パート1：ゲラニオールは、抗酸化状態、炎症、およびアポトーシスの変化を通じてドキソルビシンを介した腎臓の損傷を改善します：NF-kBおよびNrf2/Hoの潜在的な役割-1

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概要：ドキソルビシン媒介腎臓機能障害癌治療における深刻な問題です。 したがって、この研究は、ドキソルビシン誘発性を調節するゲラニオールの能力を調査した。腎臓の損傷ラットモデルを使用します。 ラットは、対照、ドキソルビシン（20 mg / kg、腹腔内、ip）、ドキソルビシンと100 mg / kgのゲラニオール、およびドキソルビシンと200 mg/kgのゲラニオールの4つのグループにランダムに割り当てられました。 血清クレアチニン、血中尿素窒素、およびアルブミン値の変化によって証明されるように、1回のドキソルビシン注射が腎機能障害を引き起こしました。 また、腎臓の構造に組織学的変化を引き起こしました。 さらに、ドキソルビシンは脂質過酸化を促進し、グルタチオン、カタラーゼ活性、およびグルタチオンペルオキシダーゼとスーパーオキシドジスムターゼの発現を低下させました。 興味深いことに、ゲラニオールによる前処理は、腎臓の抗酸化パラメーター、酵素活性、および炎症性およびアポトーシスを媒介する遺伝子とタンパク質の発現におけるドキソルビシン誘発性の変化を救済しました。 さらに、ゲラニオールによる予防的治療は、用量依存的にほとんどの腎臓の組織学的特徴を保存した。 これらの発見は、ゲラニオールがドキソルビシンを介したものから保護できることを裏付けています腎機能障害。 ただし、ドキソルビシンを介した腎機能障害に対するゲラニオールの保護効果のメカニズムを明らかにするには、さらなる研究が必要です。

キーワード：ドキソルビシン; 炎症; 酸化ストレス; アポトーシス; 腎臓障害; ゲラニオール

1.はじめに

その発見以来、アントラサイクリン系抗がん剤ドキソルビシン（Dox）は、固形腫瘍や血液悪性腫瘍に対して広く利用されてきました。 その最も一般的な副作用の中には腎毒性があり、これは濾過、再吸収、排泄の減少を伴う腎機能障害として説明されており、罹患率と死亡率の重大なリスクに関連しています。 化学療法を受けた癌患者の約60％が腎毒性を発症し、Doxの治療効果を制限します[5,6]。 Doxを介した腎毒性を引き起こす基本的なプロセスは不明なままですが、文献によると、酸化ストレス, 炎症、 とアポトーシス。 特に、証拠は、Dox関連の減少を示しています酸化ストレス, 炎症、およびアポトーシスイベントは、薬物の腎毒性を軽減するのに役立つ可能性があります。

核因子（赤血球由来2）様2（Nrf2）は、細胞防御システムを維持する抗酸化、抗炎症、および細胞保護能力を備えた酸化還元感受性転写因子です。 酸化ストレスにより、Nrf2は細胞質阻害タンパク質を放出し、核に入り、ヘムオキシゲナーゼ-1（Ho -1）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）、カタラーゼ（ CAT）、およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）[14-19]。 Doxによる治療は、Nrf2のmRNAとタンパク質の両方の発現を低下させ、したがって、下流の抗酸化遺伝子とタンパク質の発現を低下させ、腎臓毒性を引き起こすことが示されています。

核因子-kB（NF-kB）は、多くの炎症性遺伝子の発現を調節する転写因子です。 活性酸素種（ROS）によって活性化されるNF-kB経路の中心人物として、炎症反応とその結果としての組織損傷を引き起こす可能性があります[8、22、23]。 多くの研究で、Doxが炎症を引き起こし、インターロイキン-6（IL -6）、インターロイキン-1ベータ（L -1）などの炎症誘発性サイトカインの産生を増加させることが報告されています。および腫瘍壊死因子-α（TNF-）[11,13]。 さらに、Doxを介した腎障害後のROS産生の増加は、ミトコンドリアの不安定性を介して内因性アポトーシス経路を活性化する上で重要な役割を果たすことが示されています。 この経路の重要な決定要因は、ミトコンドリア関連タンパク質のBaxとBcl-2です。 Bcl -2とBaxのバランスの取れた比率はアポトーシスを防ぎ、不均衡は膜透過性の増加とシトクロムcのサイトゾルへの漏出を引き起こし、カスパーゼ-9（Casp -9）とカスパーゼ{を活性化します。 {21}}（カスパーゼ-3）。 このような活性化は、一般的にDNAの断片化と細胞死につながります。

化学療法薬の臨床使用を最大化すると同時に、それらの悪影響を最小化することは非常に興味深いことです。 したがって、その副作用を改善するために、Doxと組み合わせたさまざまな薬剤の使用を調査するための研究努力が行われてきました[13、30、31]。 ハーブ抽出物とその生物活性成分は、薬物を介した毒性を軽減する能力で長い間認識されてきました。 ゲラニオールは、生姜、バラ、オレンジ、ラベンダー、レモンなど、ほとんどすべてのエッセンシャルオイルに含まれる非環式モノテルペンアルコールです[32,33]。 ゲラニオールは、抗潰瘍、抗癌[35]、抗うつ剤[36]、抗炎症剤[33]などのさまざまな有益な特性を持ち、さらに糖尿病性腎症を緩和できることが多くの研究で報告されています[37]。 。

私たちの知る限りでは、現在、Doxを介した腎毒性に対するゲラニオールの予防効果に関する具体的な情報はありません。 したがって、我々は、Wistarラットの腎臓におけるNF-kBおよびNrf2 /Ho-1シグナル伝達経路を介したDoxによって引き起こされる損傷に対するゲラニオールの作用の影響と考えられるメカニズムを研究しました。

2.材料と方法

2.1。動物

オスのウィスターラットは、サウジアラビアのリヤドにあるキングサウド大学（KSU）の動物管理センターから調達しました。 動物は、12時間の明/暗サイクルで室温（25±1度）に保たれ、KSU地方機関研究倫理委員会によって承認された水と標準食を無制限に摂取できるなど、管理された条件で維持されました。 （REC）認証番号KSU-SE-19-122で。

2.2。 実験計画

この調査では、4つのグループに割り当てられた体重190-210gの合計32匹のオスのウィスターラットを調べました。 ラットは、研究の前に環境に適応するために一週間与えられた。 対照群としても知られるビヒクル群は、通常の生理食塩水の経口製剤を与えられたラットで構成されていた。 グループIIは、17日目にDox（20 mg / kg ip単回投与）を投与されたラットで構成されていました[11]。 グループⅢIおよびIVラットには、予防用量のゲラニオール（経口）をそれぞれ100および200 mg / kgで18日間投与し、17日目にも同様にDox（20 mg / kg、ip）を投与しました。 18日目に、制御された環境でケタミン/キシラジンの組み合わせを使用してラットを安楽死させた。 血液を採取して血清を分離し、両方の腎臓を取り出し、すぐに液体窒素で瞬間冷凍しました。 生化学的、遺伝子およびタンパク質発現アッセイを凍結組織で実施した。 組織学的検査のために、腎臓組織サンプルをPBSで洗浄し、4％ホルムアルデヒド溶液で保存しました。 調査を通して、実験動物に苦痛または死の兆候はありませんでした。

2.3。 腎機能マーカーの決定

屠殺時に採取した血液から血清を分離するために、血液サンプルを予冷した遠心分離機で2000×gで10分間遠心分離しました。 次に、得られた血清を分析して、アルブミン、血中尿素窒素（BUN）、およびクレアチニンを定量化しました。 の値腎臓機能マーカーは、米国ワシントンDCのSiemensにあるSiemens Autoanalyzer DimensionRXLMAXTMを使用して計算されました。

2.4。脂質過酸化反応の評価

脂質過酸化は、Ohkawa et al。によって以前に記載されたように、わずかな変更を加えて腎臓組織で評価されました。

2.5。 還元型グルタチオンの定量化

腎臓のミトコンドリア後上清（PMS）中の還元型グルタチオン（GSH）のレベルは、SedlakとLindsayによって記述された方法に従って、わずかな変更を加えて測定されました。

2.6。 カタラーゼの活性の定量化

腎PMSにおけるCATの活性は、Claiborneによって記述された方法に従って、わずかな変更を加えて決定されました。

2.7。 遺伝子発現解析（RT-qPCR）

TRIzolTMreagent（Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、製造元のガイドラインに従って腎臓組織からトータルRNAを抽出しました。 抽出されたRNA検体の純度と量は、NanoDropTM 8000分光光度計（Thermo Scientific、USA）を使用して決定されました。 次に、cDNA Synthesis SuperMix（Bimake、ヒューストン、テキサス州、米国）を使用して単離したRNAをcDNAに逆転写し、Applied Biosystems 7500FastReal-でSYBRGreenMaster Mix（Bimake、ヒューストン、テキサス州、米国）を使用して遺伝子発現を定量しました。タイムPCRシステム。 次に、AACtアプローチを使用して、GAPDHをハウスキーピング遺伝子として使用し、グループ間のさまざまな遺伝子の相対的な発現を決定しました。 表1に、この研究で使用したプライマー配列（IDT、ルーベン、ベルギー）を示します。

2.8。 イムノブロット分析

ウエスタンブロット分析は、Alasmariらによって記載されたように実施された。 [41]。 簡単に説明すると、単離されたタンパク質（30-50 ug）をSDS-PAGEゲルで電気泳動し、PVDFメンブレンに転写しました。 5％脱脂粉乳で60分間ブロッキングした後、選択的一次抗体（Ho -1、Nrf2、TNF-、I6、NF-kB-p65、切断型カスパーゼ{{）を使用してブロットを4度で一晩プローブしました。 14}}、Bcl -2、Bax、およびGAPDH、希釈率1：1000）。 続いて膜を洗浄し、適切なHRP標識二次抗体（希釈：1：5000）とともに室温で60分間インキュベートしました。 ECL試薬キットとゲルイメージング装置（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）を使用して、メンブレン上のタンパク質の存在を検出しました。

2.9。病理病理学研究

腎臓組織を4％ホルムアルデヒドで後固定し、パラフィン切片化と染色のために処理しました。 ミクロトームを使用して、パラフィン切片を3μmの厚さに切断しました。 次に、切断された切片を処理してワックスを除去し、組織病理学的検査のためにヘマトキシリンプラスエオシン（H＆E）染料を使用して染色した。 腎臓の組織像は、オリンパスBX顕微鏡に接続されたDP72カメラを使用して取得されました。

2.10。データ分析

データはコンピューターベースのプログラムGraphPadPrism 5（San Diego、CA、USA）で分析され、結果は平均と標準偏差（平均±SD）として表されます。 グループ間の差異は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの比較検定を使用して評価され、0。05未満のp値は統計的有意性（p<>