概要

Dendrobium loddigesii の粉末茎のエタノール水抽出物から、3 つの-7-O-エチル-9-O-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル -ジアシルグリセロール (1)、(R){{ を含む 3 つの新しいフェノール類が得られました。 7}},5,4′-トリヒドロキシ-3,3′, -トリメトキシビベンジル(2)および(S)-5,5′,7-トリヒドロキシ-3′,4′ -ジメトキシファバノン (3) と 11 の既知の類似体。 それらの構造は広範な分光分析によって決定されました。 天然の抗酸化物質、美白剤、老化防止剤を特定するために、これらのフェノール類の 1,2-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル (DPPH) ラジカルを除去する能力、チロシナーゼ生成を阻害する能力、およびヒト真皮線維芽細胞-成人（HDFa）アッセイによるコラーゲン産生を刺激する能力。 化合物 1、4 ～ 8、13、および 14 は顕著な DPPH ラジカル消去活性を示し、化合物 10 はチロシナーゼ阻害活性 (IC50 37.904 ug/mL) を示し、化合物 9 は顕著なコラーゲン産生を示したことがわかりました。 EC50値は3.182μg/mL。 これらの結果は、D. loddigesii のフェノール成分が抗酸化剤、美白剤、および/または老化防止剤の候補である可能性があることを示唆しています。

関連する研究によると、カンクン一般的なものですハーブそれは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られています。 その主成分は、シスタノシドなど様々な効果があります。抗酸化物質, 抗炎症薬、 と免疫機能の促進。 シスタンシュとのメカニズム美白抗酸化作用にありますシスタンケ配糖体。 人間の皮膚のメラニンは酸化によって生成されます。チロシン酸化反応はチロシナーゼによって触媒され、酸化反応には酸素の関与が必要であるため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な要素になります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らすことができます。メラニンの生成を抑制します。

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グラフィックアブストラクト

1 はじめに

デンドロビウム属 (ラン科) には世界中で約 1500 種が含まれており、そのうち約 80 種が中国に生育しています [1]。 この属のいくつかの植物の茎は「Shi-Hu」として知られており、慢性萎縮性胃炎、皮膚の老化、発熱、心臓血管疾患、および慢性萎縮性胃炎の治療のための伝統的な中国医学および民間療法の両方として何千年も使用されてきました。体液の生成を促進する強壮剤 [2]。 この属に関する以前の研究により、一連の多糖類、フェノール化合物、アルカロイド、セスキテルペノイド [1、3-5] が単離され、その一部は抗炎症 [6]、抗菌 [2]、抗酸化物質などのさまざまな生物活性を持っています。 [7]、抗腫瘍 [8]、抗血小板凝集 [9]、免疫調節 [10]、および抗インフルエンザ A 活性 [11]。

Dendrobium loddigesii は、広西チワン族自治区、貴州省、雲南省など中国南西部に広く分布する着生多年草である [12]。 その茎は民間療法で胃炎、発熱、めまいの治療に応用されてきました[13]。 この属からの構造的に多様で生物学的に活性な天然産物の探索を続ける [1、5、14-17] 中で、この植物種からの薬理学的に活性な成分の詳細な調査がここで行われました。 その結果、D. loddigesii の茎の 80% エタノール抽出物から、3 つの新しいフェノール化合物 (1 ～ 3) と 11 の既知のフェノール化合物 (図 1) が単離されました。 これらの化合物の単離、構造解明、および生物学的評価がここに示されています。

2 結果と考察

白色固体として得られた化合物 1 は、m/z 389.1602 [M-H]- の (-)-HRESIMS イオンによって決定される分子式 C21H26O7 を与えました (C21H25O7 の計算値、389.16{{ 28}}6) 9 度の不飽和。 1 の 1 H NMR スペクトルには、δH 6.85 (1H, d, J=1.7 Hz)、6.75 (1H, d, J=8.0 Hz)、6.68 (1H) に 7 つの芳香族プロトンが含まれています。 、dd、J = 8.0、1.7 Hz)、7.01 (2H、d、J = 8.5 Hz)、および 6.68 (2H、d、J = 8.5 Hz)、これは、1,3,4-三置換ベンゼン環と1,4-二置換ベンゼン環の存在を示唆しています。 その 13 C NMR スペクトルは、2 個のメチル (1 個のメトキシ)、4 個の脂肪族メチレン、9 個のメチン (2 個の sp3 、7 個の sp2 )、および 6 個の第四級炭素 (1 個のカルボニル、5 個の酸素化された 3 個を含むオレフィン) を含む 21 個の炭素共鳴を示しました。 H-7/C-1 (δC 131.6)、C-2 (δC 111.7)、C-6 (δC 121.4)、C の HMBC 相関 (図 2) -8 (δC 74.2)、および C-10 (δC 65.3)。 H-9/C-7 (δC 83.8) および C-8 (δC 74.2)。 H-10/C-11 (δC 15.6); 3-OMe (δH 3.81)/C-3 (δC 149.1)、H-7/H-8/H2-9 および H{{ 1 H-1 H COSY スペクトル（図 2）からの 87}}/H3-11 は、7-O-エチルグアイアシルグリセロールの存在を示しました [18]。 シリンジ - グリセロールおよびジアシルグリセロール誘導体の場合、J7,8 はエリスロ異性体では約 5 Hz、3 つの異性体では約 7 Hz であることが報告されています。 したがって、化合物 1 は J7,8 (6.5 Hz) を持つ 3 つの異性体であると考えられました [18]。 H-7’ (δH 2.79, t, J = 7.5 Hz)/C-8’ (δC 37.1)、C-1’ (δC 132.7)、C-2’、6’ (δC 130.2) および C-9’ (δC) の HMBC 相関174.6)、H-8’ (δH 2.59、t、J = 7.5 Hz)/C-7’ (δC 31.0)、C-1’、および C-9’、および H-8’/H-7’ の COSY クロスピークを示しますp-ヒドロキシクマリン酸の存在[19]。 上記の証拠に基づいて、1 は 7-O-エチルグアイアシルグリセロール部分とエステル結合を介した p-ヒドロキシ-クマリン酸を有することが提案されました。 H-9 から C-9' への HMBC 相関は、エステル結合が C-9 と C-9' の間にあることを示唆しました。 したがって、1 の構造は次のように決定されました。

(R){{0}},5,4'-トリヒドロキシ-3,3',-トリメトキシビベンジル(2)を白色固体として得た。 2 の HRESIMS スペクトルは、m/z 319.1180 [M-H]- (C17H19O6 の計算値、319.1187) に 8 度の不飽和を有する準分子イオン ピークを示しました。 2 の 1 H NMR スペクトルは、δH 3.75 (3H, s)、3.70 (3H, s)、および 3.17 (3H, s) に 3 つのメトキシル基を示しました。 δH 4.13 (1H, t, J=6.8 Hz, H-) に 1 つの酸素化メチン プロトン。 δH 2.73 (1H, dd, J=13.5, 6.9 Hz) および 2.96 (1H, dd, J=13.5, 6.9 Hz) の 2 つのメチレン シグナル。 5 つの芳香族プロトンは、δH 6.28 (1H, d, J=1.8 Hz) および 6.34 (1H, d, J{{ 60}}.8 Hz)、δH 6.49 (1H, d, J=2.0 Hz)、6.62 (1H, d, J=8.0 Hz) および 6.52 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz)。 2 の 13CNMR および DEPT スペクトルは、3 個のオキシメチレン、1 個のメチレン、1 個の酸素化メチン、および 12 個の芳香族炭素 (5 個は酸素化) を示しました。 その NMR データ (表 1) とデンドロカンジン C [20] の NMR データ (表 1) を比較すると、3’-OMe および H-5’ からC-3’ (δC 148.4)。 さらに、3-OMe と H-2/C-3 (δC 149.5) の複数の HMBC 相互作用 (図 2)。 -OMe/C- (δC 86.9) は、それぞれ C-3 および C-2 に他のメトキシル基があることを示唆しました。 C- での絶対配置は、無葉状 D [훼] 20 D –20.3、MeOH と同様に、負の旋光度 ([훼] 26 D –12.46) に基づいて R として決定されました [15]。 したがって、２の構造は図のように決定された。

(S){{0}},7,5'-トリヒドロキシ-3',4'-ジメトキシファバノン (3) は黄色の非晶質粉末として得られ、分子 C17H16O7 (1{{69} } 水素欠乏の指数) m/z 331.0819 [M – H]- (計算値 331.0823) の (−)-HRESIMS イオンによる。 206 および 294 nm での UV 吸収極大は、フラバノンの存在を示しています [21]。 1 H NMR スペクトル (表 1) は、δH 5.29 (1H, dd, J=12.7, 3.1, H-2)、3.04 (1H, dd, J=17.1, 12.7, H-3 ax)、および 2.71 (1H, dd, J=17.1, 3.1, H-3 eq)、4芳香族プロトン δH 5.87 (1H, d, J=2.2, H-6), 5.91 (1H, d, J=2.2, H-8), 6.62 (1H, d, J=2.0, H-2’) および 6.61 (1H, d, J=2.0, H-6’)、2 つのメトキシル基 δH 3.83 (3H, s) および3.77 (3H、秒)。 13C NMR および DEPT スペクトル (表 1) には、2 個のメトキシ、1 個のメチレン、1 個のメチン、1 個のカルボニル炭素、および 12 個の芳香族炭素を含む 17 個の炭素の共鳴が含まれています。 NMR データの包括的な分析により、ジヒドロ トリシンの OH-4' および OCH3-5' 共鳴が 3 で転置されていることを除いて、その平面構造はジヒドロ トリシン [22] の平面構造と密接に関連していることが示されました。これは、HMBC 交差によって確認されました。 H-2’、H-6’、OCH3-4’ から C-4’ (δC 137.7)、H-6’ から C-5’ (δC 151.8) のピーク (図 2)。 C-2 の絶対配置は、その旋光度における負の比旋光度値 (-46.64、MeOH) に基づいて S 型であると仮定されました [23]。 したがって、化合物 3 の構造は、示されているように明確に割り当てられました。

11 の既知の化合物は、トレピデーション 4 [24]、メスカリン 5 [25]、4,5,4'-トリヒドロキシ- 3、3'-ジメトキシビベンジル 6 [26]、4',5- であることが確認されました。ジヒドロキシ-3,3'-ジメトキシビベンジル 7 [27]、トリスチン 8 [28]、バタタス in III 9 [27]、3,5,3'-ヒドロキシビベンジル 10 [29]、無葉状 C 11 [15]、分光分析によるデンティフォーム A 12 [30]、ジヒドロコニフェリル ジヒドロ-p-クマレート 13 [31]、p-ヒドロキシフェニル トランスフェルラ酸 14 [32] のスペクトル データと文献の比較。

フェノール化合物は人間の食事に不可欠な部分であり、その強力な鎖切断作用により強力な抗酸化物質として知られており、抗酸化活性に直接寄与している可能性があります[33]。 DPPH ラジカル消去アッセイは、抗酸化活性を評価するために使用される最も一般的で比較的迅速な方法の 1 つです。 DPPH ラジカルに水素原子を供与して、DPPH の還元型を生成できる化合物は、潜在的な抗酸化剤と考えられます。 すべての化合物は、DPPH ラジカル消去活性について評価されました。 今回の結果 (表 2) は、大部分のフェノール化合物 (1、4 ～ 8、13、および 14) が 100 ug/mL で 89.411 ～ 94.278 パーセントの範囲の除去能力を持つ顕著な活性を示したことを示しています。

一方、チロシナーゼは銅含有酵素であり、メラノサイトにおけるメラニン生合成経路の制御において重要な役割を果たしている[34]。 したがって、チロシナーゼ阻害剤は、色素沈着過剰症および皮膚美白剤の開発のための化粧品または医薬品の重要な成分となった。 本研究では、すべての分離株のチロシナーゼ阻害活性を評価しました (表 2)。 美白剤とされるコウジ酸を陽性対照として使用した。 3,5,3'-ヒドロキシビベンジル (10) は、37.904 ug/mL の IC50 値で顕著な阻害活性を示しました。 アフィラル C (11) は中程度の阻害を示しました (IC50、152.56 ug/mL)。 残りの化合物はすべて、200 ug/mL までの濃度では不活性でした。 この研究では、化合物 10 および 11 がメラニン生合成関連の皮膚疾患の治療の潜在的な候補となり得ると結論付けることができます。

この種が皮膚の老化に薬用に使用されていることを考慮すると、コラーゲンは皮膚の強度と弾力に不可欠であり、その劣化は老化に伴うしわにつながるためです[35]。 したがって、すべての化合物は、HDFa でのコラーゲン生成に対する効果についても意図的に評価されました。 結果(表2)は、化合物9がHDFaコラーゲン生成活性(EC50 3.182μg/mL)を有意に刺激することを示した。 化合物 6 および 7 はより弱い活性を示し、10 ug/mL でそれぞれ 33.062 パーセントおよび 29.157 パーセントのコラーゲン生成を示しました。 今回の結果は、D. loddigesii の民族薬理学的使用を裏付けるだけでなく、火傷や潰瘍などのコラーゲン欠乏に関連する疾患を発症するための信頼できる構造テンプレートも提供しました。

3 実験的

3.1 一般的な実験手順

3.2 植物材料

D. loddigesii の茎は、2014 年 9 月に中華人民共和国雲南省文山市から収集され、Hong Yu 教授（雲南大学、中華人民共和国昆明）によって同定されました。 引換券標本（番号 20,140,​​829）は、中国科学院昆明植物研究所、中国西部の植物化学および植物資源の国家重点研究所に寄託されています。

3.3 抽出と分離

D. loddigesii の乾燥および粉末化した茎 (10.2 kg) を、室温下で 80 パーセントのエタノールで 3 回抽出し、減圧下で濃縮しました。 次に、残渣をH2Oに懸濁し、EtOAcで分配してEtOAc画分(220g)を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、石油エーテル/アセトン(15:1から{ {110}}:1) により 22 のフラクション (Fr.1 ～ 22) が得られます。 Fr.11 (6 g) を、CHCl3/MeOH (300:1) で溶出するシリカゲル CC に供し、続いて MCI カラム (MeOH/H2O 勾配、60:40 ～ 95:5) およびシリカゲル CC (CHCl3/ MeOH、200:1）を用いて12（4 mg）を得た。 Fr.13 (850 mg) を MCI カラム (MeOH/H2O、60:40 ～ 95:5) で分離し、5 つの画分 (Fr.13.1 ～ Fr.13.5) を得ました。 Fr.13.4(150mg)から、HPLC調製(MeOH/H2O、60:40)により化合物4(3mg)および5(5mg)が得られた。 Fr.16(19g)をCHCl3/MeOH(100:1〜20:1)で溶出するシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーにかけて、6つのサブフラクション(Fr.16.1〜Fr.16.6)を得た。 Fr.16.4 (2.3 g) を MCI カラムにアプライし、MeOH/H2O (50:50 ～ 100:0) で溶出し、次に Sephadex LH-20 (MeOH/H2O、90:10) のカラムでさらに分画しました。収量７（７１６ｍｇ）および１３（３９ｍｇ）。 Fr.16.4と同じ条件を使用することにより、Fr.16.6(240mg)から化合物9(7mg)を得た。 Fr.18 (10 g) をシリカゲル CC (CHCl3/MeOH、100:1 ～ 20:1) で分離し、次に MCI (MeOH/H2O 勾配、50:50 ～ 100:0) および Sephadex LH に通しました。 ９６｝｝（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ、９０：１０）カラムに通して、３（２５ｍｇ）および１１（４ｍｇ）を得た。 Fr.19 (20 g) を、MeOH/H2O (30:70 ～ 100:0) で溶出する MCI カラムに供し、7 つの画分 (Fr.19.1 ～ Fr.19.7) を得ました。 Ｆｒ．１９．５（２．３ｇ）をシリカゲルカラム（ＣＨＣｌ ３ ／ＭｅＯＨ、３０：１）を繰り返して分離して、８（１５ｍｇ）および１０（７ｍｇ）を得た。 Fr.19.6 (4.3 g) をシリカゲルカラム (CHCl3/MeOH、30:1) で分画し、5 つの画分 (Fr.19.6.1 ～ Fr.19.6.5) を得た。 Fr.19.6.1(1.2g)をシリカゲルカラム(CHCl3/MeOH、30:1)に供し、HPLC(MeOH/H2O、45:55)により精製した後、1(15mg)を得た。 Fr.19.6.3 (540 mg)をSephadex LH-20カラムにアプライし、MeOH/H2O (90:10)で溶出し、次いでセミ分取HPLC (MeOH/H2O、45:55)でさらに精製した。 2 (6 mg) と 6 (5 mg) を提供します。 Fr.20 (12 g) を MCI ゲル (MeOH/H2O、30:70 ～ 100:0) クロマトグラフィー工程に適用し、次にシリカゲル CC (CHCl3/MeOH、30:1) に処理して 14 (21 mg）。三{{0}}O-エチル-9-O-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオニル-ジアシルグリセロール(1): 白色固体。 [ ]D 26 – 3.72 (c 0.51、MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203 (4.53)、225 (4.17)、280 (3.66) nm。 IR (KBr) νmax 3426、1727、1516、829 cm−1; 1 Ｈおよび 13 Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ 3 ＯＤ）、表１を参照； ESIMS m/z 389 [M-H]-、HRESIMS m/z 389.1602 [M-H]- (C21H25O7 の計算値、389.1606)。

(R)-4,5,4'-トリヒドロキシ-3,3',-トリメトキシビベンジル (2): 白色非晶質粉末。 [ ]D 26 –12.46 (c 1.07、MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 204 (4.59)、286 (3.75) nm; IR (KBr) νmax 3418、1607、1517、1455、1434、796 cm−1; 1 Ｈおよび 13 Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ 3 ＯＤ）、表１を参照； ESIMS m/z 319 [M-H]-、HRESIMS m/z 319.1180 [M-H]- (C17H19O6、319.1187 の計算値)。

(2S)-5,7,3ʹ-トリヒドロキシ-6,4,5-トリメトキシファボン (3): 黄色の非晶質粉末。 [ ]D 26 – 46.64 (c 0.46、MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (4.70)、294 (4.17) nm; IR (KBr) νmax 3335, 2940, 1641, 1514, 1462, 1345, 1434, 1182, 1091, 998, 833 cm−1; 1 Ｈおよび 13 Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ 3 ＯＤ）、表１を参照； ESIMS m/z 331 [M-H]-、HRESIMS m/z 331.0819 [M-H]- (C17H15O7 の計算値、331.0823)。

3.4 DPPH ラジカル消去活性アッセイ

フリーラジカル消去活性アッセイは、いくつかの変更を加えた以前の方法 [36] に従って実行されました。 簡単に説明すると、30 μL サンプル (1000 ug/mL、エタノールに溶解) と Trolox (1 mM) を 270 μL DPPH 溶液 (100 μM、エタノールに溶解) に加えました。メタノール)、それぞれ。 反応は、96- ウェルマイクロプレート上で 37 度で 1 時間進行しました。 次に、515 nm で吸光度を読み取り、次の式を使用して総ラジカル消去活性のパーセンテージを計算しました: 阻害パーセント =[(A0 − A1)/A0] × 100 パーセント、ここで、A0 は、サンプルなしの DPPH (対照反応)、A1 はサンプルとともにインキュベートされた DPPH の吸光度です。 すべての試験は 3 回実施し、Trolox を陽性対照剤として使用しました。

3.5 キノコチロシナーゼ阻害アッセイ

チロシナーゼ活性阻害は、以前に記載された方法[36]にいくつかの修正を加えて分光測光的に測定した。 簡単に言うと、異なる濃度の試験化合物を 10 パーセントの DMSO で調製しました。 各サンプル溶液（20 μM）をL-Dopa（1.25 mM）と混合し、970 μLの0.05 mMリン酸ナトリウム緩衝液（PBS、 pH 6.8）を試験管に入れます。 マッシュルームチロシナーゼ(25 U/mL)を添加することにより反応を開始した。 反応混合物を室温で５分間インキュベートした。 混合物中のドーパクロムの量は、490 nm での各ウェルの吸光度を測定することによって決定されました。 コウジ酸をポジティブコントロールとして使用した。 チロシナーゼの阻害率は次の方程式に従って計算されました: 阻害率=[(A0−A1)/A0] × 100 パーセント、ここで A0 は試験化合物を含まないドーパクロムの吸光度 (対照反応)、A1は、試験化合物とともにインキュベートされたドーパクロムの吸光度です。

3.6 HDFa アッセイによるコラーゲン生成

謝辞 このプロジェクトは、雲南省科学技術局 (番号 2017ZF003-04、2015HB093、および 2019HA001) によって財政的に支援されました。 著者らは、すべてのスペクトルの測定について、中国科学院昆明植物研究所、中国西部の植物化学および植物資源の国家重点研究所の分析グループのスタッフに感謝します。

倫理基準の遵守

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参考文献

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