パート2エキナコシドは視床下部のアンドロゲン受容体を標的とすることによりラットの精子量を増加させる
Mar 09, 2022
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討論
民族薬理学的記録と私たちの以前の研究13はCistanche カンカニクジュヨウ 抽出物は効果的に性ホルモンレベルを増加させ、精子の質を改善しました。 の主要な化合物の1つとしてのECHCistancheカンカニクジュヨウ19,20は、精子数を増やし、LHとTの分泌を増やすことができます（図1）。 この研究では、ECHが精巣ではなく視床下部に分布していることを示し、精巣に対するECHの間接的な影響を示唆しています。 実際、ECHは視床下部AR活性、核へのAR転座、およびHPG軸関連遺伝子発現を直接阻害し、BPA誘発性生殖障害に対する保護も提供しました。
ヒトのゴナドトロピン産生の研究では、性ホルモンレベルはHPG軸と負のフィードバックループによって厳密に調節されています21。 すなわち、T分泌は、下垂体および視床下部への負のアンドロゲンフィードバックの欠如に応答して、血中LHレベルの一貫した持続的な増加に応答して著しく増加します。 この研究では、ECHは脳と下垂体のLHの分泌と精巣でのテストステロンの産生、脳と下垂体のLHRとGnrhrのmRNAレベルを増加させ（図1と図4）、ECHがHPG軸の負のフィードバックに影響を与える可能性があることを示唆しています。 当然のことながら、AR自体がTおよびLHレベルのフィードバック調節において重要な役割を果たしています22,23。 男性のHPG軸パラダイムは、視床下部と下垂体の両方のレベルで負のフィードバック抑制を提供するテストステロンに集中しています24,25。 以前の研究では、Foxg 1- Creを使用して下垂体の目的の遺伝子を除去しましたが、視床下部ではなく、2つの領域の相対的な重要性を決定しました。 結果は、雄マウスの下垂体におけるARシグナル伝達が、LH分泌のテストステロン依存性調節に関して不可欠であることを示した26。 このため、さらなる研究のために視床下部ARに焦点を当てることを選択しました。
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ステロイド核ホルモン受容体として、ARの活性はステロイドリガンドTによって調節され、その結合が核内移行とAR27の転写調節機能を開始します。 この研究では、ECH治療が視床下部の細胞質から核へのAR転座を阻害することを示しました（図。3）。 さらに、PK研究は、ECHが精巣ではなく視床下部に著しく浸透できることを示し、血液精巣関門ではなく、おそらくエンドサイトーシスを介して、より多くのECHが血液脳関門を通過することを示唆しています。 さらに、間接ELISAによって、ECHとARの結合能力が実証され、ECHがARに直接結合できることが示唆されました。 これは、ECHの推定結合部位がARポケットのMet-894とVal-713に存在することを示した分子ドッキングアッセイの結果によってさらに裏付けられました（図5D）。 これは、ARが負のフィードループの調節に関与し、脳内のAR-T相互作用の減少がLH分泌の増加をもたらすという他の発見を支持します23,28,29。
ステロイド産生は、ステロイド産生タンパク質（StAR）30と、CYP11A1、CYP17A1、3 -ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（HSD3）、17 -ヒドロキシステロイドなどのステロイド産生酵素が関与する精子形成の発達に不可欠なプロセスです。コレステロールをテストステロンに変換するデヒドロゲナーゼ（HSD17）31。 StAR mRNAの発現は変化しなかったが、これらの酵素をコードする遺伝子のmRNAレベルはECH処理で有意に増加したことを示した。 これは、ECHがミトコンドリアの内膜へのコレステロールの移動に影響を与えなかったことを示唆していますが、ECHはコレステロールのテストステロンへの変換を促進する役割を果たしている可能性があります。 次に、ECH治療は、テストステロンの合成と分泌を増強することにより、精子数を大幅に増加させるという結論を導き出すことができます。
精子損傷に対するECHの保護効果を調査するために、典型的な外因性内分泌かく乱物質であるビスフェノールA（BPA）を、マウスの男性の生殖障害のモデルとして使用しました32。 ECH治療は、BPAによって減少した精子数、精子運動性、TおよびLHレベルを効果的に回復し（図6A、B）、ECHが精子損傷を軽減できることを示唆しています。
ホルモン補充療法のために人工的に合成された化学物質と比較して、ECHはHPG軸の負のフィードバックに影響を及ぼし、それによってLH、T、および精子の質の分泌を増加させる天然の非ホルモン化合物です。 この機械的な経路は男性の生殖器系を保護する可能性があるため、ECHは潜在的な自然の生殖保護剤と見なすことができます。 しかし、ホルモンの規制は複雑であり、しばしば全身的な影響をもたらします。 図7に示すように、ECHはTおよびLH分泌を増加させ、AR活性化を阻害しました。これは、骨粗鬆症33や男性のうつ病34など、他の健康または疾患関連経路にも影響を与える可能性があるため、ECHの包括的な効果はさらに大きくなるはずです。調査した。 まとめると、我々の結果は、ECHが視床下部のARに結合し、細胞質から核へのARの移動を阻害することを示しています。 私たちのデータは、ECHがアミノ酸Met-894とVal-713でARポケットの部位に結合することを示唆しています。 これは、LH分泌を促進することによってホルモンレベルのバランスをとる全身反応としてのTおよびARレベルの増加と、それに続くT産生および精子数の増加を説明している可能性があります（図8）。
エキナコシドのcistanche抗酸化することができます
メソッド倫理ステートメント。
この研究は、科学技術省（北京、中国）によって確立された実験動物のためのガイドラインに厳密に準拠して実施されました。 すべての実験プロトコルは、Anyang InstituteofTechnologyの倫理委員会によってレビューおよび承認されました。 実験動物。 4週齢の近交系昆明マウス（22 g〜25 g）は、第4軍医科大学（中国、西安）の動物センターから入手しました。 動物は、22度±2度、湿度70％±4％、12時間の明暗サイクリング、飼料と水への自由なアクセスを備えた管理された条件下で飼育されました。 6
実験的治療。
実験1.マウスをランダムに6つのグループに分け、各グループに7匹のマウスを入れました（n =7）。 ECH（CAS：82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co.、Ltd、Sichuan、China）は胃内チューブを使用して投与され、プロピオン酸テストステロン（TP、CAS：57-85-2; KingYork、Tianjin、China）は次の実験デザインに従って、1日1回14日間筋肉内注射によって与えられます：対照群：通常の生理食塩水（1 0 mL / kg）、ECH（L）群（5mg / kg）、ECH（M）群（ 20mg / kg）、ECH（H）グループ（80mg / kg）、TP（15mg / kg）およびエンザルタミド（AR阻害剤、1日1回14日間; 20mg / kg; CAS：915087-33-1;アラジン、 中国、上海）。 2週間の治療後、ホルモンレベルの分析のために血液サンプルを収集するために、マウスをジエチルエーテルで麻酔しました。 次に、マウスを解剖して、視床下部、脳と下垂体、精巣、および精巣上体尾部を分離した。 精巣上体尾部のサンプルは、精子の質を評価するために5％BSAを含む通常の生理食塩水に入れられ、視床下部、脳と下垂体、および精巣は液体窒素で凍結され、さらなる調査のために-80度で保存されました。 実験2.マウスをランダムに10のグループに分け、グループごとに5匹の動物を与えました。 ECH（20mg / kg）を経口投与し、各群のマウスを投与後0.5時間、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、4時間、6時間、9時間、12時間の時点でジエチルエーテルで麻酔した。サンプルコレクション。 血漿を採取し、心臓を露出させた。 左心室への通常の生理食塩水の灌流は、肝臓と肺が白くなるまで注入装置によって行われた。 ECHの組織濃度を決定するために、10個の視床下部と精巣を収集しました。実験3.マウスをランダムに4つのグループに分け、各グループに7つずつ分けました。 ECHおよびBPA（CAS：80-05-7;アラジン、上海、中国）は、以下の実験設計に従って、胃内チューブを使用して1日1回6週間投与されました：正常群（コーン油、10 mL / kg、体重/ d）、モデルグループ：BPAグループ（BPA 200 mg / kg、bw / d、コーン油）、および実験グループ：BPAとECHグループ（BPA 200mg / kg; ECH 20mg / kg）。 治療の42日後、マウスをジエチルエーテルで麻酔し、ホルモンレベル分析のために血液サンプルを収集した。 精巣上体と精巣上体尾部を分離して採取した。 精巣上体尾部は精子の質の評価に使用され、精巣は液体窒素で凍結され、さらなる調査のために-80度で保存されました。
決定 の 精子 品質。 精子 サスペンション 準備。 Cauda精巣上体を、5％BSAを含む5 mLの生理食塩水に細かく切り刻み、37度で5分間インキュベートして、内容物を培地に拡散させました。
精子数：横井（2003）の方法に従い、希釈した精子懸濁液（1:10; v /v;精子懸濁液/10％メタノール）を血球計算盤の各計数チャンバーに移し、5分間静置した。最小で、次に光学顕微鏡（Nikon、Instruments Inc.、日本）の下でX200倍率でカウントした。
精子の生存率：合計20μLの精子懸濁液を等量のエオシン-ニグロシン染色液と2分間混合しました。 染色されていない精子を光学顕微鏡下で200倍の倍率で数えた。
精子の運動性：合計10μLの精子懸濁液をスライドガラス上に置き、200倍の倍率の光学顕微鏡下で可動または不動として記録した。
決定 の ホルモン レベル。 テストステロン（T）とLHのレベルは、ラジオイムノアッセイ（RIA）キット（北京中英国生物工学研究所、北京、中国）を使用して、血清、脳と下垂体、および精巣ホモジネートで定量化されました。 簡単に説明すると、抗テストステロンまたは抗LH IgG抗体（100μL）および125- I結合抗マウス抗体をサンプルまたは標準（100μL）に添加し、ロッカー上で4度で一晩混合しました。 PBS-Tween 20（500μL）で3回洗浄した後、混合物を4度で15分間遠心分離（3500 rpm / min）しました。 沈殿物のCPM値は、ラジオイムノアッセイ装置（Beijing Sino-western Technology Co. Ltd、CN202M / KZ4GC -1200、北京、中国）によって評価され、TおよびLHの濃度は標準の式に従って計算されました。曲線。 TとLHの変動係数は、サンプルグループで2.8％と3.2％、標準グループでそれぞれ2.1％と2.8％です。
決定 の 遺伝子 式 に リアルタイム 定量的 PCR。 RNA Simple Total RNAキット（Tiangen、北京、中国）を使用して、凍結精巣および脳と下垂体組織からトータルRNAを単離しました。 2×SYBRGreenI PCR Master Mix（Vazyme、Nanjing、China）を使用して、cDNAの増幅のために定量的リアルタイムPCR（q RT-PCR）を実施しました。 PCR手順は、95度で30秒間、続いて95度で15秒間、58度で30秒間、72度で30秒間の35サイクルで構成されていました。 PCR産物の融解曲線分析を行い、プライマーの特異性と産物の純度を確認しました。 単一の製品の生産を確認するために、各プレートに対して解離曲線を実行した。 各mRNAの相対的な存在量を計算しました。 研究に使用したPCRプライマーを表2に示します。
西部 しみ。 AR発現解析では、細胞質および核タンパク質抽出キット（Beyotime、南京、中国）を製造元の指示に従って使用して、細胞質および核タンパク質の抽出と単離を行いました。 細胞質および核タンパク質の濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイキット（Beyotime、江蘇省、中国）を使用して評価しました。 タンパク質サンプル（80 ug）を12％および5％のSDS-PAGEゲルで泳動し、PVDFメンブレンに転写しました。 ブロッキング後、膜を抗AR IgG抗体（1：1、000; Bioss;北京中国）およびマウスポリクローナル抗GAPDH抗体（1：1、000; Wuhan Boster）とともにインキュベートしました。生物学的
Technology、Wuhan、China）またはマウスポリクローナル抗ラミンb1抗体を2時間。 メンブレンをTBSTで3回洗浄し、HRP標識ウサギ抗マウスIgG抗体（1：5、000; Bioss;北京中国）とインキュベートしました。 信号は、ChemiDoc Imaging System（Tanon -3、500、上海、中国）を使用して視覚化されました。
ハイパフォーマンス液体 クロマトグラフィー （HPLC） アッセイ。 血液はヘパリン処理されたガラス管に集められた。 血漿は、6、000 rpmで10分間の即時遠心分離によって分離され、さらなる実験のために-20度で保存されました。 各時点からの視床下部および精巣サンプルをプールし、メタノールでホモジナイズした。 10、000 rpm、4度で10分間遠心分離した後、上澄みをNで濃縮しました。2残留物を50μLのメタノールに溶解し、0.45μmフィルターでろ過しました。 10μLのサンプルろ過液を分析のためにHPLCシステムに注入しました。
標準曲線は、50、100、250、500、および750 ng / mLのECH（Chengdu Pufei De Biotech Co.、Ltd、Sichuan、China）を含むサンプルで構成されています。 したがって、75 ng / mL（低）、150 ng / mL（中）、および300 ng / mL（高）のECHをスパイクした血漿品質管理サンプルを準備して、メソッドの精度と精度を測定しました。
クロマトグラフィーは、UV検出器（L -2400、日立、日本）に接続されたHPLCシステム（D2 {{1 0}} 0 0 Eliteシリーズ、日立、日本）を使用して実行されました。 分離は、25度に保たれたThermo-C18（250mm×4.6mm id、4.6μm粒子）カラムで行いました。 移動相は、0.04パーセントのトリメチルアミン（成分A）とメタノール（成分B）を含む0.1パーセントのリン酸から調製されたグラジエントでした。 線形勾配は次のとおりです。0-2分で70〜90パーセントのA、2〜6分で60〜70パーセントのA、6〜8分で55〜60パーセントのB、その後90パーセントのAに戻るすぐに8分。 流量は0.8mL/分でした。 UV検出器は332nmで動作しました。 ピーク面積は分析測定として評価されました。
薬物動態 研究 の マウス。 視床下部および精巣へのECHの浸透は、Drug and Statisticsソフトウェア（Drug and Statistics、中国の数学的薬理学専門委員会）を使用した薬物動態分析にかけられました。 薬物動態パラメータは、統計的モーメント理論に基づく非コンパートメント法を使用して決定されました。 ピーク定数までの時間を含む予備的な薬物動態パラメータ（T最大）、ピーク濃度（C最大）、除去率定数（Ke）、消失半減期（T0.5）、曲線の下の領域（AUC0–12）、見かけの分布容積（Vc）、およびクリアランス（CL）は、さらなる分析のために取得されました。 脳/血漿比はAUCに基づいて計算されました0-t血漿と脳の値。
ECH-卵白アルブミン （ECH-OVA） 合成 と 身元。 合計9.8mgのECHと1。0mgの無水ブタンジオールを2mLのピリジンに溶解し、室温で撹拌しながら12時間混合しました。 混合物をＮにより濃縮した。2そして残留物を10.8mgのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および19.3 mgのジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）および4mLに溶解N, N-室温で撹拌しながら12時間ジメチルホルムアミド（DMF）。 2、000 gで4度で5分間遠心分離した後、上澄みを14.4 mgのオボアルブミン（OVA）を溶解した5mLのPBSに加えました。 新しい混合物を4度で24時間撹拌した。 次に、反応溶液をPBSに対して3日間透析した。 ECH-OVAの存在は、190〜400 nmの範囲の波長でのUVスペクトル（Shimadzu Scientifc Instruments、Inc.コロンビア、メリーランド州USA）、およびPAGEの変性によって確認されました。
間接 ELISA （iELISA）。 マイクロタイタープレートをECH-OVA（2 ug /100μL）でコーティングし、4度で一晩インキュベートしました。 プレートをPBSTで3回およびPBSで2回洗浄し、5％PBSM（5％スキムミルクを含むPBS）を添加して、37度で2時間非結合部位をブロックしました。 プレートをPBSTおよびPBSで洗浄した後、ウェルを4つのグループに分けました。 実験群、1ugAR総タンパク質/100μL; 陽性群、ウサギ抗OVA抗体（1：1、000）; 陰性群、1ugのウシ血清アルブミン; そして、PBSを含むブランクグループ。 1.5時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、100μL/ウェルのウサギHRP結合IgG（1：1、000）を陽性グループに添加し、100μL/ウェルの抗ARを添加しました。 （1：1、000）他のグループに。 1.5時間のインキュベーション後、ウサギHRP結合IgG（1：5、000）希釈液をプレートに添加しました。 37度で1時間インキュベートした後、プレートをPBSTで3回およびPBSで2回洗浄した。 次に、TMBを添加し、暗所、室温、2MHで10分間インキュベートしました。2それで4反応を停止するために加えた。 450nmの波長で吸光度を読み取った。
分子 ドッキング。 Autodock vina 1.1.2を使用して、化合物ECHのヒトアンドロゲン受容体（AR）への結合モードを調査するために分子ドッキング研究を実施しました。 ARの3次元（3D）構造（PDB ID：2YHD）は、ProteinDataBankからダウンロードされました。 ECHの3D構造は、ChemBioDrawUltra14。0およびChemBio3DUltra14。0ソフトウェアによって取得されました。 AutoDockTools 1.5.6パッケージを使用して、ドッキング入力ファイルを生成しました。 ARの検索グリッドは、中心x：36.141、中心y：8.513、および中心z：として識別されました。
21.304、サイズx：15、サイズy：15、サイズz：15。網羅性の値は20に設定されました。Vinaドッキングでは、言及されていない場合はデフォルトのパラメーターが使用されました。 Vinaドッキングスコアによって判断された最高スコアのポーズが選択され、PyMOL1.7.6ソフトウェアを使用して視覚的に分析されました
データ 分析 と 統計 メソッド。 データは、統計ソフトウェアSPSS 19. 0（SPSS Inc.、Chicago、IL、USA）を使用して分析されました。 グループ間の比較には、一元配置分散分析を使用しました。 グループ間の有意差のテューキーの比較検定が決定されました。 結果は、Graph Pad Prismソフトウェアv.7（GraphPad Software、Inc、California、USA）を使用して、平均±標準偏差（SD）として表されました。
倫理 承認 と 同意 に 参加。 この研究の倫理的承認は、アニャン工科大学の倫理委員会から得られました。
エキナコシドのcistanche治療することができます腎臓病
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謝辞
この作品は、河南省の大学の科学技術革新人材プログラム（18HASTIT035）HASTIE、安陽工学院現代生物工学研究所の建設プログラム、および国際協力基地の主要建設プログラム（2015SD0018）によってサポートされていました。 S＆T、河南省、中国。
著者の貢献
Zhi-huiJiangとBoZhouは、調査の設計、調査の実施、データの分析、論文の執筆を行いました。 Xin-pingLiとGordonM.Kirbyは、調査を設計し、データを分析しました。 Xiao-YingZhangは研究を設計しました。
追加情報
競合する利益：著者は、競合する利益を宣言していません。
出版社の ノート： Springer Natureは、公開された地図および組織の提携における管轄権の主張に関して中立のままです。
