パート1：糖尿病とそれに関連する合併症に対するイソラムネチンの効果：invitroおよびinvivo研究のレビューと関与する分子経路の事後トランスクリプトーム分析

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概要: 糖尿病糖尿病、特に2型糖尿病（T2DM）は、世界的に大きな公衆衛生上の問題です。 DMは、インスリン分泌障害とインスリン抵抗性として知られる細胞のインスリン感受性による高レベルの血糖とインスリン血症を特徴としています。 T2DMは、腎症、神経障害、網膜症などの複数の重篤な合併症を引き起こし、さまざまな内部組織、特に膵臓、心臓、脂肪組織、肝臓、腎臓に細胞の酸化的損傷を引き起こします。 植物抽出物とその生物活性植物化学物質は、2型糖尿病とそれに関連する合併症の新しい治療的および予防的代替物として関心を集めています。 この点で、植物であるイソラムネチンフラボノイド、その潜在的な抗糖尿病効果について長い間研究されてきました。 このレビューでは、血糖値を下げ、酸化状態を改善し、炎症を軽減し、invitroおよびinvivo研究で報告された関与するシグナル伝達経路を調節することによって脂質代謝と脂肪細胞分化を調節することによる糖尿病関連障害の軽減への影響について説明します。 さらに、幹細胞ベースのツールを使用したイソラムネチンの生物活性の事後全ゲノムトランスクリプトーム分析が含まれています。

キーワード：イソラムネチン; ケルセチン; 生物活性; 糖尿病; 分子経路; マイクロアレイ

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1.はじめに

植物は古くから世界のほぼすべての大陸で伝統的な薬として使用されてきました。 それらの薬用使用の理由に関する科学的研究は、生物活性分子の探索につながりました。 極限環境条件で成長する極限環境微生物は、関心のある生物活性分子の優れた潜在的な供給源と見なされます。 実際、これらの環境上の制約は、機能不全の酸素代謝の原因であり、活性酸素種（ROS）を増加させることによって酸化ストレスを引き起こします[1,2]。 塩生植物などのいくつかの植物は強力です酸化防止剤これらの有害な化合物を排除するシステム。 関心のある生物活性分子の中には、フェノール化合物があります。 いくつかの研究では、実験室での制限条件の有無にかかわらず、ポリフェノールが豊富な植物を評価しています[3-10]。 いくつかの生物学的効果は、抗炎症作用や抗癌作用など、ポリフェノールが豊富な抽出物に起因します[11-13]。 他の研究では、イソラムネチンの抗酸化作用、抗菌作用[8、14-16]、ならびに抗肥満作用、抗糖尿病作用、および抗肝脂肪作用作用[17-19]が示されました。 これらのポリフェノールの中で、フラボノイド区別されます。 このグループには、フラボノールなどのいくつかのサブグループが含まれます。 イソラムネチンは、フラボノールの主要な化合物の1つです。 イソラムネチンは、フラボノイドのクラスからのモノメトキシフラボンまたはO-メチル化フラボノールです。 ですケルセチンメトキシ基が3'位のヒドロキシ基に置き換わっています。 Calendula officinalisLのイソラムネチン3-O- - d-グルコピラノシド、イソラムネチン3- O-ネオヘスペリドシド、イソラムネチン3- O-ルチノシドなど、いくつかのイソラムネチン誘導体が自然界に存在します。 。[20]。 イソラムネチンは、抗酸化作用[21]、抗癌作用[22]、抗菌作用[23]、抗ウイルス作用[24]、抗炎症作用および抗糖尿病作用[21、25-33]などの重要な生物学的特性を示します。

このレビューでは、最初の焦点は、イソラムネチンの植物化学的側面だけでなく、起源、化学構造、分離、抽出方法にあります。 次に、第2部では、血糖値の低下、酸化状態の改善、炎症の緩和、脂質代謝と脂肪細胞の分化の調節による糖尿病関連障害の軽減を通じて、このフラボノールの潜在的な抗糖尿病効果について説明します。 最後に、幹細胞ベースのツールでイソラムネチンの糖尿病関連の生物活性を調査するために、以前に公開された全ゲノムマイクロアレイデータの二次分析を実行しました。 また、この研究分野で使用されているinvitroおよびinvivoの研究を報告することにより、関与するシグナル伝達経路の調節に対するこの分子の影響を強調することも目指しています。 このレビューでは、イソラムネチンの抗糖尿病活性の特徴をケルセチンこれはイソラムネチンの代謝物であり、糖尿病の自然な治療における重要な参考資料であると考えられています。

2.特定のポリフェノールおよびフラボノイドの生物活性分子の概要

2.1。 植物の生物活性分子の起源としての酸化ストレス

いくつかの植物は、さまざまな環境条件（塩分、干ばつ、紫外線、重金属、極端な温度、栄養不足、大気汚染、および病原体の攻撃）にさらされる可能性があります。 これらの制約は、活性酸素種（ROS）を増加させることによって酸化ストレスを生成する酸素代謝の機能障害の原因です。 酸素分子（O2）は光合成生物で重要な役割を果たしています。 もともと、高等植物や藻類では、電子が関与するガス交換は、日中に二酸化炭素を捕獲して酸素を生成することにより、葉緑体で発生します。 このガス交換には電子が含まれます。 確かに、厳しい環境制約の場合、酸素の大部分は還元されず、したがって、葉緑体の適切な機能と電子の移動の不均衡のために、植物細胞からいくつかの細胞小器官でROSを生成する可能性があります[1,2]。 1]。 さらに、上記の環境制約の下で、ヒドロキシルラジカル（OH）、スーパーオキシドアニオンラジカル（O、-）、アルコキシルラジカルおよびペルオキシラジカル（それぞれRO：およびRO2）、過酸化水素（H2O2、 ）、次亜塩素酸塩ラジカル（-OCl）、一重項酸素（O2）、一酸化窒素ラジカル（NO）、およびその他の過酸化脂質（マロンジアルデヒドや4-ヒドロキシノネナールなど）[2,34,35]。 時々、ROSは植物の生理学的挙動、例えば種子の成長と発達、組織の発達、および分化の初期段階での細胞増殖から細胞伸長への移行の過程で細胞シグナル伝達に役割を果たす可能性があります[36]。 。 高レベルでは、これらの分子は、膜の脂質過酸化、タンパク質やDNAの変化、細胞死などの分子損傷を引き起こします[1,35,37]。 塩生植物などの一部の植物は、強力な抗酸化システムを通じてこれらの条件にうまく適応する能力を持っています。 塩生植物は、ポリフェノールなどの二次代謝産物の供給源であることが知られています[3-10]。 これらの著者は、過酷な条件下でポリフェノールが合成され、ストレスによる酸化的損傷から保護する上で重要な役割を果たすことを示しています。 これらのフェノール化合物の生合成、含有量、および活性は、植物におけるそれらの含有量および分布に影響を与えるいくつかの外因性（光、温度、塩分、および乾燥）および内因性（遺伝子型、器官、および発達段階）パラメーターの関数です。 8,38,39]。 たとえば、Pyracantha coccineaでは、フラバノン、フラボン、フラボノールなどのフラボノイドが、栄養期の新芽と生殖期の根にのみ存在します40]。 一方、何人かの著者は、これらのフェノール化合物が抗炎症作用や抗癌作用などの他の生物学的特性を持っていることを示しています[11-13]。 他の研究では、フェノール抽出物の抗酸化作用、抗菌作用[8、14-16]、および抗糖尿病作用[18,41,42]が示されました。

2.2。 天然抗酸化剤の分類

抗酸化システムは、これらの成分の性質に応じて、酵素化合物または非酵素化合物に分類できます。 1つ目は、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ（CAT）、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ、およびグルタチオンレダクターゼです[1、3542-44]。 これらの酵素に関連する遺伝子は、収穫後の貯蔵根の生理学的劣化中、浸透圧ストレスおよびアブシジン酸、ならびにXanthomonasaxonopodis感染に応答してそれらの重要性を明らかにしました[44]。 2番目のグループには、主にフェノール化合物、カロテノイド、ビタミン、浸透圧調節物質が含まれています[1]。 フェノール化合物は、1つまたは複数のベンゼン環の存在を特徴とし、塩基分子の複雑さ、ヒドロキシルの数と位置、および重合度が異なります。 これらの化合物は、フェノール酸（安息香酸および桂皮酸の誘導体）、フラボノイド（フラボノール、フラボノール、フラバノン、フラボン、アントシアニン）、およびタンニン（加水分解性タンニンおよびプロアントシアニジン）の3つの大きなグループに分類される二次代謝産物です。 これらの分子に加えて、スチルベン、リグナン、およびクマリンも区別されます[45]。

2.3。 フラボノイド、特にイソラムネチンの起源と生化学的構造

フェノール化合物は、植物に広く見られる二次代謝産物です。 これらの化合物は、1つまたは複数のヒドロキシル基（OH）を持つ芳香族環を持ち、単純なフェノール酸からタンニンなどの重合化合物までの範囲の分子を含みます。 フェノール化合物の合成は、いくつかの段階を経る複雑なプロセスです。 フェノール化合物は、2つの起源経路を持つ生物活性分子です。一方はシキミ酸で、もう一方はフェニルプロパノイド分子です。 イソラムネチンなどのフラボノイドの生合成は、これらの経路に基づいています。 実際、一方で、シキミ酸は、1つまたは複数のヒドロキシル官能基を有する1つまたは複数のベンゼン環（C6）を有するポリフェノールの基本骨格を与えます。 一方、フェニルアラニンの桂皮酸への縮合によって形成されるC 6- C3塩基の合成があります（図1）[46]。

より正確には、シキミ酸はいくつかの反応の基礎にあり、フェノール化合物の開始剤である芳香族アミノ酸の骨格を表しています。 最初のステップは、ホスホエノールピルビン酸とエリトロース4-リン酸の2つの分子の組み合わせで構成され、4つの反応の後、フェノール類の最初の骨格であるシキミ酸またはシキミ酸（CHoO）を形成します。 これは後で、2つのヒドロキシル基を持つフェノール類を特徴付ける最初の環を示します。 シキミ酸は、最初のアミノ酸であるフェニルアラニンで終わる6つの反応を起こします。 フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）と桂皮酸-4-ヒドロキシラーゼ（C4H）の2つの重要な酵素のおかげで、フェニルアラニンは連続して桂皮酸とp-クマル酸を形成します。このステップでは、PAL活性のレベルがフェノール化合物。 p-クマル酸分子はクマリン誘導体の起源です。 フェニルプロパノイド分子の合成経路は、補酵素A（CoA）のチオール機能の存在下でp-クマル酸を触媒する4-クマル酸CoAリガーゼ（4CL）と呼ばれる重要な酵素の存在によって特徴付けられます。 4-クマロイルCoA（C30Ha2N-O18P、S）に酸を加えます。 フラボノイドの芳香族A環は、マロニルCoA（-C6）の3つの分子の凝縮から提供されます。

続いて、4-クマロイルCoAがナリンゲニンカルコンを生成し、芳香族B環とカルコンの3C環（C 6- C 3-）との関連を説明しました。 カルコンは、2つのベンゼン環からなる15炭素の骨格に基づくすべてのフラボノイドの前駆体であるため、このトピックの重要な要素です。 その後、カルコンイソメラーゼ（CHI）の作用により、カルコンはナリンゲニン（フラバノンまたはトリヒドロキシフラボンとも呼ばれます）に変換されます。一方、アピゲニン、アカセチン、クリシン、ルテオリンなどのフラボンは、フラボンの存在下でナリンゲニンから合成されます。シンターゼ（FNS）。一方、2つの酵素の存在下でナリンゲニンから異なるフラボノールとコハク酸化合物が生成されます。 フラバノン3-ジオキシゲナーゼ（F3D）およびフラボノールシンターゼ（FS）。 フラボノール誘導体とは別に、ケンペロール、ミリセチン、ケルセチンなどの他の化合物も生成されます。 S-アデノシル-L-メチオニンからのメチル基転移により、イソラムネチンはフラボン3'-O-メチルトランスフェラーゼ（FMT）の存在下で生成されます[47,48]。 次に、イソラムネチンは、フラボノイドのクラスからのモノメトキシフラボンまたはO-メチル化フラボノールです。 3'位のヒドロキシ基がメトキシ基に置き換わったケルセチン（前駆体）です。 Calendula officinalisLのイソラムネチン3-O- - d-グルコピラノシド、イソラムネチン3- O-ネオヘスペリドシド、イソラムネチン3- O-ルチノシドなど、いくつかのイソラムネチン誘導体が自然界に存在します。 。[20]。

実際、フラボノイドはポリフェノールファミリーの最も重要なグループの1つと見なされています。 それらは、閉じたピラン環（C環）を形成する3つの炭素鎖によって結合された2つのベンゼン環（環AおよびB、図2を参照）を持つジフェニルプロパンタイプに基づく構造を持っています。 したがって、それらの構造はC 6- C3-C6と呼ばれます。 O-グリコシル化位置は、フラボン、イソフラボン、フラバノン、およびフラボノールではC7であり、フラボノールおよびアントシアニジンではC3です。 C-グリコシル化位置はフラボンのC6とC8です[49]。 さらに、フェノール化合物の抗酸化作用の重要性は、分子のヒドロキシル化の程度に関連しています。 フラボノイドには、イソフラボン、フラボン、フラバノン、およびそれらの配糖体とフラボノールが含まれます。イソラムネチンは、3'-メトキシケルセチンおよび3-メチルケルセチンとも呼ばれます[50]。 植物では、酵素であるUDP依存性グリコシルトランスフェラーゼがイソラムネチンのグリコシド型（イソラムネチン3- O-グルコシド）の原因です。 この酵素は、ヌクレオチド二リン酸糖、通常はウリジン二リン酸（UDP）糖を利用して、メチル基をサイクルに転移し、グリコシド機能をイソラムネチンと関連付けます[51]。

2.4。薬用植物に由来するイルソルハムネチンの単離と分析

薬用植物におけるイソラムネチンの分布は非常に広く、抽出と分析の方法はさまざまです。 イソラムネチン誘導体が特に求められています。 ヒドロキシル基とメチル基は、それらの特性評価に役立ちます。 イソラムネチンを抽出するためにいくつかの方法が使用されますが、その中には、ケモメトリックスアプローチ、酵素、および超臨界流体抽出（SFE-CO2）を使用した分画に基づくものがあります。 まず、分画を使用して、脂質を含むサンプルからすべての油性および親油性色素を除去することにより、抽出を簡素化できます。 脱脂したサンプルも、メタノールと水の混合液で浸軟する前に超音波処理します。 クロマトグラフィーは、フェノール化合物、特にフラボノイドの分析に使用できます[49]。 これらの最後の化合物には、LC-MSが使用され、エレクトロスプレーイオン化（ESI）と大気圧化学イオン化の両方が頻繁に適用され、フラボノイドの最高の感度は一般に負イオンモードで達成されます[49]。 たとえば、チュニジアの砂漠から収集されたCalligonum Azel Maire植物画分の植物化学が評価され、4倍飛行時間型質量分析UHPLC-ESI-QTOFと組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーを使用してフラボンの中のフェノール類を同定しました。同定されたフェノール化合物の中で最も豊富なフラバノール[52]。 より具体的には、イソラムネチングルコシドおよびイソラムネチングルコシルラムノシドの存在が、LC / ESI-MS/MS技術を使用して食用塩生植物Mesembryanthemumeduleの葉の主要な化合物として確認されました[3]。 この作業に続いて、LC-ESI-TOF-MSを使用して多くのポリフェノールを特性評価した人がいます。 その中で、フラボノイドは、Arthrocnemum indicum [5]、Tamarix gallica [16]、Glaucium flavum [13]、Salsolakali[8]などの塩生植物の開花期の地上部から同定されました。 前回の分析と同様に、ArtemisiaハーブのLC-ESI-TOF-MSおよびGC-MSプロファイリングを実行して、フラボン、フラボノール、フラボノイドアルカロイドなどのフェノール類を同定しました[7]。 Pancratium maritimumについて別の研究が行われ、HPLC-DAD-ESI / MSによる分析により、イソラムネチンとしてのフラボノールを含むフラボノイドと、その五酸化およびイソラムネチンジヘキソシドなどのヘキソシドコンジュゲートの存在が明らかになりました[53]。

非脂肪化合物として、フラボノールはヘキサンで分離できます。 次に、エタノールなどの極性溶媒を使用できます。 HPLCを使用したLimoniastrumguyonianumの研究では、イソラムネチン-3-O-ルチノシド[54]を含む多くのフェノール類の存在が示されました。

フェノール抽出物とは異なり、フェノール化合物はオリーブオイルなどの油にも含まれています[55]。 これらの化合物は、油を酸化から保護し、油の栄養価を向上させる能力があります。 フェノール化合物としてのイソラムネチンは、石油やヘキサンの代わりに2-メチルテトラヒドロフラン（MeTHF）などの緑色溶媒で得られたチュニジアブラッククミン（Nigella sativa L.）種子からの油抽出物でも検出されています。油に富むフェノール化合物を抽出するためのベースの溶媒[10]。 イソラムネチンの存在は、HPLC分析によって承認されました。 ダイオードアレイ検出器（LC-DAD）を備えた液体クロマトグラフィーを使用した分析では、MeTHFとヘキサンによるブラッククミンからのオイル抽出後に、それぞれ6.3〜6.6（ug / gオイル）の範囲の大量のイソラムネチンが明らかになりました。 さらに、H核磁気共鳴（HNMR）およびC核磁気共鳴（CNMR）を使用して、ケンペロール-3- O-ルチノシド（ニコチフロリン）およびイソラムネチン-3- O-ルチノシド（ナルシシズム）などのいくつかのフラボノールグリコシドイランのクルディスタン州マリバン市で収集されたPeucedanumaucheriBoissの空中部分から特徴づけられた[56]。 NMR法は、化合物の特定の原子核が磁場と相互作用するという特性を検出します。 この特性は、特定の周波数で磁気共鳴を生成することであり、分子の構造に関する情報を提供します。 次に、フラボノール抽出の効率を評価するために、特にイソラムネチン-3-O-ルチノシド[20]を取得するための最良の方法を理解するために数学モデルが選択されます。 Calendulaofficinalisの花を使用して多変量因子分析を実施しました。 線形、2次、完全3次、および特殊3次モデルを分析しました。 最終的なフルキュービックが最も適切なものであり、イソラムネチン-3- O-ルチノシドの抽出効率が60％向上しました。 この研究では、酵素、Rapides Maxi FruitおよびViscozymeを、圧力、温度、pH、時間、エタノール水溶液などの超臨界CO2条件下での酵素活性に影響を与えるいくつかの重要な要因の下で使用しました。 最後に、超臨界流体抽出法を使用して、フラボノールなどのフェノール化合物を抽出しました。 何年も前に、超臨界流体抽出手順は、水、酢酸エチル、およびエタノールを含む純粋な修飾CO2を使用して、Eucalyptusglobulus樹皮で初めて使用されました[57]。 著者らは、エタノールと組み合わせた超臨界CO2が、イソラムネチンを含むかなりの量のフェノール化合物を抽出できることを示しました。 HPLC-MS定量により、イソラムネチン-ヘキソシド（抽出物の0.26 gg-I）や単純なイソラムネチン（抽出物の14.29 mg：gI）などのフラボノールが測定されました。 共溶媒としてエタノールを使用した。 定量化は、フォトダイオードアレイ検出器を備えた高圧液体クロマトグラフィーで実施した。 イソラムネチン3-O-グルコシル-ラムノシル-ラムノシド、イソラムネチン3- O-グルコシル-ラムノシル-五酸化物、イソラムネチン3- O-グルコシル-ラムノシド、およびイソラムネチン3-O-グルコシル-ペントキシドは、ウチワサボテン-インディカ超臨界抽出物から抽出された最も豊富なフラボノールでした。 前述のように、高圧液体クロマトグラフィーまたはHPLCは、フェノール化合物を分析するために一般的に使用される方法です。 リンゴジュースとナシジュースでは、イソラムネチン3-O-グルコシドが検出されました。 実際、HPLCおよび質量分析による「Brettacher」リンゴ抽出物中のフラボノール配糖体の分離は、イソラムネチン3-O-グルコースおよびイソラムネチン3-O-ガラクトシド[ 58]。