースゲルを使用して観察しました。
免疫蛍光。 The腎臓LPS処理マウスとコントロールから10％ホルマリンで固定され、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、免疫組織化学、および免疫蛍光抗体法のために処理されました。
WT1（の場所を決定するにはウィルムス腫瘍-1遺伝子）LPSで処理されたマウスでは、顕微鏡スライドにマウントされた腎臓組織の厚さのある切片が使用されました。 標本を脱ロウし、Triton X -100 [リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の1％クエン酸ナトリウムを含む0.1％Triton]で透過処理し、PBSで3回洗浄しました。 組織をPBS中の20％ウシ胎児血清で30分間ブロックし、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）sc {{0}}（F -6）（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）PBS中の10％ウシ胎児血清で1：100に希釈。 PBSで洗浄した後、ヤギ抗マウスIgG Texas Red sc -2979（Santa Cruz Biotechnology）で染色することにより、結合した抗体の存在を確認しました。 スライドを4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールで対比染色しました。 最後に、スライドをマウントし、40倍の水浸対物レンズとFluoview 4.0aソフトウェア（オリンパス、東京、日本）を備えたオリンパスBX61W1共焦点顕微鏡を使用して定性的に検査しました。
免疫組織化学。 リン酸化（p）-WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）LPS処理マウスの有足細胞では、p-WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）セリン393、sc -12933および363、sc -12934- R（Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX、USA）を使用しました。腎臓組織の4-μmセクションを含むスライドを脱ロウし、透過処理しました。免疫組織化学は、Universal Quick Kit（Vector Laboratories、Burlingame、CA、USA）を製造元のプロトコルに従って使用して実行しました。スライドは、100倍の油浸対物レンズ（Primo Star、Carl Zeiss、GmbH、Germany）を備えた光学顕微鏡を使用して検査しました。 。
ウエスタンブロット法。 全タンパク質を200ulの溶解バッファー（1％Triton、150 mM NaCl、25 mM Tris-HCl pH 7.6）で分離し、DC Protein Assayキット（Bio-Rad）を使用して濃度を測定しました。 タンパク質（50 ug）は、12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分離し、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）[F6]抗体sc -7585（サンタクルーズバイオテクノロジー）。 サンプルは、抗GAPDH（AB2302; Sigma、San Louis、MO、USA）を使用して正規化されました。 タンパク質は、Lumi-Lightウエスタンブロッティングシステムsc -2048（Santa CruzBiotechnology）を使用して視覚化されました。
cistancheの利点：腎臓を保護する
結果
の誘導肝臓ダメージLPSによるBALB/cマウスでは、有足細胞の損傷がタンパク尿の増加と関連していることは十分に確立されています。 尿中のアルブミンと総タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とDCタンパク質アッセイキット（Bio-Rad）によって測定されました。 LPS治療の12時間後に尿中アルブミンの有意な増加（p=0。001）が観察され、対照（15.53）と比較して24時間（215.87±1.41ug / ml）で最大の増加が見られました。 ±5.0ug/ml）（図1A）。総尿中タンパク質濃度は36時間でピークに達することが観察され（26.02±2.43mg / ml）、対照と比較して有意に高かった（p =0。01）図1に示すように、LPSによって誘発された腎損傷は組織学によって分析されました。治療の24時間後、限局性糸球体腎炎が腎臓組織で観察され、36時間で最大の損傷が見られ、糸球体のサイズが大きくなり、メサンギウムが生じました。図1Cに示すように、48時間後、72時間まで糸球体の段階的な回復が観察されました。
図1.腎臓に対する全身性炎症の影響。リポ多糖で治療されたマウスの腎臓損傷のマーカーとしての尿中アルブミン（A）および尿中タンパク質（B）の濃度。 C：リポ多糖注射後の異なる時間（12、24、36、48、および72時間）でのマウスの腎組織学（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）の代表的な画像、慢性炎症のモデルの比較、倍率100倍。大幅に異なる：* n<><0,0]><0.00>
LPS処理マウスの血清中の炎症誘発性サイトカインTNFaおよびIL1の産生。 腎臓の損傷がLPSによって誘発されたことを確認するために、炎症性サイトカインのレベルを酵素免疫測定法によって測定しました。 TNFaおよびI1の増加は、12時間後（3.6±0。9 ng / ml、11.9±5ng / ml）および最大36時間後（4.44±0。1 ng / ml、18）に観察されました。 LPSによる治療の±0。9ng/ml）、その後減少し始めます（図2AおよびB）。 IL6の発現は、治療後12時間（49.5 ng / ml）および36時間（23.5 ng / ml）で増加し、対照よりも有意に高かった（図2C）。
図2.炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子-α（TNFa）のレベルの時間経過。（A）、リポ多糖の腹腔内投与後のマウスからの血清中のインターロイキン1（LL1）（B）、およびIL6（C）。 有意差：* p0以下。05、**p0。01以下および***p0.001以下。
LPS処理マウスの腎臓組織におけるWTI遺伝子発現。 WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）は炎症過程によって調節され、これは腎臓への影響、WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）遺伝子は、炎症過程のさまざまな時点で全身性炎症を起こしたマウスの腎臓サンプルで決定されました。 WT1（ウィルムス腫瘍-1遺伝子）mRNAは、コントロールと比較して常に分析され、図3Aに示すように、全身性炎症の誘発後36時間で最低の相対発現、12時間で最高でした。さらに、LPによる治療かどうかを決定しました。 PCRによるWTIのアイソフォームのエキソン5（17AA±）およびKTS±の発現の誘導された修飾。 データは、LPSによって誘発された全身性炎症過程全体を通して治療なしの対照群と同じ行動が観察されたため、これらのアイソフォームの発現の規制緩和がなかったことを示しました（図3B）。 WT1タンパク質は、炎症過程全体で減少し、治療後36時間でわずかに回復することがウエスタンブロッティングで示されましたが、WT1の量は未治療のコントロールよりも少なかった（図3CおよびD）。
図3.全身性炎症のあるマウスの腎臓組織におけるウィルムス腫瘍I（WT1）遺伝子発現に対するリポ多糖（LPS）の影響。A：WTI mRNAの相対的発現B：WT1のアイソフォームKTS±および17IAA±の相対的発現C：LPS処理後のイムノブロッティングによるWTIタンパク質のレベルおよびD：WT1のイムノブロッティングの密度0以下。01および***p0.001以下
LPS処理マウスの腎生検におけるWTIのリン酸化と局在化。 WTIタンパク質の翻訳後調節における重要なイベントは、アミノ酸393のリン酸化であり、これはタンパク質の細胞質への置換を誘導します。 LPSで処理されたマウスからの腎臓サンプルにおけるWT1のリン酸化および局在化が決定された。 WT1のリン酸化は組織化学によって分析され、全身性炎症の誘発後12時間から始まり、72時間まで維持される腎組織の切片の細胞の細胞質にリン酸化WT1が存在することを示しています。WT1はアミノ酸393および363でリン酸化されました。図4Aに示すように。 WT1タンパク質の位置は免疫蛍光によって分析されました。 LPS処理マウスの腎臓サンプルの有足細胞におけるWT1の位置は主に細胞質でしたが、対照サンプルの有足細胞では位置が不明でした（図4B）。
図4.リポ多糖処理マウスの腎臓サンプルにおけるウィルムス腫瘍I（WTI）のリン酸化と局在。A：リン酸化（p）-WTIの免疫組織化学的染色は、LPS投与の12時間後にセリン393および363でリン酸化の増加を示しています（光学顕微鏡で100倍に拡大）。 B：腎臓での免疫蛍光によるWTIの局在。 リポ多糖投与の36時間後のWT1（四角）のわずかな核局在化を示す例（共焦点顕微鏡で40倍の倍率）。DAP1：4、6-ディアミジノ-2-フェニルインドール。
LPS処理マウスの腎臓におけるWTIおよびネフリンの発現の調節。 細胞内のWT1の位置は、その生物学的活性に影響を与えます。 細胞質WT1は転写活性を発揮しないことが報告されています。 このため、WT1とネフリンmRNAの発現は、LPSで処理されたマウスの腎臓サンプルでPCRによって分析されました（図5A）。PCRは、ネフリンmRNAが24時間から48時間に減少し、72時間で増加することを示しました（図5B）。 ）、WTI mRNAの発現は12時間で増加し、その後、炎症と腎臓の損傷の臨界時間（24時間と36時間）の間に減少しました（図5B）。
図5.ネフリン（NPHS1）およびウィルムス腫瘍1（WT1）mRNA発現の分析。A：mRNA発現の分析では、NPHSIとWTIは、リポ多糖を使用した全身性炎症の誘発後24、36、および48時間で減少しました。 B：デンシトメトリーによってAに示され、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼへの発現によって正規化されたバンドの定量化。
TNFaおよびIL1で処理された腎臓外植片は、WTIおよびネフリンの発現を調節します。 サイトカインがWT1の発現を調節するかどうかを決定するために、腎外植片を培養し、サイトカインTNFaおよびIL1で6、12、および24時間処理して、PCRによってWT1およびネフリンの発現を分析しました。 TNFaおよびILlbで処理された腎外植片では、24時間でネフリンmRNA発現が減少し、WTI mRNA発現が増加しました（図6）。
図6腎外植片におけるネフリン（NPHS1）およびウィルムス腫瘍1（WT1）mRNAの発現の分析。A：10 ng / mlの腫瘍壊死因子-α（TNF）および20 nglmlのインターロイキン16（IL16）に曝露された腎外植片における異なる時間でのNPHSiおよびWTIのmRNA発現レベルB：デンシトメトリー分析を使用して得られた相対的発現シグナル産物。 バンドは、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼへの正規化によって定量化されました。
蛍光抗体法による腎外植片におけるWTIの局在。 TNFaとILがWT1タンパク質の局在の変化に関与しているかどうかを判断するために、マウスの腎臓外植片をTNFaとL1およびLPSで24時間処理しました。 ILlbおよびLPSで処理された外植片では、WT1タンパク質の核/細胞質局在が明らかであり、TNFaで処理された外植片では、WT1タンパク質の細胞質局在が観察されました。 一方、未処理のコントロールでは、主にWT1の核局在化が観察されました（図7）。
図7.処理された腎臓外植片からのポドサイトにおけるRedTX（WT1）および4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（核）を使用した免疫蛍光によるウィルムス腫瘍1（WTI）タンパク質の局在l 0 ng / mlの腫瘍壊死因子-α（TNFa）、20 ng / mlのインターロイキン16（L1B）、およびリポ多糖（LPS）を含む。IL1およびLPS処理下でのWTIの核/細胞質局在化と比較して、TNFaで処理された外植片で示されるWTasの核局在化の減少。 倍率、40倍。