父方のニコチンは恐怖記憶を強化し、ニコチン投与を減らし、子孫の海馬の遺伝的および神経機能を変化させます
Mar 21, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
リサR.ゴールドバーグ1*| Dana Zeid1 *|Munir Gunes Kutlu2|ロバートD.コール3| ヴァレリア・ラライ4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|トーマス・J・グールド1
1ペンシルバニア州立大学ユニバーシティパーク、ペンシルバニア州立大学生物行動健康学部
2テネシー州ナッシュビルのヴァンダービルト医学部薬理学科
3ケンタッキー大学薬学部、レキシントン、ケンタッキー
4カリフォルニア大学アーバイン校、アーバイン、カリフォルニア大学神経生物学および行動学部
5ペンシルバニア州立大学、ペンシルバニア州ユニバーシティパーク、バイオインフォマティクス、生化学および分子生物学
6ペンシルベニア州フィラデルフィアのテンプル大学心理学部
概要
ニコチンの使用は、世界中で消費されているタバコや電子タバコ製品で依然として非常に普及しています。 しかし、世代を超えたエピジェネティックな遺伝の証拠が増えていることは、ニコチンの使用が次の世代の行動と神経生物学を変える可能性があることを示唆しています。 C57BL6 / Jマウスでの慢性的な父方のニコチン曝露が、F1およびF2の子孫の恐怖条件付け、ならびに条件付けされた恐怖消去および自発的回復、ニコチン自己投与、海馬コリン作動性機能、RNA発現、およびF1のDNAメチル化に及ぼす影響をテストしました。子孫。 父方のニコチン曝露は、強化された文脈的および手がかりの恐怖条件付けおよび消滅した恐怖記憶の自発的回復と関連していた。 さらに、自己投与パラダイムで評価したように、ニコチン強化はニコチンを産んだマウスで減少した。 これらの行動表現型は、ニコチンに対する反応の変化、海馬のニコチン性アセチルコリン受容体結合のアップレギュレーション、誘発された海馬のコリン作動性電流の減少、および神経発達と可塑性に関連する海馬遺伝子のメチル化と発現の変化と結びついた。 遺伝子発現分析は、神経可塑性および精神障害に潜在的に関与するより広範な遺伝子ネットワークに対する多世代の影響を示唆している。 恐怖条件付けの変化は、同様に、心的外傷後ストレスに類似した不安障害に類似した表現型を示唆しています。
キーワード：コリン作動性、海馬、学習、多世代、ニコチン、世代間
1はじめに
蓄積された証拠は、乱用薬物への曝露の影響が個人を超えて、曝露されていない子孫の生理学的および行動的表現型に影響を与えることを示唆しています。ニコチン曝露は、脳のコリン作動性システムへの影響を通じて、ニコチン中毒の根底にある可能性のある脳機能の著しい変化を引き起こし、うつ病6や不安などの精神障害のリスクの増加に寄与する可能性があります。細胞および回路機能への持続的な影響を可能にします。8,9最近まで、これらのエピジェネティックな修飾は、生殖細胞系の確立時に消去され、したがって次の世代から隔離されたと考えられていました。 ただし、ある世代で取得されたDNAメチル化、ヒストン翻訳後修飾、および非コードRNAを含むエピジェネティックな修飾は、次の世代に継承できます10,11。これらのエピジェネティックな修飾は、子孫の行動および神経生物学に対する親ニコチン曝露の多世代および世代を超えた影響を媒介する可能性があります。
複数の独立した研究所からの齧歯類の研究は、親のニコチン曝露の多世代および世代を超えた結果を特定し始めています。 この研究はこれまでのところ、親のニコチン曝露が抑うつおよび不安のような表現型、1認知の柔軟性、2注意欠陥多動性障害（ADHD）のような行動3および遺伝子発現に及ぼす影響を特定しています1,2。ニコチン曝露は、ニコチン中毒とメンタルヘルスに関与するエンドフェノタイプに影響を与える可能性があります。 たとえば、ニコチン曝露は、心的外傷後ストレス障害（PTSD）や中毒などの精神障害に対する脆弱性に関連する海馬依存性恐怖学習のモデルである文脈的恐怖条件付けを調節することを示しました。12-14ニコチンの文脈的恐怖学習への影響は海馬によって調節されます15,16。急性ニコチン曝露は海馬依存性恐怖学習を強化し15,17、文脈的恐怖の消滅を損ない18,19し、その後の文脈的恐怖の自発的回復を増強することを発見しました。絶滅18しかし、これらの表現型に対する父親のニコチン曝露の多世代および世代を超えた影響は研究されていません。 さらに、これまでの研究では、コリン作動性機能に対するニコチンの多世代効果を特徴づけていません。 多世代遺伝とは、曝露された個体の直後の世代で発生する表現型を指しますが、世代間遺伝は、表現型の変化につながる直接的な環境の影響がない場合の世代間のエピジェネティック情報の生殖細胞系列を介した遺伝で構成されます11。 F1およびF2世代の文脈的および手がかりの恐怖学習、ならびにニコチン自己投与、海馬ニコチンアセチルコリン受容体（nAChR）結合、海馬コリン作動性機能、海馬遺伝子発現、および海馬DNAメチル化に対する父方ニコチン曝露の世代間効果F1世代。 父方のニコチン曝露は恐怖条件付け、海馬遺伝子発現、および子孫と孫の機能に影響を与えると仮定した。
シスタンチェ抽出物の効果
2方法と材料
2.1科目
被験者はオスとメスのC57BL/6Jマウス（8〜20週齢、メイン州バーハーバーのジャクソン研究所）でした。 ハーレム繁殖用の飼育場を除いて、すべての動物は12時間の明暗サイクルでグループ飼育され、餌と水を自由に摂取できました。 自己投与中、被験者は自由摂食体重の85％から90％に食物制限され、水は自由に与えられた。 すべての行動テストは、午前9時00から午後6時00の間に行われました。 すべての手順は、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って実施され、ペンシルベニア州立大学、テンプル大学、またはカリフォルニア大学アーバイン校のIACUC委員会によって承認されました。
2.2父方のニコチン曝露
男性（8週間）は、0 .9パーセントの滅菌生理食塩水または酒石酸水素ニコチン塩（12.6 mg / kg /日、遊離塩基重量-フィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサムまたはMPバイオメディカル、カリフォルニア州サンタアナ）を0。9％滅菌生理食塩水、浸透圧ミニポンプ（Alzet、モデル1004、Durect、カリフォルニア州クパチーノ）を介して28日間皮下送達。 この用量は、中等度の人間の喫煙者に見られるものに匹敵する血漿ニコチンおよびコチニンレベルを生成します。
2.3F1およびF2マウスの生成
マウスにおけるニコチンの半減期は約6分です22。ニコチン離脱の影響は、ニコチン除去後4日までに消失することが以前に示されています。23-25したがって、ニコチン治療とニコチン治療の間の4日間の遅延繁殖は、繁殖前にニコチンを全身的に除去するために実施されました。 オスのマウスを2匹のナイーブC57BL/6 Jメス（8〜20週齢）のケージに2週間入れて、F1子孫を生成しました。 F2マウスは、ナイーブなオスのF1マウスとナイーブなメスを交配することによって生成されました。
2.4恐怖条件付け
恐怖条件付けと絶滅の手順は以前に詳細に説明されています19。簡単に言えば、マウスはノイズ減衰チャンバー（18.8×20×18.3cm、65dBバックグラウンドノイズ;MED Associates、St. Albans、 VT）。 F1マウスとF2マウスは、2つの条件付き刺激（CS、3 0 s、85 dBホワイトノイズ）-無条件刺激（米国、2 s、0.57 mAフットショック）の組み合わせで120秒間隔で恐怖条件付けされました。 F1およびF2マウスの恐怖条件付けに対するニコチンの急性効果を調べるために、子孫は2〜4分前に急性ニコチン（0.09 mg / kg、NIC遊離塩基重量、ip;酒石酸水素ニコチン塩、Fisher Scientific）または生理食塩水（SAL）を投与されました。トレーニングとテストセッションに。 トレーニングの24時間後、マウスをトレーニングコンテキストに5分間戻し、コンテキストの凍結を評価しました。 文脈テストの後、手がかりとなる恐怖学習を評価するために、マウスを別々のチャンバーに入れました。 偏りのない時間サンプリング法を介して、呼吸以外の自発的な動きがないこととして定義される凍結を評価した条件を知らされていない実験者19。ペアリング、および文脈上の恐怖の消滅と自発的な回復も調べられた。 恐怖の消滅は、文脈的および手がかりの恐怖テストの翌日から始まる5回の連続したセッションで発生しました。 最後の絶滅セッションに続いて、マウスはホームケージに7日間静置され、その後、自発的な回復のためにトレーニングコンテキストで再テストされました。 恐怖条件付けで観察された違いが衝撃感度、不安、またはより広範な学習障害の違いによるものかどうかを判断するために、NICおよびSAL-Sired動物のオスとメスをオープンフィールド、衝撃感度、高架式十字迷路でさらにテストしました（ EPM）、および新しいオブジェクト認識パラダイム（完全な方法と結果については、サポート情報を参照してください）。
2.5食物および静脈内ニコチン自己投与
A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>後続の3回のセッションでセッションあたり25ペレット）、被験者は、前述のように、イソフルラン（1％〜3％）/酸素蒸気麻酔下で頸静脈にカテーテルを挿入しました。食べ物の報酬のために再び応答します。 食物反応の再確立により、マウスは静脈内手術後に十分に回復し、オペラントチャンバーへのアクセスが遅れた後、正常なオペラント反応を示すことが保証されます。 次に、マウスは、1時間の毎日のセッション中に週に6〜7日間、静脈内（IV）ニコチン自己投与を取得することを許可されました（ニコチン酒石酸水素塩を0。9％滅菌生理食塩水に溶解、{{1 { {12}}}}。03mg / kg /注入、遊離塩基重量; MP Biomedical、カリフォルニア州サンタアナ）。 IVニコチンは、Razelシリンジポンプ（Med Associates）によって供給されました。 各セッションには2つの格納式レバーがありました（1つはアクティブ、もう1つは非アクティブ）。 アクティブレバーの応答基準が完了すると、IVニコチン注入が行われました（0。{{2 0}} 3ml注入量;FR5TO20秒スケジュール）。 非アクティブなレバーでの応答が記録されましたが、スケジュールされた結果はありませんでした。 0.03 mg / kg /注入での8回の取得セッションの後、注入用量は6セッションで0.1 mg /kg/注入に切り替わりました。 各用量について、最後の3つのセッションの平均摂取量を統計分析に使用しました。 カテーテルは、ヘパリン（100USPユニット/ml）を含む生理食塩水（0.9パーセントw / v）で毎日フラッシュされました。 カテーテルの開存性は、ニコチンの自己投与段階に続いて、ブレビタール（メトヘキシタールナトリウム、イーライリリー、インディアナポリス、インディアナ州）で検証されました。 再発に関連する行動を評価するために、最後の0.1 mg / kg /注入用量のIVニコチン自己投与の直後のセッション後、マウスの渇望のインキュベーションをテストしました。 この手順では、マウスはアクティブレバーで反応することができますが、ニコチンの注入は受けません。 最初のベースラインインキュベーションセッション（1日目）で、マウスをFR5TO20秒のスケジュールでオペラントチャンバーに入れ、偶発的なキューライトを活性化しました。 その後、マウスをホームケージに20日間収容した。 禁断の21日目に、FR5TO20秒のスケジュールでアクティブレバーキューライトを照射して、マウスの渇望のインキュベーションを調べました。 研究はグループの状態を知らされていない実験者によって行われ、行動反応はMedAssociatesソフトウェアによって自動的に記録されました。
2.6ニコチン性アセチルコリン受容体結合
放射性リガンド結合アッセイ16は、8週齢のNIC-Sired（5 Mおよび10F）およびSAL-Sired（9 Mおよび6F）F1マウスの海馬を使用して実施しました。 溶解バッファー（5 mM Tris + 5 mM EDTA + 5 mM EGTA）を使用してサンプルをホモジナイズし、100 000 gで4度で30分間遠心分離し、溶解バッファーに再懸濁し、再度遠心分離しました。 ペレットをTris/10％スクロースバッファーに再懸濁し、[3 H]エピバチジン（[3 H] EB）（27,28に基づいて約2 nM）（比放射能54.1 Ci / mmol、PerkinElmer、マサチューセッツ州ボストン）と1分間インキュベートしました。室温で1時間。 [3 H] EBがnAChR結合に選択されたのは、以前の結果が海馬ヘテロメリック4 2 nAChRが恐怖条件付けに対するニコチンの効果を媒介することを示したためです17。非特異的結合は300μMニコチン（酒石酸水素ニコチン塩）の存在下で評価されましたトリスバッファーに溶解、遊離塩基濃度）。 [3 H] EB結合nAChRをろ過し（24ウェルセルハーベスター、Brandel Co、メリーランド州ゲーサーズバーグ）、液体シンチレーションカウンター（Tri-Carb 2810 TR、パーキンエルマー、マサチューセッツ州ボストン）でフィルターの放射性を測定しました。 fmol / mg組織として表される特異的結合は、総結合と非特異的結合の差として計算されました16。
2.7生体内アンペロメトリーコリン作動性記録
ナイーブ10から20週齢のNIC-SiredおよびSAL-SiredF1マウスの別のコホートを使用して、アンペロメトリーを使用して海馬のコリン作動性伝達の変化を評価しました。 4つ（15×333μm）のプラチナ記録部位がペア（上部と下部）に配置されたセラミックベースの微小電極（Center for Microelectrot Technology、ケンタッキー州レキシントン）は、コリンオキシダーゼ（EC番号1.1.3.17; Sigma-コリン電流を検出するための選択性を高めるために、電極をメタフェニレンジアミン（m-PD; Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）で電解重合しました。 感度が3pA/μM以上で、コリンの検出限界が400 nM以下の微小電極を使用して、アセチルコリン（ACh）放出の高感度指標を提供しました30。動物をウレタン（1.2〜1.5）で麻酔しました。 g / kg、ip）、および酵素でコーティングされた微小電極は、定位的に背側（A / P -1.7 mm、M /L±1.5mm、D / V -2.3 mm）または腹側（A / P -3.1 mm、M /L±3.0mm、D / V −4.3 mm）海馬。 腹側海馬と背側海馬は、文脈的恐怖条件付けに異なって寄与するため、別々に評価されました。腹側海馬（vHPC）は恐怖の関連と表現においてより顕著な役割を果たし、背側海馬（DHCP）は文脈的記憶に重要です。31Ag/ AgCl参照電極は反対側の吻側皮質に埋め込まれました。
プラス0.7Vの固定電位を印加することにより、2 Hzでアンペロメトリー記録を行い、データをデジタル化しました（FAST-16ポテンシオスタット、ケンタッキー州ニコラスビル、クウェイントン）。 バックグラウンド電流を60分間安定させた後、電極に取り付けられたガラスキャピラリー（先端の直径：15μm）を使用して海馬に薬物を適用しました。 脱分極誘発ACh放出は、カリウム（KCl 70 mM; 100 NL）またはNIC（1 mM遊離塩基、酒石酸ニコチン; 100 NL）の短いパルスを2分ごとに2〜10psiで適用することによって測定しました。 海馬領域（背側または腹側）と薬物（カリウムまたはNIC）の記録は釣り合いが取れていました。 コリン信号の振幅は、酵素でコーティングされたチャネルの電流がベースライン電流から変化することによって測定され、invitroキャリブレーションに基づいてμM相当のコリンに変換されました。 自己参照を採用して、センチネルチャネルから電流を差し引くことでアーチファクトを排除しました29。微小電極の配置は、冠状海馬切片のニッスル染色によって確認されました（図S1）。 動物ごとの薬物操作ごとの2つの応答の平均を統計分析に使用した。
2.8統計分析
統計的比較は、SPSS（IBM、ニューヨーク州アーモンク）またはGraphPad Prism（米国カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して実行されました。 外れ値は、平均より2標準偏差上の値によって決定されました。 外れ値が検出された場合、その情報は結果セクションに含まれます。 重要性の基準は=.05に設定されました。 統計分析は、最初に、男性と女性の両方の子孫をテストするすべての実験の要因として性別を含めて実行されました。 性別との3方向または2方向の相互作用が検出されなかった場合、分析は性別に崩壊しました（P> .05）。 データは、必要に応じて、t検定、1元配置、または2元配置分散分析によって分析されました。 重要な主効果または交互作用効果の後に、LSD事後比較が続きました。 反復測定ANOVAの後に、多重比較の補正を伴うボンフェローニ事後比較が行われました。 不等分散が検出された場合、不等分散に対するウェルチのt検定が使用され、自由度が切り捨てられました。
2.9 RNA/DNAの分離
成体F1マウス（8週齢;グループあたりn=3Mおよび3F）を頸椎脱臼により安楽死させた。 ヒッポカムポスは、腹側と背側の部分（1：1の比率）に迅速に解剖され、左側と右側からプールされ、ドライアイス上で瞬間冷凍されました。 AllPrep DNA / RNA Mini Kit（Qiagen、Valencia、CA）を使用して、DNAとRNAを同時分離および精製しました。 RNAおよびDNAの濃度と品質は、NanoDrop2000（NanoDrop、ウィルミントン、DE）およびAgilent Bioanalyzer（Agilent、サンタクララ、CA）を使用して評価しました。 RNA抽出の場合、最小RNA完全性番号（RIN）は8.5でした。
2.10トランスクリプトーム解析
RNAシーケンスライブラリは、イルミナTruSeqストランドmRNAライブラリ準備キット（イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して15 0 bpシングルエンドリード用にハックインスティテュートオブライフサイエンスゲノミクスコアファシリティ（ペンステート大学）によって準備されました。イルミナHiSeq250 0でラピッドランモードでシーケンスされました（サンプルあたり約100万回の読み取りで3回の連続実行）。 FASTQファイルはFASTQCを介して品質チェックされ、読み取りあたりの平均Phred品質スコアが30を超えています（つまり、シーケンスエラーが0.1％未満）。 FASTQファイルは、Galaxy Project33でTopHat（v2.1.0）32を使用して、マウスリファレンスゲノム（mm10; UCSC Genome Browser）にアラインメントされました。 CufflinksとCuffmerge（v2.2.1.0）34を使用して、マップされた読み取りからトランスクリプトをアセンブルし、トランスクリプトームファイルをマージして最終的なトランスクリプトームアセンブリを作成しました。 偽発見率（FDR）で調整されたP値は、標準FDRカットオフが0.05.35のCuffdiff（v2.2.1.3）34を使用して、NIC-SiredおよびSAL-Siredサンプルからの差次的遺伝子発現について計算されました。遺伝子発現オムニバスへ。
2.11濃縮分析
差次的に発現する遺伝子は、連想生物学的ネットワークの潜在的な濃縮を明らかにするために、創意工夫経路分析（IPA、2018年12月実行; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen、Redwood City、CA、USA）36を使用して分析されました。 実行パラメーターは、遺伝子ネットワークごとに最大35分子を指定し、分析を哺乳類の中枢神経系組織または細胞株に制限しました。 濃縮の統計的有意性は、多重検定用に修正された右側フィッシャーの直接確率検定を使用して決定されました。
2.12ターゲットバイサルファイトシーケンシング
DNAメチル化分析には、RNAと共分離したDNA（セクション2.9を参照）を使用しました。 RNA-seqは、vHPCとDHCPでそれぞれ952と162の差次的に発現する遺伝子を同定しました。 これらの組み合わせリストからの101 0固有の遺伝子は、カスタムSeqCap Epi Enrichment System（Roche、Pleasanton、CA、USA;表S1）を使用してバイサルファイト-seqの濃縮のために選択されました。シーケンスは、ペンシルベニア州立ハック生命科学ゲノミクスコア施設で実施されました。 ライブラリーは、KAPA Hyper Prepキット（Kapa Biosystems、マサチューセッツ州ウィルミントン）を使用して構築されました。 亜硫酸水素ナトリウムに変換されたライブラリーをPCR増幅し、カスタムキャプチャープローブセット（SeqCap Epi Choice Probes; Roche、Pleasanton、CA、USA）を使用して選択したゲノム領域を濃縮しました。 キャプチャされたDNAは、100ntのペアエンドリードを使用してイルミナHiSeq2500でシーケンスされました。 FASTQファイルはFASTQCを介して品質チェックされました。 イルミナのアダプター配列を削除し、Trimmomaticを使用して低品質の塩基をトリミングしました39。低品質の塩基トリミングは、スライディングウィンドウアプローチで実行され、4塩基対のウィンドウ内の平均品質がしきい値の20を下回ったときにトリミングされました。最小読み取り長は35です。トリミング後、FASTQファイルは読み取りあたりの平均Phred品質スコアが30を超えていました（つまり、シーケンスエラーが0.1％未満）。 トリミングされた読み取りは、Bismarkに実装されたBowtie240を使用してマウスリファレンスゲノム（mm10）にマッピングされました。41Bismark内のメチル_抽出物を使用して、CpGメチル化情報を抽出し、メチル化レポートを作成しました。 MethylKit42は、示差的にメチル化された領域（DMR）の分析に使用されました。 メチル化状態は、500塩基対の重複しないウィンドウで要約され、0.05.35の標準FDRで示差メチル化分析が実行されました。データセットはGeneExpressionOmnibusに寄託されています。
シスタンチェ抽出物の利点
3つの結果
3.1父方のニコチンは、F1およびF2世代のマウスにおいて、文脈的恐怖条件付けを強化し、文脈的恐怖条件付けの急性ニコチン強化を逆転させます
NIC-SiredおよびSAL-SiredF1のオスとメスのマウスは、急性のSALまたはNICの投与後に恐怖状態になりました（0。0 9 mg / kg ip、図1A）。 ベースライン、CS前、およびCSの凍結の完全な分析は、サポート情報に含まれています。 種雄牛治療、急性薬物治療、および性別を要因とする文脈凍結の3元配置ANOVAは、有意な種雄牛×急性薬物治療の相互作用を明らかにしました（F（1,36）= 32。75、P<。{{27 }}="" 0="" 1）。="" 性別と種雄牛または急性薬物治療との間に有意な相互作用がなかったため、性別で崩壊した二元配置分散分析を実行し、有意な種雄牛治療×急性薬物治療の相互作用を明らかにしました（f（1,40）="20" .96="" 、p=""><.001）。 事後比較では、生理食塩水で治療したnic-sired="" f1マウスは、生理食塩水で治療したsal-sired="" f1マウスと比較して増強された文脈的恐怖条件付けを示した（t="" 20="2。73、P"><.05）。 以前の発見と一致して、0.09="" mg="" kgの43急性nicは、sal-siredマウスで強化された文脈的恐怖条件付けをもたらしました（t="" 22="2。99、P"><.01）。 しかし、0.09="" mg="" kgの急性nicは、nicを用いたマウスの文脈的恐怖条件付けを損ないました（t="" 18="3。36、P"><.01）。 全体として、nic-sired="" nicマウスのコンテキスト凍結レベルは、0.09="" mg="" gの両方でsal-siredsalマウスで観察されたレベルと同等でした（p=""> .05）。
さらに、オスとメスのNICおよびSAL-Sired動物は、衝撃感度（図S2）、高架式十字迷路（EPM、図S3）、オープンフィールド、および新しい物体認識パラダイム（図S4、完全な方法についてはサポート情報を参照）でテストされました。および結果）。 EPMのNIC-Sired女性（不安様行動の増加を示した）とショック感受性のNIC-Sired動物（ショックに対する発声反応性の低下を示し、多世代表現型を学習する恐怖の増大を混乱させない）を除いて、違いはありませんNIC-SiredマウスとSAL-Siredマウスの間で検出されました。
図1父方のニコチンは、文脈的恐怖条件付けを強化し、恐怖条件付けの急性ニコチン強化を弱めます。 コンテキストフリーズは、SAL-SiredとSALのコントロールと比較して、NIC-SiredとSALの方が有意に高かった。 0 .09 mg / kgの急性ニコチンは、SAL-Siredの文脈的恐怖条件付けを強化しましたが、NIC-Sired動物の文脈的恐怖条件付けを大幅に減少させました（グループあたりn=10 -12）。 B、コンテキスト凍結は、SAL-grandsire +SALコントロールと比較してNIC-grandsire+SALで有意に高かった（グループあたりn=9 -11）。 エラーバーは、平均の標準誤差（SEM）を示します。* P <>
文脈的恐怖条件付けの障害が次世代（F2）まで続くかどうかを判断するために、NIC-grandsireおよびSAL-grandsireのオスとメスのF2マウスをナイーブなF1オスのマウスから飼育しました。 ベースライン、CS前、およびCSの凍結の完全な分析は、サポート情報に含まれています。 状況に応じた凍結の3元配置ANOVAは、祖父の治療、急性薬物治療、および性別を独立した要因として実行されました（図1B）。 性別と種雄牛または急性薬物治療との間に有意な相互作用がなかったため、性別を超えて崩壊した二元配置分散分析を行った。 父の重要な主効果（F（1,37）= 9。88、P<。01）が見つかり、事後比較では、nic-grandsireマウスが比較して増強された文脈的恐怖条件付けを示したことが示されたsal-grandsireマウスを使用（t 39="3。04、P"><0.01）。 さらに、急性nicを投与されたsal-grandsireマウスは、文脈的恐怖条件付けを強化しましたが（t="" 19="">
図2父方のニコチンは、手がかりとなる恐怖条件付けと恐怖記憶の自発的回復を促進します。 手がかりのあるテスト中の潜在的な天井効果を調べるために、F1マウスの別のコホートが1つのCS-USペアリングのみで同一のトレーニングを受けました。 1つのCS-USペアリングで訓練されたSAL-Siredマウスと比較して、NIC-Siredマウスでは文脈的および手がかりの恐怖条件付けの両方が増強されました（グループあたりn=8 -10）。 B、父方のニコチン曝露は、文脈的恐怖の消滅に影響を与えなかったが、最後の絶滅セッションの7日後の恐怖記憶の自発的回復を強化した（グループあたりn=8 -10）。 エラーバーは、平均の標準誤差（SEM）を示します。* P <>
3.2父方のニコチンはF1世代のマウスの手がかりとなる恐怖条件付けを強化する
天井効果が手がかりの恐怖条件付けのグループの違いの検出を妨げるかどうかを調べるために（補足情報を参照）、F1マウスの別のグループを1つのCS-USペアリングで訓練しました。 このコホートでは、文脈的恐怖条件付けの強化（t 7=3 .21、P <.05）と手がかりの恐怖条件付けがnic-siredマウス（t 6=""><。>
3.3父方のニコチンは、F1世代のマウスにおける文脈的恐怖記憶の自発的回復を促進します
続いて、CS-USペアリングを1回受けたF1マウスのコホートについて、文脈的恐怖記憶の消滅と自発的回復をテストしました。 F1 NIC-Siredマウスは通常の恐怖絶滅を示しましたが、SAL-Siredマウスと比較して文脈的恐怖記憶の自発的回復の増強を示しました（t 7=3 .38、P <>
3.4父方のニコチンはニコチンの自己投与を減少させます
ニコチン自己投与の訓練の前に、被験者は、食物報酬を得るためのオペラント課題を学ぶ能力について分析され、違いは観察されませんでした（補足情報、図S5）。 F1子孫のニコチン強化に対する種雄牛ニコチン曝露の潜在的影響をテストするために、IVニコチン自己投与（0 .03 mg / kg /注入）の取得を双方向混合設計ANOVAで評価しました。セッションの主な効果（F（7,119）= 13。60、P<。001）およびセッション×種雄牛の治療の相互作用（f（7,119）= 5="" .00、p="">< .001）。="" ただし、事後テストでは、8つの取得セッションのそれぞれでグループ間に統計的に有意な差は見られませんでした（図3a）。="" 次に、アクティブおよび非アクティブなレバーの押下回数を分析して、グループが取得中にアクティブなレバーのセッション全体の優先度を維持したかどうかを判断し（図3b）、セッションの主な効果を特定しました（f（7,238）{{20}="" }="" .18、p=""><.001）およびセッション×種雄牛治療の相互作用（f（21,238）= 11。40、p=""><.001）。 事後分析により、ニコチン自己投与の初日にグループが異なることが明らかになった。="" nic-siredグループはsal-siredグループと比較してより大きなアクティブレバープレスを示しました。="" この効果は、曝露初日の薬物探索行動のレベルの上昇、食物報酬への反応の忍耐力、および/または食物から薬物への反応の移行における認知柔軟性の低下のいずれかを表している可能性があります。="" ただし、この違いはそれ以降のセッションでも持続しませんでした。="" sal-siredマウスは、非アクティブレバーよりもアクティブレバーに対して一貫して統計的に有意な優先度を示しましたが（事後p=""><>
図3父方のニコチンはニコチンの自己投与を減らします。 NICおよびSAL-Siredのオスのマウス（グループあたりn=9 -1 0）は、0の取得期間中に各セッションで獲得した注入の総数に違いはありませんでした。 .03mg /kg/注入量。 B、取得中、最初のセッションでアクティブなレバーと非アクティブなレバーを押す回数が大幅に異なり、NIC-SiredマウスのニコチンはSAL-Siredマウスと比較してアクティブなレバーを押す回数が多かった。 ただし、その後のセッションでは、NIC-Siredマウスの反応が低下し、セッション3〜8でアクティブと非アクティブのレバー押し回数に有意差はありませんでした。対照的に、SAL-Sired動物は、アクティブレバーに対して一貫して統計的に有意な優先度を示しました。非アクティブなレバーの上。 C、最後の3回の取得セッションでのニコチン注入の平均数は、NIC-およびSAL-Siredマウス間で有意差はありませんでした。 D、0.1 mg / kg /注入の中程度の用量で、NIC-Siredマウスは有意に少ない数のニコチン注入を自己投与しました。 E、渇望評価のインキュベーションは、21日間の禁断後の以前にアクティブだったレバーでの反応の有意な増加を明らかにしました-SAL-Siredマウスのみ。 エラーバーは、平均の標準誤差（SEM）を示します。* P <>
取得の初期段階で変動を制御しながら潜在的なグループの違いをさらに調べるために、被験者がニコチンに対してより一貫した反応を示した最後の3つのセッションで、ニコチン注入の平均数を調べました（図3C）。 グループは、ニコチン注入の平均数に有意差はありませんでした（P>。0 5）。 その後、マウスを0.1 mg / kg /注入用量のニコチンに移行しました。これは、以前は成体C57BL6 / Jマウスで好ましいことが示されていました44。この用量では、NIC-Siredマウスはより少ない数の注入を自己投与しました（t { {7}}。20、P <.05;図3d）。 禁断中の薬物探索の増加の尺度と考えられる渇望行動のインキュベーションについては、セッションと種雄牛の治療を伴う双方向混合設計anovaにより、セッションの主な効果が特定されました（f（1,17）{{16}="" }="" .90、p=""><.001）。 sal-sired動物は、1日目と比較して禁欲の21日目に大きな反応を示すインキュベーション効果を示しましたが、nic-siredマウスはニコチン探索行動の増加を示しませんでした（p=""><>
3.5父方のニコチン曝露は、海馬のコリン作動性結合と機能を変化させる
高親和性海馬ヘテロマーnAChR結合は、NIC-Sired F1マウスでアップレギュレーションされました（t 28=2 .14、P<。05;sal-sired= 1。21±{{10}="" }="" .043、nic-sired="1。34±0.044）。">
カリウムおよびニコチンによって誘発されたACh電流のアンペロメトリー記録は、F1dHPCおよびvHPCで評価されました。 性別ごとのサンプルサイズが不均一であるため、これらの分析では性別は予備的要因として含まれていませんでした。 KCl脱分極誘発コリン作動性シグナルは、dHPCのSALマウスとNICSiredマウスの間で差がありませんでした（P> .05;図4A）。 しかし、局所的なニコチンの適用は、NIC-Siredマウスのコリン作動性シグナル振幅の有意な減少をもたらしました（t 8=2 .33、P <.05;図4c）。 vhpcでは、kcl（t="" 8="2。60、P"><.05;図4b）またはニコチン（t 8="2。98、P"><.05）の適用後、nic-siredマウスでach放出が減少しました。>
図4父方のニコチンは海馬のコリン作動性シグナル伝達を低下させます。 KCl誘発性終末脱分極によって誘発されるdHPC集団コリンシグナル。 NIC-Sired動物とSAL-Sired動物の間に有意差は検出されませんでした（グループあたりn=5）。 B、KCl誘発性終末脱分極によって誘発されたvHPC集団コリンシグナルはNIC-Siredマウスで減少した。 C、ニコチン誘発集団のdHPCコリンシグナルはNIC-Siredマウスで減少した。 D、ニコチン誘発集団vHPCコリンシグナルはNIC-Siredマウスで減少しました。 コリン作動性シグナル伝達に対する性別の影響は観察されませんでした。 エラーバーは、平均の標準誤差（SEM）を示します。* P <>
3.6父方のニコチン曝露は、背側と腹側の海馬遺伝子発現を異なって変化させる
RNAシーケンシングによるF1海馬トランスクリプトーム解析により、vHPCで952個の差次的に発現する遺伝子が明らかになりました（FDR=0 .05;表S2）。 NIC-Siredマウスでは、これらの遺伝子のうち612がダウンレギュレーションされ、340がアップレギュレーションされました。 dHPCでは、SAL-Siredマウスと比較してNIC-Siredマウスでは162個の遺伝子のみが差次的に発現していました（FDR=0。05）。 これらの162の遺伝子のうち、86はダウンレギュレーションされ、76はアップレギュレーションされました。 遺伝子発現が変化した133個の遺伝子がvHPCとdHPCの間で重複していた。
3.7父方のニコチン曝露は、神経系発生に関与する転写経路を変化させる
vHPCでは、IPA分析により、トップネットワーク「神経疾患、生物傷害および異常、細胞死および生存」（スコア= 41、表S3）および2番目のトップネットワーク「神経系の発達および機能、組織形態、神経学的」が特定されました。病気」（スコア= 23）。 分子および細胞機能の上位5つのカテゴリーは、「細胞形態」（88分子）、「細胞の集合と組織化」（79分子）、「細胞の発達」（96分子）、「細胞の機能と維持」（79分子）、および「細胞の成長と増殖」（87分子）。 上位の生理学的システムの発達と機能は「神経系の発達と機能」（175分子）であり、上位の疾患と障害の機能には「神経疾患」（2番目の191分子）と「心理的障害」（4番目の90分子）が含まれます。 ）（表S4）。
IPAの結果を補完するものとして、Enrichrを使用した濃縮分析により、vHPCでの細胞の成長と発達の変化に関するさらなる証拠が得られ、「RNAスプライシング」、「折りたたまれていないタンパク質への応答」、「細胞成長の調節」、「タンパク質の安定化」（表S5）。 これに対応して、「スプライセオソーム複合体」は、上位のGO細胞用語として特定されました。 Enrichrを介したKEGG経路分析では、影響を受ける可能性のある経路として、スプライセオソームの機能とMAPKシグナル伝達がさらに指摘されました。
vHPCと比較してdHPCで差次的に発現する遺伝子のリストはかなり短いにもかかわらず、同様のdHPCに富む経路と用語が特定されました（表S3およびS4）。 IPA分析により、上位のネットワーク「行動、神経疾患、生物傷害および異常」（スコア= 24）と2番目の上位ネットワーク「神経疾患、神経疾患および異常、および精神障害」（スコア= 20）が特定されました。 。
dHPCの分子および細胞機能の上位5つのカテゴリーは、「細胞の発達」（29分子）、「細胞の成長と増殖」（29分子）、「細胞の形態」（27分子）、「細胞の集合と組織化」（23分子）でした。 、および「細胞機能および維持」（25分子）。 「神経系の発達と機能」は、生理学的システムの発達と機能の分類（2番目、44分子）の下で最も豊富な用語として再び識別されました。 疾患および障害機能分類の上位の強化された用語には、「神経疾患」（1番目、51分子）、および「心理的障害」（5番目、31分子）が含まれていました。 Enrichrを使用した濃縮分析により、vHPCと比較したdHPCの複数の異なるGO生物学的用語が特定されました。これには、IPAの分子および細胞機能「細胞死と生存」を補完する「ニューロン死の調節」および「脳発達」（表S5）が含まれます。
dHPCとvHPCの間で重複する差次的に発現する転写産物の機能的役割をさらに調査するために、両方の領域（合計103）に共通する差次的に発現する遺伝子を評価しました。 2つの領域間で重複して発現する転写産物はすべて同じ方向にダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされており、NICを用いたマウスの脳領域全体で転写経路に共通の変化があることを示唆しています。 IPAによって特定された上位5つの分子および細胞機能カテゴリーは、「細胞死と生存」（17分子）、「細胞運動」（10分子）、「細胞間シグナル伝達と相互作用」（17分子）、「細胞増殖」でした。および増殖」（18分子）、および「細胞形態」（17分子）（表S4）
続いて、dHPCとvHPCに固有の差次的に発現する遺伝子を、IPAで別々に分析し、2つの領域間の神経生物学的適応の相違をテストしました（表S6）。 固有のvHPC固有のdHPC分析間で重複する強化された正規経路はありません。 vHPCに固有の上位の濃縮された標準経路（合計44）には、「カルシウムシグナル伝達」と「糖質コルチコイド受容体シグナル伝達」が含まれ、上位のdHPC標準経路（合計8）には、「甲状腺ホルモン代謝」と「レチノイン酸媒介アポトーシスシグナル伝達」が含まれていました。 vHPCに特有の強化された疾患と機能（合計295）には「[海馬]アンモンの角の形成」と「細胞突起の量」が含まれ、dHPCに固有の強化された疾患と機能の用語（合計111）には「白質の炎症」と「脱髄」が含まれていました。」
3.8父方のニコチン曝露は海馬のDNAメチル化を変化させる
対応する調節領域での変化したDNAメチル化がNIC-SiredF1子孫の差次的遺伝子発現の原因であるかどうかを決定するために、標的DNAメチル化分析を実施しました。 ターゲットには、dHPCまたはvHPCのいずれかで同定された1114個の差次的に発現する遺伝子が含まれていました。 vHPCでは、11個の異なるメチル化領域（DMR）が検出され、8個はメチル化の増加を示し、3個はメチル化の減少を示しました（表1）。 11個のDMRのうち、10個はvHPCで発現の変化を示した遺伝子に関連する領域に位置していました。 dHPCでは、30個のDMRが検出され、15個はメチル化の増加を示し、15個はメチル化の減少を示しています。 30のDMRのうち、29はdHPCで変化した発現を示した遺伝子に関連する領域に位置していた。
ベンcistancheエキナコシドの効果
4。議論
現在の調査結果を含む最近のデータと併せてエピジェネティックなプロセスの理解が深まると、遺伝の伝統的な理解に挑戦してきました。 遺伝子型だけを超えた要因が次の世代の表現型を決定する可能性があり、世代内の曝露は子孫から隔離されない可能性があります。 本研究は、ニコチン曝露の健康への悪影響が個人の曝露を超え、次の世代に影響を与える可能性があることを示唆しています。 我々は、パブロフの恐怖条件付けに対するC57BL / 6Jマウスの先入観の父方のニコチン曝露の多世代および世代を超えた影響を特定し、F1およびF2の子孫でより強い恐怖記憶をもたらした。 父親のニコチン曝露はまた、ニコチン自己投与の減少と再発関連行動の減弱をもたらし、ニコチンに対するより大きな嫌悪反応を示唆しました。 これらの行動の違いをサポートするために、海馬のコリン作動性機能とエピジェネティックなプロセスの多世代の変化が観察されました。 総合すると、これらの結果は、ニコチンに曝露されたマウスの子孫における神経系機能の変化が行動表現型の変化をもたらすことを示しています。
ニコチンに曝露された雄マウスのF1およびF2の子孫は、強化された文脈的および手がかりの恐怖条件付けを示した。 NIC-SiredF1マウスとSAL-SiredF1マウスの間で文脈的恐怖消去に違いはありませんでしたが、NIC-Siredマウスは文脈的恐怖記憶の自発的回復の増強を示しました。 重要なことに、恐怖条件付けの増加を説明できるNIC-SiredマウスとSAL-Siredマウスの間の衝撃感度の違いは見つかりませんでした。 強化された恐怖条件付けは、学習する恐怖に固有のプロセスの調整とは対照的に、学習プロセスの一般化された強化を示唆する可能性があります。 しかし、NIC-Sired雌マウスにおけるEPMオープンアーム時間の増加の性特異的効果は確認されたものの、NIC-Siredマウスでは、新規物体認識、オペラントフードトレーニング、またはオープンフィールド移動の変化は観察されませんでした。 これは他の学習システムや認知プロセスへの潜在的な変更を除外するものではありませんが、これらの調査結果は一緒に、恐怖学習が父親のニコチン曝露の多世代および世代を超えた影響に対してより敏感である可能性があることを示唆しています。 さらに、これらの所見は、NIC-Sired動物におけるコリン作動性機能の変化を示唆している。 ニコチンは文脈的恐怖条件付けを調節します。 急性ニコチンは文脈的恐怖条件付けを強化するが15,45、慢性ニコチンからの離脱は文脈的恐怖条件付けを混乱させる16,21。本研究では、急性ニコチンは生理食塩水処理マウスのF1およびF2マウスにおける文脈的恐怖条件付けを強化した。 対照的に、NIC-Siredマウスでは急性ニコチン破壊の文脈的恐怖条件付けがあり、NIC-grandsireマウスでは効果がなく、海馬のコリン作動性機能の変化を示している可能性があります。
F1世代におけるその後のニコチン自己投与に対する父方のニコチン曝露の影響も、コリン作動性機能の破壊を示しています。 低用量でのIVニコチン自己投与の取得中、NIC-Siredグループではアクティブレバープレスの数の増加が見られたものの、グループはニコチン注入の数に違いはありませんでした。 これは、NIC-Siredマウスが、食物報酬への応答に忍耐力を示し、および/または食物から薬物への応答の移行における認知柔軟性の低下を示した可能性があることを示唆しています。 ただし、絶滅セッションを表す渇望のインキュベーションの1日目にグループに違いはなかったことにも注意する価値があります（たとえば、セッション中にニコチン注入がない）。したがって、この効果は、強化剤が切り替えられましたが、絶滅セッション中に強化剤がない場合はそうではありませんでした。 NIC-Siredマウスはまた、中程度の用量でニコチン自己投与の減少を示しました。これは、親のアルコール、コカイン、およびモルヒネ曝露に関連するアルコール、コカイン、およびオピオイド投与の減少を特定する最近の研究と一致しています（例：Vassoler et al、46 asゴールドバーグとグールドでレビュー47）。 観察されたニコチン自己投与の減少は、ニコチンの報酬効果に対する感受性の低下および/またはニコチンの嫌悪効果に対する感受性の増加のいずれかに起因する可能性があります。 確かに、グループは中程度のニコチン用量で異なっていましたが、より低いニコチン用量では異なりました。これは、より高い用量で嫌悪反応が増加するという概念を支持しています。 興味深いことに、中程度の用量での自己投与後、NIC-Siredマウスでは21日目に渇望のインキュベーションが欠如していることもわかりました。これは、ニコチン探索行動の低下がニコチンの嫌悪関連記憶に関連している可能性があることを示唆しています。 さまざまな神経基質がニコチン摂取と再発関連の反応に対するこれらの影響の根底にある可能性がありますが、最近の研究では、海馬CA1領域のDNAメチルトランスフェラーゼが減少するとモルフィンの自己投与が減少することがわかりました48。学習と記憶のプロセスは、NIC-Siredマウスの海馬におけるニコチン媒介プロセシングの破壊の概念をさらにサポートします。
これらの線に沿って、NIC-Siredマウスは海馬の高親和性nAChR結合の増加を示しました。 また、NIC-Sired動物のdHPCとvHPCの両方で、vHPCでのカリウム誘発性ACh放出の減少、およびニコチン誘発性ACh放出の減少が見られました。 脱分極誘発性ACh放出の変化は、受容体結合の下流のコリン作動性機能の変化を反映し、ニコチン誘発性ACh放出の変化は、nAChR機能の変化を反映します。 これらのデータは、nAChR機能の低下に続く高親和性nAChR結合のアップレギュレーションに関する以前の発見と一致しています49。父方のニコチン曝露の多世代にわたる影響。 DHPCは文脈的恐怖条件付けを調節することが知られています31,50。vHPCの阻害は手がかりと文脈的恐怖条件の両方を混乱させます51,52およびvHPCコリン作動性病変は手がかりとなる恐怖条件付けを損ないます53。
ハーブシスタンシュ
また、dHPCへの直接ニコチン注入は文脈的恐怖条件付けを強化し、vHPCへの注入は文脈的恐怖条件付けを混乱させることを示しました15。 54アミグダラなど、恐怖条件付けに関与する他の脳領域55も父方のニコチン曝露の影響を受ける可能性がありますが、これらの発見と現在のデータは、vHPC機能の変化がNIC-Siredマウスの恐怖条件付けの変化の原因である可能性を示唆しています。 。 父方のニコチン曝露の多世代効果は、これらの神経系の上流で作用する転写エフェクターの変化に関連している可能性があるという仮説を立てました。 F1世代マウスのvHPCおよびdHPCにおけるゲノムワイドな転写シーケンシングにより、NIC-およびSAL-Siredマウス間で1114個の差次的に発現する遺伝子が同定されました。 この違いは、vHPC（952）とdHPC（162）の方が大きく、dHPCコリン作動性機能と比較したvHPCの大きな変化と、文脈的および手がかりの恐怖条件付けの両方の変化と一致しています。 その後の経路分析は、両方の海馬領域における糖質コルチコイドシグナル伝達および神経発達/可塑性に関連する転写経路への広範な変化を示唆した。
vHPCに固有の潜在的な適応を特定するために、いずれかの海馬サブ領域に固有のトランスクリプトのみを使用して経路分析を実行しました。 海馬の機能的に異なるサブ領域であるvHPCとdHPCの間で重複する濃縮IPA標準経路はありません31。dHPCとvHPCの間で重複する遺伝子が除去された場合、vHPCに固有の上位濃縮標準経路には「糖質コルチコイド受容体シグナル伝達」が含まれ、 、dHPCと比較してこの領域で機能する糖質コルチコイドへの追加の変化。 遺伝子発現に作用する可能性のある上流のエピジェネティックレギュレーターを特定する目的で、RNAシーケンシングから特定されたdHPCおよびvHPCの差次的発現遺伝子の編集リストを使用してターゲットDNAメチル化シーケンシングを実行しました。 驚いたことに、NIC-Sired動物とSAL-Sired動物の間で、vHPCで11 DMR、dHPCで30DMRしか見つかりませんでした。 vHPCで差次的に発現する転写物の数がはるかに多いことを考えると、これは予想外ですが、DNAメチル化は遺伝子発現に影響を与える可能性のあるいくつかの調節因子の1つにすぎず、DNAメチル化は一貫して遺伝子発現の変化に変換されません56。差次的転写の方向と一致するメチル化パターンを示した（DNAメチル化の増加による転写の減少およびメチル化の減少による転写の増加）。 vHPCのメチル化された遺伝子には、Fkbp5、Ksr1、およびPnpla2が含まれていました。 興味深いことに、Fkbp5とKsr1の転写は、PTSDの1つの行動マウスモデルで破壊されました57。このモデルでは、マウスが電気フットショックにさらされ、状況に応じたリマインダーが表示されました。 Fkbp5は、糖質コルチコイド受容体シャペロンをコードしており、その機能は、PTSDやその他の不安障害のある個人の不適応な長期ストレス反応に関連しています58。
具体的には、人間の研究では、Fkbp5のメチル化と転写がPTSD症状の重症度と相関し、メチル化の増加と転写の減少がより重症のPTSD症状を予測することが示されています59,60。 PTSD.59,61 NIC-Sired動物における糖質コルチコイドシグナル伝達に関連する転写経路の調節不全と関連した恐怖記憶の自発的回復の増強に関する我々の発見は、PTSD様表現型に対する脆弱性の増加を示している可能性があります。 dHPCでは、DMRパターンは、RNAシーケンスによって検出された差次的転写発現の方向とほとんど一致していませんでした。これは、父方のニコチン曝露によって生成されるvHPC DNAメチル化の変化が、dHPCよりも遺伝子発現に影響を与えるという点でより重要であることを示唆しています。 これは、dHPCと比較してNIC-Sired vHPCでの、より多くの差次的に発現する転写産物とコリン作動性伝達のより誇張された変化の同定と一致しています。 私たちのターゲットシーケンシングアプローチは、遠位にメチル化された配列による潜在的な転写調節を検出する能力を制限している可能性があります。 ゲノムワイドなDNAメチル化、ヒストン修飾、およびsmall RNA発現の分析を含む将来の調査により、これらの発見のより完全な解釈が提供されます。
私たちのニコチン曝露設計の潜在的な制限は、ニコチン曝露の多世代および世代を超えた影響を調査するための父方のニコチン曝露に焦点を当てることです。 コカイン46やモルヒネ62など、父親の薬物曝露後の多世代/世代間表現型を発見した他の研究では、母親のケアに違いは見られませんでしたが、父親のニコチン曝露が母親のケアに影響を与える可能性があります。 母性ケアへの影響を調査する将来の研究が保証されます。 私たちの現在の焦点は父親の曝露にあったので、将来の研究では、父親と母親の曝露の影響も比較する必要があります。 全体として、現在の調査結果は、ニコチン曝露の多世代および世代を超えた影響の新しい理解を提供します。これは、薬物曝露の多世代および世代を超えた影響を特徴付ける文献の増加によってサポートされています（GoldbergおよびGould47で概説）。 この研究は、ニコチンに曝露された男性のF1およびF2の子孫における文脈的恐怖条件付けをテストした最初の研究であり、恐怖記憶形成の増強と恐怖記憶の自発的回復を特定しました。 この研究はまた、F1ニコチンに曝露された子孫におけるニコチンの自己投与と渇望の潜伏期間の変化を特定した最初の研究でもありました。
NIC-Siredマウスでは、PTSDおよびHPA軸の調節不全に関連する遺伝子のメチル化の差異と、ストレス関連の転写経路の同時破壊が見られました。 父方のニコチンはまた、海馬のコリン作動性機能の低下および海馬のnAChR結合の増加と関連していた。 興味深いことに、喫煙しなかったPTSD患者は、有意に高い近心側頭皮質高親和性nAChR結合を示し63、PTSDは、より大きな恐怖条件付けと消滅した恐怖記憶の自発的回復に関連しています64。 PTSDのような症状に対する子孫の感受性の増加。 この発見は、認知の柔軟性に対するニコチン曝露の多世代の影響を示す他の最近の発見2とともに、ニコチン曝露の負の健康転帰が以前に考えられていたよりも広いネットを投げかけたことを示唆しています。
Cistanche抽出物
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