パート1:ホモアルギニンは、一酸化窒素合成酵素-3に依存しない糖尿病性腎症を改善する
May 07, 2022
要約
最近、我々は、ホモアルギニン補給が糖尿病マウスモデルにおいて腎臓保護を与えることを示した。本研究では、糖尿病性腎症(DN)においてホモアルギニンの保護効果が一酸化窒素合成酵素-3(NOS3)非依存性であるかどうかを試験した。実験は、NOS3欠損(NOS3-7)マウスおよびその野生型同腹仔において、複数の低用量のビヒクルまたはストレプトゾトシンを用いて実施し、飲料水を介してホモアルギニンで24週間処理した。糖尿病性NOS3−/マウスにおける24週間のホモアルギニン補給は、ビヒクル処置糖尿病NOS3−/マウスと比較して、アルブミン尿素、血中尿素窒素の増加、組織病理学的変化および腎臓線維症、腎臓線維化マーカー、および腎臓マクロファージ動員を有意に減弱させた。さらに、ホモアルギニン補給は、糖尿病後の腎臓ミトコンドリア機能を回復させた。重要なことに、腎臓NOS1またはNOS2 mRNA発現にすべての群間で有意な変化はなかった。さらに, ホモアルギニン補給は、心機能を改善し、糖尿病後の心臓線維症を減少させました.これらのデータは、ホモアルギニンの保護効果がNOS3から独立していることを実証し、ホモアルギニンがDNにおける腎臓および心臓の保護を誘導するメカニズムの理解を最終的に変えるであろう。
キーワード:心機能,糖尿病性腎症,ホモアルギニン,NOS3
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1 はじめに
糖尿病米国では罹患率と死亡率の深刻でますます蔓延している原因であり、成人の推定12〜14%が糖尿病であり、少数民族の間ではさらに高い割合である(Gao et al、2016;Menke et al, 2015).糖尿病合併症による経済的および生産性の損失は2,450億ドルを超え、全身性を含む生理学的および心理的影響につながる炎症,腎機能障害および心臓機能障害、うつ病、および社会不安(Jha et al.,2018;Menke et al, 2015;モレノら,2018;Tao et al.2015;Vanstone et al., 2015).糖尿病性腎症(DN)は、急速な衰退および末期腎不全につながる慢性進行性疾患である。過去10年間で、糖尿病による腎不全の発生率は倍増しました。血圧やグルコースコントロール、その他のライフスタイルの変化を含む伝統的な治療法は、腎不全の進行を遅らせるのにわずかに成功しています。したがって、糖尿病の発症および進行に関与するメカニズムを特定することは重要である。腎臓病.シスタンチェ・デゼルティコーラ伝統的な漢方薬に属し、腎臓を調子を整える薬です。主に腰痛、腰痛、インポテンスなどの腎臓 - 陽欠乏症に使用されます。しかし、ほとんどの糖尿病患者は陰欠乏症を患っており、陽欠乏症がある場合は適切に服用することができます。ただし、暑さや寝汗の恐れ、口渇などの負の熱の症状には注意して使用する必要があります。とにかく、まず医師に相談してください。
タンパク質合成に関与しない内因性アルギニン類似体であるホモアルギニンは、健康と病気の新しいプレーヤーとして浮上しました(Pilz et al., 2015)。ホモアルギニンはミトコンドリアアルギニンによって合成される:L-アルギニンおよびL-リジンを基質として腎臓におけるグリシンアミジノトランスフェラーゼ(AGAT)(Choe et al., 2013;Ryan & Wells,1964)、アラニンを用いて異化:グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ2(AGXT2)(Rodionov et al.2016)。ホモアルギニンの血漿中濃度は、心血管疾患および全死亡率のリスクと逆相関している(Jud et al.,2018;Marz et al, 2010)、致死的脳卒中のリスク増加(Haghikia et al.,2017)、うっ血性心不全、および左心室肥大(Atzler et al.,2013,2017;Bahls et al., 2018;Pilz, Edelmann, et al.,2014), aging(Atzler, Schwedhelm, et al.,2014;Marz et al., 2010), smoking (Atzler, Gore, et al, 2014;Sobczaket al.,2014;Vogler al,2015;Zwan et al.,2013), ボディマス指数(Atzler, Gore, et al.,2014;Marz et al.2010;Pilz, Teerlink, et al., 2014), and pregnancy(Valtonen et al, 2008).低ホモアルギニンレベルは、心臓機能障害の指標として作用し、関連する高レベルの不斉ジメチルアルギニン(ADMA)(Atzler, Schwedhelm, et al.,2014;Jud et al.,2018;Kayacelebiet al.,2014;ピルゼット al.,2015;Vogler al, 2015)。一酸化窒素(NO)産生/作用に対する低ホモアルギニンの効果は、脳卒中およびアテローム性動脈硬化症のリスク増加と関連している(Haghikia et al、2017)。内皮一酸化窒素合成酵素(NOS3)は、内皮細胞において恒常的に発現し、カルシウムレベルに応答して細胞内NOレベルを調節するように機能する(Zanchiら、2000)。ホモアルギニンは、アルギニンと比較してNOSに対する親和性が弱くても、NOおよびホモシトルリンに代謝され得るため、ホモアルギニンはNOSの基質として機能することによってNO合成に寄与する可能性がある(Drechsler et al., 2011)。腎臓において、低ホモアルギニンは、血液透析患者における突然の心臓死および心不全による死亡の強力な危険因子である(Drechsler et al.,2011)。さらに、低いホモアルギニンレベルは、腎移植患者における心血管リスクの増加と関連している(Kayacelebiら、2017)。両動物において(Banchaabouchi et al.,2001;Tofuku et al., 1985)および慢性腎臓損傷を有するヒト(Drechsler et al 2013)は、ホモアルギニンレベルが低下し、血漿ホモアルギニンレベルが低いと、糸球体濾過速度(GFR)および蛋白尿の低下と有意に関連していた(Ravani et al., 2013)。疫学的データは、ホモアルギニンレベルの低下が腎臓および心血管疾患における死亡率の増加と関連していることを示したが(Drechsler et al.,2015;Jud et al.,2018;Marz et al, 2010;Ravani et al.,2013)、ホモアルギニンの直接的な生理学的メカニズムは不明のままである。我々は以前、ホモアルギニンがDNの有効な治療法であることを示した(Wetzel et al., 2019)。しかしながら、腎臓および心臓機能障害におけるホモアルギニン作用のメカニズムは知られていない。
現在の研究では、糖尿病の腎機能および心臓機能におけるホモアルギニンの保護効果がNOS3とは無関係であるという仮説を試験した。我々の結果は、ホモアルギニンが糖尿病性NOS3-一マウスにおいて腎臓および心臓の保護を媒介し、ホモアルギニンが糖尿病性腎障害を改善するメカニズムの理解を最終的に変えることを示している。DNにおけるホモアルギニンの保護効果は、ミトコンドリア機能の改善を介して媒介され得る。
2. 材料と方法
2.1糖尿病マウスモデル
全ての動物実験は、雄6週齢のマウス(ジャクソン研究所、バーC57BL/6JまたはNOS3-1-ハーバー、ME)で行った。マウスを23°CCに保ち、12:12の明暗サイクルで、標準的な固形飼料と水に自由にアクセスしました。糖尿病は、50mg/kgのストレプトゾトシン(STZ)または生理食塩水対照の腹腔内注射により、5日間連続して6時間絶食した後に誘発された。すべての手順は、研究を通して午前中に行われた。血糖値は、マウスの尾静脈からの輪郭ネクストストリップを備えたContour Next EZグルコメーターを使用して非空腹時マウスから測定され、糖尿病マウスは350mg / dl.Lを超える血糖値を有すると定義され、ホモアルギニン(シグマ、セントルイスMO、Cat#:H1007)は、前述のように50mg / Lの濃度で飲料水に補充された(Wetzel et al., 2019年)を4日ごとに交換した。研究の終了時(24週目)に、24時間の尿サンプルを採取し、ケタミン/キシラジンカクテルの腹腔内注射を用いてマウスを安楽死させた。血漿を心臓穿刺によって得、腎臓および心臓をさらなる研究のために除去した。採尿のために、マウスを代謝ケージに16時間個ずつ入れ、飲料水に自由にアクセスし、尿の蒸発を防ぐミネラルオイル200μlを含む採尿チューブに尿を採取した。心臓穿刺により血液を採取し、3000gで4°Cで3分間遠心分離して血漿を分離した。収集後、すべてのサンプルを分析まで-80°CCで保存しました。1群あたりのマウス数を表1に示す。Ins2Aitaマウスに由来するサンプルは、前述のようにして得られた(You et al., 2015)。すべての動物実験は、サンアントニオ機関動物ケアおよび使用委員会のテキサス大学健康科学センターによって承認されました。
2.2 免疫組織化学
マウス腎臓組織を10%ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、3μm切片を切断した。免疫組織化学を、抗マウスMac-2抗体(クローンM3/38;Cedarlane, Burlington, NC)は、前述のとおりである(Youet al.,2013,2014)。画像は、オリンパスBX60顕微鏡とオリンパスQ-Color3デジタルカメラでQ-capture Pro 7画像ソフトを使用して撮影しました。糸球体マクロファージの数は、20糸球体/切片でカウントした(いいえ。糸球体中のマクロファージの no.糸球体の)を40×倍率未満で盲検化様式で、前述のように平均化した(Morris et al.,2011;ヴェッツェルら,2019;You et al.,2013, 2014).
2.3 腎臓および心臓組織病理学
腎臓および心臓を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、5μum切片を切断した。切片をマッソンのトリクロムまたは過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色で染色し、盲検化方法で検査し、スコアを平均化した。線維症の面積パーセントを決定するために、マッソンのトリクローム写真を10倍で取得し、ImageJで分析して線維症の面積パーセントを測定した。代表的な画像は、オリンパスBX60顕微鏡とオリンパスQ-Color3デジタルカメラで、Q-capture Pro 7画像ソフトを用いて撮影しました。糸球体特性をBioquant Osteoソフトウェア(Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN)を用いて測定し、傷害率指数を前述のように計算した(Mohan et al.,2008)。各腎臓について、12枚の画像を取得し、各視野の糸球体を分析し、統計分析のために各動物について平均化した。
2.4 分析方法
尿中アルブミン濃度は、先に記載したようにアルブウェルMキット(Excell、フィラデルフィア、PA)を用いたELISAにより測定した(Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015)。尿クレアチニンは、Diazyme Creatinine Assay(Diazyme Laboratories, Poway, CA)を用いて測定した(Awad et al., 2011;Awad, You, Gao, Cooper, et al., 2015).血中尿素窒素(BUN)は、前述のようにQuantiChrom尿素アッセイキット(BioAssay Systems, Hayward, CA)を用いて決定した(You et al.,2017)。マウス収縮期血圧は、先に記載したようにCODA非侵襲的血圧システム(ケント・サイエンティフィック社、トリントンCT)を用いて測定した(Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015)。マウスは、読み取りが開始される前に26°Cで10分間順応させた。日周変動を防ぐために、すべてのグループについて同じ時間帯に測定値が取られました。
2.5 心機能測定
シリアルBモードおよびMモード心エコー検査は、30MHzリニアトランスデューサを使用してVevo 2100イメージングプラットフォーム(VisualSonics、トロント、カナダ)を使用して実施し、心臓血行動態パラメータを正確に監視し、ホモアルギニン治療の22週間後にマウスの心臓構造を評価しました。左心室駆出率(EF)および左心室分率収縮率(FS)を、前述のようにMモードを用いて定量した(lorga et al., 2016,2018)。
2.6 RNA 単離とリアルタイム PCR
RNAは腎臓切片全体からトリゾール抽出により単離され、バイオ・ラッド(カリフォルニア州ヘラクレス)スクリプトDNA合成キットを用いてcDNAに逆転写されました。マウスMCU(Mm0116873_m1)、フィブロネクチン(Mm01256744_m1)、腫瘍増殖因子β(TGFβ、Mm01178820_m1)、NOS1(Mm00435175_m1)、NOS2(Mm00440502_m1)、およびRn18S(Mm03928990_gl)(サーモフィッシャー、ウォルサム、マサチューセッツ州)のタグマンプライマーを使用して、CFX384リアルタイムシステム(カリフォルニア州バイオラッド)でリアルタイムPCRを実施しました。平滑筋アクチンのプライマー(FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCCCCCTTTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3')、E-カドヘリン(FW:5'-TGAGTGTGGGTGGCTGG-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3')、およびβ-アクチン(FW:5'-GC TGGTTGTTAGGTAAGTAAGGTGGC-3',RV:5'-GAGG GGGTTGAGGTGTGGG-3',RV:5'-GAGG GGGTTGAGGTGTGGGGG-3')は、前述のようにSYBR Green Master Mix(Thermo Scientific, Rockford IL)を用いて分析された(Morris et al.,2011)、NOS3-/-サンプルとの比較のためにβ-アクチンに正規化した。
2.7 ウェスタンブロッティング
プロテアーゼ阻害剤を添加した0.1%Triton X-100を含むRIPAバッファー(インディアナ州インディアナポリス、ロシュ・ダイアグノスティックス)で腎臓組織をホモジナイズし、10,000gで4°Cで10分間遠心分離して透明化し、上清を回収した。タンパク質濃度は、ビシンチョン酸(BCA)アッセイ(サーモサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州)によって決定した。50ugsの腎臓溶解物のサンプルを4〜12%ビストリスゲル(ライフテクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア州)で分離し、PVDF膜上に移してから5%ドミルミルクでブロッキングした。ウェスタンブロットは、以下の抗体を用いて実施した: MiCU1(0.4 ug/ml;シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス)およびβアクチン(1:1000;細胞シグナル伝達、ダンバース、MA)抗体。ウェスタンブロットをImageJソフトウェア(NIH、Bethesda、MD)を用いて定量し、βアクチンタンパク質発現に正規化した。
2.8 統計解析
すべてのグループ間の比較は、GraphPad Prismソフトウェア(バージョン7.04、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して実施されました。結果はSEM±平均として表され、続いてフィッシャーの最小有意差検定を使用して、グループ間の有意性を比較しました。p の値<0.05 represented="" a="" significant="">
