イベリア半島のクマコケモモ（Arctostaphylos Uva-ursi、ツツジ科）の自然分布範囲にわたる個体群レベルでのフェノール化合物含有量と遺伝的多様性
Mar 21, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
概要：クマコケモモ（Arctostaphylos uva-ursi）は、尿路感染症の含有量が高いため、伝統的に尿路感染症の治療に使用されている薬用植物です。アルブチン（ハイドロキノン-D-グルコシド）、現在主に化粧品の天然美白剤として使用されています。 ベアベリーも自然として提案されています酸化防止剤葉に含まれるフェノール化合物の含有量が高いため、添加剤です。イベリア半島の自然分布全体で、固有の生物学的、気候的、および/または地理的要因がフェノール含有量に影響を与えるかどうかを解明することを目的として、ベアベリーの42の野生個体群におけるフェノール化合物の変動を調査しました。 ベアベリーの葉は、緯度と高度の勾配を超えた個体群で、3年間（2014年から2016年）の秋に収集されました。 メタノール抽出物は、総フェノール含有量に幅広い変動があり、フェノールプロファイルが異なることを示しました。アルブチン（この主成分のレベルは87から232 mg / g dr wtまで変化しました）が、地理的および気候的要因の影響を受けたカテキナおよびミリセチンの含有量も変化しました。 ゲノムサイズ（フローサイトメトリーで評価）および2つの色素体DNA領域で中程度のレベルの変動も、集団間で検出されました。 集団の遺伝的および細胞遺伝学的分化は弱いが、植物化学的多様性と有意に関連していた。 より高いエリートベアベリー遺伝子型酸化防止剤その後、容量が特定されました。
キーワード： アルブチン; 遺伝的および植物化学的変動; ゲノムサイズ; ハプロタイプ;自然酸化防止剤
1.はじめに
植物に特化した代謝物の合成は、環境条件への植物の適応に重要な役割を果たし、遺伝的変異も化学多様性を説明するため、時間（個体発生、生物季節学、誘導防御）および空間によって異なります[1]。 これらの化合物の中で、フェノールは、幅広い生理学的役割を果たす多様なモノおよびポリマー構造を持っています[2]。 特殊な代謝物の生合成は、気温、降水量、日射量などの環境要因の影響を大きく受けます。これらの要因は、緯度、縦方向、または高度の勾配にさらされることがよくあります。 特に、フェノール化合物の蓄積は、UV-B（280〜315 nm）放射のレベルの向上に対する一般的な反応です。 特定の化合物の変動は、夏の地中海地域と高地で成長する植物で報告されており、UV-Bの発生率が高く、桂皮酸とフラボノイドが最も高いUV吸収率を示しました[3]。
アルブチン（ヒドロキノン-D-グルコシド）は、アルブチン、アルクトスタフィロス、パイラス、スノキなどの属に属するいくつかの種の葉での発生が制限されている単純なフェノール化合物です。アルブチンの主な天然源であるクマコケモモ（Arctostaphylos uva-ursi（ L.）Spreng。）は、尿路感染症やその他の腎疾患の治療に何世紀にもわたって使用されており[4]、現在でもハーブ製剤が調製されています[5]。 過去数年間、アプリケーションのスペクトルアルブチン主に化粧品業界[6]や臨床治療において、そのために天然の美白剤として広がりました。酸化防止剤、抗生物質、抗炎症、および抗腫瘍特性[7]。 その結果、追加の自然源を見つけることに関心が高まっています。アルブチン、および化学合成に取って代わることができるバイオテクノロジープロセス[8,9]。 これに関連して、Daturainoxia細胞培養を使用したアルブチンのinvitro生産はパイロット規模に達しました[10]。
に加えてアルブチン、他のフェノール化合物は、フラボノイドやタンニンなどのA. uva-ursiの活性特性に寄与します[11、12]。これらから、カテキンとコリラギンがそれぞれ最も関連性の高いインリーブです[13]。 食品業界では、植物フェノールとしての天然化合物が合成物に取って代わりつつあります酸化防止剤防腐剤[14]。 A. uva-ursiは、特に肉製品[15–19]だけでなく、アクティブパッケージング[20]でも添加剤として使用されています。 最後に、皮革産業のなめし剤の供給源としてのA.uva-ursiの可能性が最近提案されました[21]。
欧州医薬品庁の「クマの実の葉」のモノグラフ[5]は、アルブチンハーブ製剤の要件としての乾燥葉の含有量。 過去数十年にわたって実施された研究では、クマコケモモの葉のアルブチン含有量が0パーセントから18パーセントまで変化することが説明されており、分析手順、自然変動、成長条件、収穫日によって説明されています[4]。 アルブチン含有量は通常、高速液体クロマトグラフィー[4,12,22–24]によって決定され、以前の研究ではより高い値が検出されましたアルブチン春に収集されたものよりも秋に収集されたクマコケモモの含有量[4]。地理的分布およびA.uva-ursiの亜種における種内分化に関連する多様なクマコケモモの化学種が記載されています。 報告されている最も顕著な植物化学的変動は、A。uva-ursi亜種にアルブチンが存在しないことです。 stipitata PackerとDenfordだけでなく、メチルアルブチン、エラグ酸、またはミリセチンの含有量の違いも参照されています。 ケルセチンはクマコケモモの葉にも存在し、アグリコンとその3-O-グリコシドの両方がより一般的に見られるフラボノイドです[4]。 しかし、これらの研究のほとんどは数十年前に行われ、今日ではベアベリーの種内変異は継続的であると考えられています。 スペインからのもの（A.uva-ursi subsp。crassifolius（Braun-Blanq。）RivasMart。exTorre、Alcaraz、MB Crespo）を含む、記載されている14の亜種は、現在受け入れられていない名前であり、A。uva-ursi[ 25]。したがって、A。uva-ursiの葉の化学的プロファイルにはさまざまなフェノール、タンニン、種間レベルでの違いを調査するために実施された最近の研究では、フラボノイドが使用されています[23、26、27]。
集団レベルでの遺伝的（細胞遺伝学的を含む）多様性は、さまざまな環境条件への適応を促進します[28]。 薬用および芳香植物における特殊な代謝物の生成に対する倍数化の影響が最近レビューされました[29]。 この文脈では、種内変異がしばしば検出され（[30]、およびその中の参照）、他の多くの生物学的特性と相関し、進化過程で関連する役割を果たすため、ゲノムサイズは植物の変動性評価で主に使用されるパラメーターです[31–35 ]。 しかし、核DNA量（すなわちゲノムサイズ）と植物化学物質の多様性との関連を扱った研究は非常に少ない[36,37]。 植物化学物質と遺伝的多様性の関係は、核、特にプラスチドDNAマーカー[38]、特に薬用[39]および栽培[40]植物種を使用して評価されています。
クマコケモモは周北植物区全体に広く分布していますが、ヨーロッパで収集された野生個体群のほとんどは、東部諸国、オーストリア、スイス、イタリア、スペインにあります。海抜550から2350メートル（asl）の範囲の高度。 低緯度に位置する個体群は頻度が低く、通常は個体数が少ないため、北部ではより一般的です。 スペインのアルブチン含有量の変動性に関する既存の研究では、北東部の人口で8％[41]、ドイツで実施された研究で評価されたスペインの植物材料で19％[42]の範囲の値が参照されました。 私たちの研究は、スペインにおけるクマコケモモの自然分布全体にわたる植物化学物質の変動を説明し、ゲノムサイズや遺伝的多様性などの要因を解明することを目的としています。 私たちの結果は、製薬、化粧品、および食品産業向けの植物材料の選択に貢献する可能性があります。
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2.結果と考察
2.1。 化学的多様性分析
スペインの42か所で育つ合計249の植物からサンプリングされたクマの実の葉は、3年間で2 0 14–2016（図1、表S1）で、さまざまな乾燥重量（dr wt）の割合を示しました。 46.7（LO）から55.1パーセント（CP）、平均50.1±2.7パーセント（データは表示されていません）。 2014年と2015年に収集されたサンプルから調製されたメタノール抽出物は、総フェノールとアルブチン含有量の測定に使用されました。 植物間で有意差（p <0.001）を伴う、両方のパラメーターの広範囲の連続変動を観察しました。 2014年秋にサンプリングされた80の植物の葉の抽出物（図2a）は、103.3±4.8="" mg="" gae="" g="" dr="" wt（サンプルli="" -4）から206.4±6.5="" mg="" gae="" g="" dr="" wt（sr）の範囲の総フェノール含有量を示しました。="">アルブチン含有量は92から変動しました。0±3。0mg/ g dr wt（AN -6）から194.2±5.6 mg / g dr wt（SE -8）。 94の植物から2015で収集された葉から調製された抽出物の分析（図2b）でも、110.5±3.6 mg GAE / g dr wt（PI -4）から200.9±9.8までの幅広い植物化学物質の変動が示されました。総フェノール含有量のmgGAE/ g dr wt（LO -4）、アルブチン含有量は87.1±0.4 mg / g dr wt（ET -2）から211.5±5.9 mg / g dr wt（LI -2）。 さらに、収集年に関係なく、総フェノールとアルブチンほとんどの集団で同じ場所で成長しているクマコケモモ植物の中で含有量が検出されました（データは示していません）。{{0}}の有意なピアソン係数を推定したため、アルブチンレベルはクマコケモモの葉抽出物の総フェノール含有量と有意に相関していました。 2014年は.332（p=0 .003）、2015dataは0.289（p=0。005）。 両方の年にサンプリングされた48の植物のアルブチン含有量は、有意に変化しませんでした（p=0。380）。
個体群内で見られる変動性にもかかわらず、収穫年に関係なく、分散分析は、クマの実の葉抽出物のアルブチン含有量も依存することを示しました（p<{{0}}。00 1）2="" 0=""><0。001、図3b）で分析されたクマの実の葉の総フェノール含有量で発生した個体群の位置（図3a、b）。 対照的に、2014年にサンプリングされた10の集団の間では、総フェノール含有量に有意差は観察されませんでした（p="0。080）。これらは比較的狭い地域にありましたが、424（BA人口）から1410" m="" asl（pa人口）まで。="" 高度のこの変動は、気候条件の違いに関連していました（表s1）。なぜなら、より高い高度の場所は、より低い平均気温（ピアソンの相関係数、r="-0.666、p"><0.001）とより高い年間降水量（より高い年間降水量）によって特徴付けられたからです。 r="0。485、p"><0.001）、これにより、全体的な放射線レベルが低下しました（r=-0.390、p><0.001）。 さらに、このデータセットから、年間降雨量とベアベリー植物の総フェノール含有量の間の低いが有意な正の相関を推定しました（スピアマンの係数rho="0。256、p=0。022）が、2015年のデータセットからより広い地域の人口をサンプリングしたところ、年間降雨量とアルブチン含有量の間に有意な正の相関が検出されました（rho=0。246、p=0。017）。">アルブチン内容（それぞれ、rho=0 .217、p=0.035およびrho= 0。269、p=0。009）。 前述のように、これらのより高いアルブチン含有量は、ベアベリーの葉のより高い総フェノール含有量と有意に相関し、これは、酸化防止剤ローズマリー（185. 0 mg GAE / g dr wt）、お茶（149.3 mg GAE / g dr wt）、またはグアバ（154.4 mg GAE / g dr wt）などの食品業界の添加物[43]。これらの結果は以前の参考文献と一致しており、Wronaらによって実施された研究で裏付けられました。 [20] 2015年に収集されたスペインのクマの実の葉のサンプルのいくつかを使用して、より高い酸化防止剤容量はより高いと関連付けられていましたアルブチンコンテンツ。 エリートベアベリー遺伝子型もこの目的のために特定できます。たとえば、LO集団の個体1、4、7、および8は、2年間の研究で平均183.3±16.4 mg GAE / gdrwtを蓄積しました。
フェノールの変動パターンに影響を与える気候的および地理的要因をさらに解明するために、秋にさらに徹底的なサンプル収集を行いました2 0 16：14 029か所で成長するベアベリー植物と5つのフェノール化合物を定量化しました（図S1a）アセトニトリル/水グラジエント（図S1b）での標準との共溶出によって同定されました。 分析では、アルブチン、カフェー酸、カテキン、ミリセチン、ケルセチンのグルコシド含有量の幅広い連続変動が示され、植物間でも有意差があり、集団内でも一般的に観察されました（データは示していません）。 主要なフェノール成分について、アルブチン含有量は91.1±5。0（LB {{1 0}}）から232.4±2.8 mg / g dr wt（PT {{15 }}）、カテキン含有量は4.1±0。1（AF {{2 0}}）から45.5±1.4 mg / g dr wt（LB -5）の範囲でした。 決定された他の2つのフラボノイドに関して、ミリセチンはいくつかの集団の一部の植物では検出されませんでしたが、PO{{30}}では21.2±1.2mg / g dr wtに達し、ケルセチングルコシドは3.8±0.1（CO -3）から22.8±0.8 mg / g dr wt（BT -3）。 カフェイン酸のより低い含有量は、クマの実の葉の抽出物で測定され、1.8±0.0（IZ -1）から7.1±0.3 mgPlants / g dr wt（SI -4）まで変化しました。
個人間で観察された変動にもかかわらず、これらの5つの化合物についても集団間の有意差が推定されました（クラスカル・ウォリス検定、p<{{0}}。001、およびp= 0。="" 009フォーカフェイン酸含有量）。="" 平均して、ab、gu、ln、およびloの自然集団の植物でより高いアルブチン含有量が測定され（図4a）、lb集団の植物で見られる低い含有量（186.7±22.3、="" 193.9±12.1、169.5±10.0、および169.2±5.2="" mg="" gdrwtフロントから111.8±16.0mg/="" g="" dr="" wt）。="">アルブチン2 0 15でもサンプリングされた植物の含有量は、年によって大きく変化しませんでした（p=0 .821）。 集団LBは、より高い平均カテキンレベルを示し（図4b）、これは、集団AFおよびLCで検出されたこのフラボノイドの低い平均含有量とは大幅に異なりました（32.8±9.8フロントから5.7±1.9および5.3±{{2 {{62} }}}。5mg/ g dr wt、それぞれ）。 平均ミリセチンおよびケルセチングルコシド含有量を図4cに示します。これは、AB、CG、LB、およびPOの集団間で有意差があり、ミリセチン含有量が高くなっています（15.1±4。0、14.6±5.7、1 0集団COおよびODからの平均的な植物に蓄積された低レベル（それぞれ1.2±1.5および2.4±3.6 mg / g dr wt）と比較して、それぞれ.7±2.8および17.2±3.9 mg / g dr wt） 、およびまた、ケルセチングルコシド含有量が決定された集団AA、BT、CP、IZ、およびLB（それぞれ、15.2±3.7、15.9±4.6、11.8±2.3、15.7±3.4、および13.1±4.6 mg / g dr wt）が有意に異なることを意味します集団COのそれから（4。0±0.1 mg / g dr wt）。 対照的に、平均カフェイン酸含有量は、AB、CE、PT、およびSAの母集団の2.1±0.2 mg / g dr wtから、AFの母集団の3.5±1.2 mg / gdrwtまたは3.4±2.2mg/ gdrwtに変動しました。人口SI; したがって、集団内変動（平均含有量2.7±0.8 mg / g dr wt）による有意差は観察されませんでした。これらの結果は、Wronaetal。によって観察されたフェノール代謝物の変動を補完します。 [20]、UPLC®-ESI-Q-TOFwithMSEテクノロジーを使用して分析された2015年にサンプリングされたベアベリーの8つの場所について。
2014年と2015年のベアベリーサンプルで実行された分析で得られた結果とは対照的に、アルブチン2 {{1 0}} 16サンプルで測定された内容は、放射線（rho =0 .256、p =0 .002）および最大平均気温（rho { {5}}。183、p =0。030）、したがって、年間降雨量の値と逆相関しました（rho=-0.265、p=0。002）。 これらの違いは、高度の変動にも関連していました（rho=-0.192、p=0。023）が、この負の相関は、前述の低い値によって説明されました。アルブチン1720mに位置するLB個体群からの植物の内容。 ミリセチン含有量についても同様の変動パターンが観察されました。これは、この化合物のレベルが高いほど、放射線レベルが高い場所で成長するクマコケモモと有意に関連していたためです（rho=0 .226、p= 0。{{1{{ 12}}}} 0 7）。 このフラボノイドと年間降雨量の間に正の相関が推定されたため、カテキンではアルブチンのパターンとは逆のパターンが観察されました（rho=0。398、p<0。0{{23 }}="" 1）、それに応じて、放射と最大平均温度で負の相関が検出されました（rho=""><0.001およびrho= -0.470、p=""><0.001それぞれ）。 気候要因のこの変動は、高度と緯度の両方がクマの実の葉のカテキン含有量に影響を及ぼしたことを説明しました（それぞれ、rho="0。410と0.490、p"><0.001）。 2016年にサンプリングされた29の場所に対応する植物化学、気候、および地理データを使用して実行された主成分分析では、最初の2つの成分が観測された変動の60％を説明し、これらの結果を裏付けました（図5）。="" クマコケモモのカフェー酸またはケルセチングルコシド含有量と気候的または地理的要因との間に有意な相関関係は検出されませんでしたが、ミリセチンとケルセチングルコシド含有量の間にわずかではあるが有意な相関関係があると推定されました（rho="0。184、p" {{31}="" }="" .030）およびクマコケモモのミリセチンとコーヒー酸の含有量（rho="">
観測された対照的な気候変動のパターンアルブチンクマコケモモの含有量は、この代謝物の生合成はより高い放射線と温度の条件下で増加する可能性が高いが、おそらく水不足が地中海および南部地域のA.uva-ursiの制限要因であることを示唆しています。 Del Valleetal。 [44]は、スペインのSilene littorea（ナデシコ科）のフラボノイド蓄積の緯度パターンを報告しました。緯度はUV-B放射と温度と負の相関があり、降水量と正の相関があるため、南部の個体群ではフラボノイド含有量が高いと判断されました。 全球放射は、イベリア半島の南と東でより高い発生率を持つ明確な緯度勾配を示し、雲の持続性がより高い高度でこの放射の発生率を調整するため、重要な地形効果もあります。スペインのUV放射マップ[45] UV-Bと全球放射線データの間の高い相関（r> 0。9）を参照。 この参考文献によると、より高い平均を示したベアベリーの個体数アルブチン私たちの研究の内容は、主に2403〜2451 J/m2のUV-B放射線レベルの下の領域にあります。
クマコケモモのカテキン変動に関する我々の結果は地理的パターンを示し（図5）、ヨーロッパ北部の国々からの他の植物種で行われた研究と一致しています。 フラボノイドやアントシアニンなどの特殊な代謝物の含有量が高いことが、おそらく日照時間が長く、夜間の気温が低いために、高緯度で成長する植物で報告されました[46]。 これにより、Juniperus communisの針葉の可溶性フェノール含有量は、フィンランドの個体群の緯度と高度とともに増加し[47]、3つのRibes属の果実では、緯度が高くなると10〜19パーセント高いフェノール含有量が見つかりました。 フィンランドの2つの場所で分析された栽培品種[48]。 これらの著者は、より低いフェノール含有量をより高いレベルの放射と温度に関連付けました。 2種のVaccinium（ツツジ科）の果実のフラボノイド含有量は地理的な勾配を示し、北緯ではフラボノイドの量が多かった[49,50]。
高度の変動に関連して、より高いレベルで成長している他のツツジ科の種、Callunavulgarisの個体群でより高いレベルのフラボノイドが決定されました[51]。 高度勾配は、スペインのアルニカモンタナ[52]とコナラ[53]の特殊な代謝にも影響を及ぼしました。後者の研究は、葉のフェノール類と標高の合計濃度の間に有意な正の関連性を示し、フラボノイドのみに依存する勾配であることを示唆しています。化合物は、総フェノール類の関係を推進しました。 これらの結果は、カテキン含有量パターンの推定値と一致しています。 最後に、降雨勾配は、メタボロミクスの違いが個体群の遺伝的構造と一致していたアフリカの薬用低木（Myrothamnus flabellifolia）のポリフェノール組成の有意差と関連していた[54]。
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2.2。 ゲノムサイズと配列データの分析
クマコケモモのゲノムサイズ2C値は、2.50〜3.15 pgの範囲でした（表1）。 核DNA量のわずかな違いが集団間で発見されています（クラスカル・ウォリスχ2=87。639、df=36、p=3。39×10-6）。 ボンフェローニ補正を使用したダンのテストでは、ALとSIの母集団（Z=-3.972、p=0。024）、LEとSI（Z=-4.196、p {{ 21}}。009）、およびSEおよびSI（Z=-4.236、p=0。008）。 ポンティルス（PO）の個体群は、A。uva-ursi var.crassifoliusのタイプ産地であり、その後A.uva-ursisubsp。 crassifoliusは、現在分類学的には考慮されていませんが（はじめにを参照）、他の種の個体群で得られた値の範囲内の中間値（2.88 pg）を持っています。 これまでに入手可能な唯一の情報は同じ分類群の1つのバルカン半島の個体群からのものであるため、これは種および属全体の核DNA量に関する最初の広範な個体群研究です[55]。 そこで報告されている2C値2.49pgは、ここで調査したデータセットの変動範囲の下限に位置しています。 ゲノムサイズ値と人口高度の間に相関関係は見つかりませんでした。 個人のDNA量は、アルブチン158のクマの実のデータを比較したときのコンテンツ（rho=0 .187、p=0 .018）が、ゲノムサイズと他の変数の間に他の有意な相関関係は見つかりませんでした。 この結果は、倍数化後に薬用および芳香族植物で一般的に観察される特殊な代謝物の生成の報告された増加と一致しています[29]。
rpl {{0}} trnLおよびpsbE-petN遺伝子間スペーサーの新しく生成された配列は、144 0 bpの単一マトリックスに連結された2つのマトリックス（それぞれ566および874 bpを含む）に整列されました。これらの色素体領域の変動レベルが検出されました（6つのヌクレオチド置換と4つのインデル）。 合計ハプロタイプ多様性（Hd）が0。468である10の異なるハプロタイプが見つかりました（表1）。 ほとんどの集団（21）には、ハプロタイプが1つしか含まれていませんでしたが、そのうちの5つは個体間である程度の多様性を示しました。 最も豊富なハプロタイプ1は最も高い頻度（71.4パーセント）を示し、次にハプロタイプ2（15.2パーセント）を示しましたが、残りははるかに低い頻度（0.04〜0.01パーセント）を示しました。 ハプロタイプの地理的分布を図6に示します。ハプロタイプ1は32の集団で発見され、そのうち18の集団で固定され、最南端の地域を除くすべてのサンプリングされた地域に分布しました。 ハプロタイプ2は10の集団で発見され、PRだけでなく最南端の2つの集団（HUとLV）でも排他的なハプロタイプでした。 ハプロタイプ4はピレネー山脈からの3つの集団からプライベートでしたが、ハプロタイプ8は東部イベリア半島からの2つの集団に現れました。 節約ネットワーク（図6）に示されている進化的関係に関して、ほとんどのハプロタイプは1つまたは2つの突然変異ステップによって接続されています。 ハプロタイプ1は中心位置を占め、7つのハプロタイプがそれに接続されています。
pDNAの遺伝的および化学的ペアワイズ距離行列間のマンテル検定は、遺伝的分化と測定された5つの化学成分の濃度との間に弱いが有意な相関（r=0 .301; p=0 .048）を示しました。 2016年のデータセット。 マンテル検定では、2016年にサンプリングされた25の母集団間の遺伝的距離と地理的距離（r=0。103、p=0。207）の間、またはこれらの間の化学的距離と地理的ペアワイズ距離の間に有意な相関関係は見られませんでした。 25の母集団（r=0。191、p=0。050）。 したがって、スペイン全土のクマコケモモ野生個体群についてここで報告された植物化学的変動は、他の植物に見られる系統地理学的パターンに匹敵するクマコケモモ個体群に見られる南北の遺伝的分化である、中程度のレベルのpDNAハプロタイプ変動によって補完されます（例[56–58]。このすべての均質性は、若い苗の発芽率が低く、死亡率が高いA. uva-ursi [4]のように、生殖能力の低い植物で期待されます[4]。 5つのフェノールのプロファイルから推定されたペアワイズ距離図6.5つのクマコケモモのイベリア個体群におけるpDNAハプロタイプの地理的分布。個体群コードは表S1のコードに対応し、円グラフは各個体群で各ハプロタイプを示す個体の割合を表します。長方形、teの進化的関係を示す統計的節約ネットワーク nA.uva-ursipopulationsisに見られる色素体ハプロタイプが表されています。 ハプロタイプを結ぶ線に沿った各ストライプは、この研究でシーケンスされたpDNA領域の1つの突然変異ステップを示します。pDNAの遺伝的および化学的ペアワイズ距離行列間のマンテル検定は、弱いが有意な相関を示しました（r= 0。301;p {{28 }}。048）2016年のデータセットで測定された5つの化学成分の遺伝的分化と濃度の間。 マンテル検定では、2016年にサンプリングされた25の母集団間の遺伝的距離と地理的距離の間（r=0。103、p=0。207）、またはこれらの25の母集団間の化学的距離と地理的ペアワイズ距離の間に有意な相関関係は示されませんでした（r=0。103、p=0。207）。 r=0。191、p=0。050）。 したがって、スペイン全土のクマコケモモ個体群についてここで報告された植物化学的変動は、他の植物に見られる系統地理学的パターンに匹敵するクマコケモモ個体群に見られる南北の遺伝的分化である、中程度のレベルのpDNAハプロタイプ変動によって補完されます（例：[56–58]。 A. uva-ursiのように、若い苗の発芽率が低く、死亡率が高い[4]のように、生殖能力の低い植物が期待されます。それにもかかわらず、pDNAによって示される適度な遺伝的分化は、プロファイルから推定される生化学的ペアワイズ距離と相関します。遺伝的および植物化学的変動のこのパターン（前述のように、地理的距離とは関連していませんでした）、およびゲノムサイズとアルブチン含有量の間の弱いが有意な相関は、自然のゲノム変動がフェノール化合物の収量に影響を与えることを示している可能性がありますA. uva-ursi。ただし、超可変分子m これらの系統地理学的パターンと、遺伝的および生化学的変動性との関連を裏付けるには、より広範な母集団サンプリングのアーカーが必要です。
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3.材料と方法
3.1。 植物材料
植物化学分析のために、42の個体群で成長している合計249のクマコケモモが、2014年、2015年、および2016年の秋にサンプリングされました。これは、イベリア半島におけるこの植物種の自然分布を表しています（図1および表S1）。 まず、2014年秋に、比較的狭い地域（約80×50 km）にあるスペインの10個体群（AG、AN、BA、LI、LO、PE、PÁ、SR、SC、SE）の80の植物から末端シュートを収集しました。スペイン北部にありますが、標高の広い範囲（424〜1410 m asl）にあります。 次に、2015年秋に、これらの6つの個体群（AG、LI、LO、PA、SE、およびSR）から48の植物を収集し、低緯度にある6つの個体群（AL、CH、ET、HU、LV）から46のクマコケモモを収集しました。 、およびPI）。 個体群ごとに、少なくとも5 m離れた8つの植物をサンプリングしました。ただし、HUでは6個体しか見つかりませんでした。 第三に、2016年秋に、26の新しいスペインの産地（IZ、CE、BT、MO、AA、GU、SI、AF、SA、PT、 AB、CG、OD、PS、LB、CO、LE、MA、CP、PO、MZ、AV、LC、AY、LN、およびZU）。 私たちのサンプリングは、534〜1750mの高度範囲に及びます。 全体として、42の人口は広範囲の気候条件を表しています（表S1）：最高平均気温は2-倍変動（13–26°C）を示し、年間降水量は399（ZU）から1589 mm（PT）まで変動しました。 全球放射量は4.2から5.1kWh/m2dの範囲でした。 各植物について6〜10本の末端シュート（長さ15〜20 cm）を収集して6〜15 gの健康な葉を得、その後切除し、60°Cで一定重量になるまで乾燥させました（3〜4日）。 乾燥重量を測定した後、葉を乳鉢で手動でホモジナイズし、分析するまで4°Cで保存しました。 この植物材料は、総フェノールとHPLC測定に使用されました。
フローサイトメトリー評価用の葉の材料は、合計37の集団に属する178個体の新鮮な葉から得られました（表1）。 サンプルは、上記の33の集団と、2017年春に葉が収集された4つの新しい集団（スペインのBE、JO、PR、アンドラのEN）から取得されたため、植物化学分析には含まれませんでした（図1および表S1）。 集団あたり1〜6人の個体が重複して測定されました。 DNA抽出用の葉の材料をシリカゲルで乾燥させ、室温で保存しました.35か所の合計105の植物で、DNA多様性分析を行いました（表1）。
調査した46のベアベリー個体群の植物バウチャーは、バルセロナ植物標本館、バルセロナ植物標本館BCN、バルセロナ大学植物標本館、またはバルセロナ大学植物標本館JACA、ピレナイコデエコロジア研究所に寄託されています。 CSIC）。
3.2。 葉抽出物の調製と総フェノールの測定
ベアベリーの葉の抽出物の3つの複製は、50mgの乾燥サンプルと10mLの80パーセントのメタノールを使用して調製しました。 チューブを超音波浴で30分間インキュベートした後、抽出物をろ過（0.45 mm）し、分析まで4°Cで保存しました。 総フェノール含有量は、2014年と2015年に収集されたサンプルから調製された抽出物で決定されました。わずかな変更を加えてFolin–Ciocalteumethod [60,61]に従いました：抽出物0.1 mL、メタノール0.4 mL（80％）、Folin– 0.5 mL Ciocalteu試薬と8mLの超純水を加えました。 超音波浴で5分後、1 mLのNa2CO3 20パーセント（w / v）を追加しました。 サンプルを30分間暗所に置いた後、UV-可視分光光度計（CARY 50 BIO、Varian、AgilentTechnologies）を使用して760nmでの吸光度を測定しました。 結果は没食子酸当量（GAE）で表されました。 つまり、没食子酸の検量線（40〜340 µg / g）を使用して、mg没食子酸/ gdrwtです。
3.3。 アルブチンおよびその他のフェノール代謝物の測定
クマの実の葉のメタノール抽出物のフェノール含有量は、Kinetex 5 µm-EVO C18（25 0mm×4.6mm）を備えたHPLC-UV / Visシステム（LaChrom Merck Hitachi L -7400）を使用したRP-HPLCによって定量化されました。 ）カラムと吸光度を280nmで測定。 2014年と2015年に収集されたサンプルからの抽出物は、1：10（v / v）に希釈され、メタノールとアセトニトリルの移動相が注入されました。グラジエントプログラムは、0〜5分、メタノールの25パーセントで構成されました。 5〜6分、100パーセント。 6〜10分、100パーセント、および10〜20分、再び25パーセントのメタノール。 流量は1mL/ min、注入量は20 µLでした。 これらの条件では、アルブチンは2.6分であり、相関係数r=0で、40から340µg/gまでの標準の6つの希釈で確立された検量線を使用してこの化合物の濃度を決定することができました。 9997。 2016年に収集されたサンプルからの抽出物は、次の勾配プログラムでメタノールと水の移動相を使用して分析されました。0〜5分、メタノールの10パーセント。 5〜6分、20パーセント。 6〜10分、20パーセント。 10〜11分、30パーセント。 11〜15分、30パーセント; 15〜16分、40パーセント; 16〜20分、40パーセント。 20〜21分、50パーセント。 21〜25分、50パーセント。 25〜26分、60パーセント。 26〜30分、60パーセント; 30〜31分、10パーセント; そして31〜36分、これもメタノールの10パーセントです。 これらの条件で、アルブチンと他の4つのフェノール化合物：カフェイン酸、カテキン、ミリセチン、ケルセチン-3- O-グルコピラノシド、標準の5つの希釈液（25–5 0 0 µg / mL）で確立された対応するキャリブレーション曲線を使用） 、カテキン（保持時間12。0分）で{{1 0}}。9992、カフェイン酸（保持時間13.4分）で0.9924、ケルセチン{{16}で0.9981の相関係数を示しました。 } O-グルコシド（保持時間23.4分）、およびミリセチンの0.9997（保持時間25.1分）。
メタノールとアセトニトリルはHPLCグレードで、Panreac（スペイン、バルセロナ）から購入しました。標準（純度98％以上）アルブチン、カフェー酸、没食子酸、およびフォリン-チオカルト試薬は、Sigma-Aldrich（バルセロナ、スペイン）から購入しました。 カテキンとケルセチン-3-O-グルコピラノシド標準はExtrasynthese（Genay Cedex、フランス）から購入し、ミリセチンはAlfa Aesar（Karlsruhe、ドイツ）から購入しました。
化学的決定の結果は、SPSSv。25ソフトウェアとR3.5.2を使用して分析されました。データの正規性と等分散性をテストした後、データのさまざまなセットの分散分析を実行し、分離テスト（TukeyとTamhane）または非パラメトリックテストを意味します。クラスカル・ウォリス、およびボンフェローニ補正を使用したダンの多重比較検定として。 また、ゲノムサイズを含む変数間の相関係数（データが正規分布に従うかどうかに応じて、ピアソンまたはスピアマン）を推定しました。
CISTANCHEには抗酸化効果があります
3.4。 ゲノムサイズの推定とDNAシーケンシング
クマコケモモのゲノムサイズは、Pellicer et al。で説明されている手順に従って、バルセロナ大学（CCiTUB）のCientíficsiTecnològicsセンターでフローサイトメトリーによって推定されました。 [62]。ペチュニアハイブリッドフィム。 'PxPc6'（2C= 2。85pg）を内部標準として使用しました。 標準の種子は、Plateformedecytométried'Imagerie-Gif、CNRS-I2BC（Gif-sur-Yvette、France）によって提供されました。核DNA含有量（2C）は、標準の既知のDNA含有量に未知の標本の染色された核からの蛍光シグナル、既知の内部標準およびDNA量の間の線形相関を仮定して、標的種のピーク位置（モード）および蛍光強度のヒストグラムの標準[63]。
約20mgのシリカ乾燥葉組織を、わずかな変更を加えたCTABプロトコル[64]を使用したDNA抽出に使用しました。 全DNAの品質は、NanoDrop 1000分光光度計（ThermoScientific、米国デラウェア州ウィルミントン）でチェックしました。 色素体遺伝子間領域rpl32-trnLand psbE-petN、および核リボソームDNA領域ITSは、集団あたり3人の個体について増幅および配列決定されました。 ITSの配列は、ゲノム内ヌクレオチド多型を示すいくつかの位置を除いて、105の分析された個体内で変動を示さなかった。 したがって、この核リボソームDNA領域は、さらなる分析から除外されました。 他の色素体DNA領域（すなわち、ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16;およびtrnL-trnF）もテストされましたが、変動性が低いか、シーケンスの問題があるため、破棄されました。 Vitalesetal。に記載されているように増幅手順を実施した。 [65]。 増幅されたDNAセグメントの直接シーケンシングは、Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1（PE Biosystems、Foster City、California、USA）を使用して、ABI PRISM 3700 DNAアナライザー（PE Biosystems）のUnitatdeGenòmica、CCiTUBで実行されました。 rpl 32- trnLおよびpsbE-petNシーケンスは、BioEditバージョン7.1.3.0 [66]でアセンブルされ、ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67]に合わせて調整され、手動で調整されました。 GenBankアクセッション番号を表S2に示します。
3.5。 ゲノムサイズと遺伝子解析
ノンパラメトリッククラスカルウォリス検定を実行して、母集団間の2C値の統計的に有意な差を確認しました。 ダンの多重比較検定も実行され、どの母集団がそれらの間に有意差を示したかを判別しました。 ボンフェローニ補正は、タイプIのエラー（誤検知）を最小限に抑えるために適用されました。
遺伝的多様性パラメーター（多型部位、節約情報部位、ハプロタイプの数、および総ハプロタイプ多様性）は、DnaSPv6を使用して推定されました[68]。 色素体ハプロタイプは、rpl32-trnL領域とpsbE-petN領域の両方を含む結合データセットで決定されました。インデルはFastGapv.1.2[69]で成文化され、単一変異イベントとして扱われました。 ハプロタイプ間の進化的関係は、PopArt[71]で実装されたTCS[70]を使用して構築された節約ネットワークに基づいて推測されました。 ハプロタイプ間の単一置換に起因する差異の最大数は、95％の信頼限界で計算されました。
遺伝的データと化学的データの関係を分析するために、マンテル検定が実行されました。 まず、2016年に収集された5つのフェノール成分（すなわち、アルブチン、カテキン、カフェー酸、ケルセチン、ミリセチン）。 R Commanderを使用してこれらのデータを標準化し[72]、続いて、ユークリッド距離に基づいて関数「Dist」onRを使用して標準化された行列から導出された化学距離を計算しました。 次に、DnaSP v6を使用して、25の集団間でNeiの集団遺伝学的ペアワイズ距離行列を計算しました。 最後に、Rのパッケージ「geodist」を使用してこれらの母集団間のペアワイズ地理的距離を計算しました。距離行列間のペアワイズ相関は、Rパッケージ「vegan」で利用可能な関数マンテルを使用した10、000順列のマンテル検定を使用して計算されました。 73]。
4.結論
分析されたすべてのクマコケモモ植物はアルブチン7パーセントを超える内容; したがって、この植物材料はハーブ製剤に適しています。 私たちの分析は、パレホらによって言及されたもの（最大9パーセント）よりも高いアルブチン含有量を明らかにしました。 [40]は、ピレネー山脈北東部の1580〜2030 mにある4つの集団を分析し、集団間のアルブチン含有量の差が小さいことを検出しました。 さらに、ここで決定された値のほとんどは、ポーランドでの栽培用に選択された植物材料の範囲内にあり[74]、高値と一致しています。アルブチンドイツで栽培する植物を選択する際にSonnenscheinとTegtmeier[42]によって報告されたスペインのクマの実の葉のサンプルの含有量。 A. uva-ursiのエリート遺伝子型は栄養繁殖する可能性がありますが、取得したクローンのほとんどはフィールドの確立中に失敗し、これらのリソースの利用が制限されていました。 また、スペインのクマコケモモ個体群における3つのフラボノイド（カテキン、ミリセチン、ケルセチングルコシド）とカフェイン酸の含有量の既存の変動、および緯度と高度に相関する気候要因（主に地球規模の放射線と降雨）についても説明しました。勾配、その変化に影響を与えます。 同時に、イベリアのA. uva-ursiで決定されたハプロタイプとゲノムサイズの変動性のレベルが低いにもかかわらず、集団の遺伝的および細胞遺伝学的分化は、植物化学的多様性と弱くしかし有意に関連していた。 全体として、これらの結果は、野生個体群の植物に見られる種内の植物化学物質の変動性を説明するために、遺伝的要因と非生物的要因の両方の影響を考慮しなければならないことを強調しています。
ホンオニクの効果
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