Cistanche Tubulosaからのフェニルエタノールグリコシドは、肝星細胞の活性化を抑制し、潜在的な抗肝線維症剤としてTGF -01/smadのシグナル伝達経路の伝導をブロックします
Mar 05, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You、Long Ma、Jun Zhao、Shi-Lei Zhang、Tao Liu
概要： カンカニクジュヨウ免疫を調節するために広く使用されている伝統的な中国の漢方薬であり、フェニルエタノイド配糖体（CPhGs）は、このアクティビティを担当する主要なコンポーネントの1つです。 以前の研究では、ラットのウシ血清アルブミン（BSA）誘発性肝線維症に対するCPhGの予防および治療効果が示されています。 この研究の目的は、CPhGとモノマーの抗肝線維症効果を評価することでした。エキナコシドとアクテオシド肝星細胞（HSC）の活性化を阻害し、トランスフォーミング増殖因子-p1（TGF-p1）/ smadのシグナル伝達経路の伝導をブロックし、それらがinvitroでの肝保護活性であることを確認します。 HSC増殖は、CPhG（100,50 ^ g / mL）/エキナコシド（500,250,125 ^ g / mL）/アクテオシド（6、3 ^ g / mL）で処理した後、明らかに阻害され、IC50値は119.125,520.345および6.999 g / MTTアッセイではそれぞれmL。 異なる濃度のCPhG/エキナコシド/アクテオシド乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）測定によると、HSCの細胞毒性には影響しませんでした。 異なる濃度のCPhG/エキナコシド/アクテオシドHSCにおけるsmad7のmRNAレベルとタンパク質発現を増加させ、smad2、smad3のmRNAレベルとsmad2、phospho-smad2（p-smad2）、smad3、phospho-smad3（p-smad3）のタンパク質発現を減少させました。 要約すると、これらの結果は、CPhGs /エキナコシド/アクテオシドTGF-p1 / smadのシグナル伝達経路の伝導をブロックし、HSCの活性化を阻害する可能性があります。カンカニクジュヨウしたがって、肝硬変の治療のための潜在的な漢方薬である可能性があります。
キーワード： カンカニクジュヨウ; からのフェニルエタノール配糖体Cistanche（CPHG）;エキナコシド; アクテオシド; 肝星細胞（HSC）; TGF-p1 / smad
1.はじめに
増殖性および線維形成性になり、その後ECMを蓄積し、最終的に線維形成性筋線維芽細胞様細胞に分化します。 トランスフォーミング成長因子-.1（TGF-p 1）は、主要な線維形成促進メディエーターであると考えられています。 TGF-＆1に関連するシグナル伝達経路は肝線維症の重要なメカニズムであり、主にsmad依存性およびsmad非依存性シグナル伝達を含み、smad依存性シグナル伝達経路はTGF-p1シグナル伝達の主要チャネルであると考えられています。 したがって、TGF-p1 / smadシグナル伝達経路の遮断は、コラーゲン産生を抑制し、最終的に肝線維症を軽減することができます。これにより、この経路は、近年の抗肝線維症薬研究の重要な標的となっています。
肝線維症の世界的な発生率が高いにもかかわらず、一般的に受け入れられている抗線維形成療法は利用できません[2-4]。 伝統的な中国の漢方薬（TCHM）は、肝硬変の管理と予防に治療薬として使用できるものがあるため、肝障害の治療に非常に興味深いものです。 現在、多くの研究は、何千年もの間TCHMとして使用されてきた潜在的な抗線維形成薬に焦点を合わせています[5]。
Cistanche tubeulosa W（ハマウツボ科）fa寄生植物は、中国の新疆ウイグル自治区南部で広く栽培されています[6]。 人々は腎臓を活性化し、血液に栄養を与え、腸をリラックスさせ、副作用なしに老化を遅らせるためにそれを使用し、中国薬局方に正式にリストされています[7]。 カンカニクジュヨウには、フェニルエタノイド配糖体（CPhG）、イリドイド、多糖類など、さまざまな有効成分が含まれています。 C. tubeulousの多くの有効成分の中で、多くの生物活性（抗酸化、抗疲労、放射線耐性など）を示すCPhGは、この植物の主な特徴的な成分です。 近年、CPhGisは過剰なヘント肝保護効果を有し、樹木ラジカルを除去し、肝膜を保護し、免疫調節効果、アポトーシスの阻害、B型肝炎表面抗原（HBs Ag）およびB型肝炎の発現の阻害を示すことができると報告されています。 e抗原（HBeAg）およびB型肝炎ウイルス（HBV）DNA複製活性など。HBVDNAレベルは、ウイルス複製活性を直接反映する最も信頼性の高い指標であり、慢性HBV感染の自然史を決定する重要な要素です。 oP抗ウイルス療法の効果を監視し、急性および慢性HBV感染の予後を評価します。 HBVの血清学的検出指標には、主にHBsAg、HBeAgなどが含まれます[8-11]。 ただし、CPhGsの抗肝線維症効果に関する文献報告はほとんどありません。 以前の研究では、ラットのウシ血清アルブミン（BSA）誘発性肝線維症に対するCPhGの予防および治療効果が示されていますが、CPhGとその主要モノマー（エキナコシドおよびアクテオシド、図1）の抗線維形成活性はinvitroで評価されていません。
有機カンカニクジュヨウ
2.結果
2.1。 CPhGの定量的決定
のCPhGカンカニクジュヨウITwoフェニルエチルアルコール配糖体を含む：エキナコシドとアクテオ側、およびCPhGのそれらの含有量はHPLC分析（図1）によって42.71パーセント土0。42パーセントと14.27パーセント土0。18であることが検出されました。それぞれパーセント。
2.2。 HSC-T6に対するCPhG、エキナコシドおよびアクテオシドの阻害活性
CPhG、エキナコシドおよびアクテオシド（62.5-500卩g/ mL）は、濃度依存的にHSCの細胞生存率を阻害しました。 CPhGとアクテオシドはHSC細胞に対して顕著な阻害活性を示し、細胞増殖活性（IC50）値の50％阻害はそれぞれ119.125昭/mLと6.999昭/mLでした。 エキナコシドは中程度の阻害活性を示しました（IC50,520.345昭/ mL;表1および図2）。
2.3。 CPhGの細胞毒性、HSCでのEchinacosideおよびActeorida
すべての細胞に存在するストブル細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）は、原形質膜が損傷すると細胞培養上清に急速に放出されます。 培養上清中の酵素活性は、溶解したセルフの割合と相関しています[12]。 表2に示すように、C PhG、エキナコシド、アクテオシドの異なる濃度で処理した場合、LDH活性は細胞制御グループと比較してわずかな増加を示しましたが、その差は統計的に有意ではありませんでした（p> 0 .05 ）、ほとんどの細胞膜がその完全性を維持していることを示しており、HSCでのCPhG、エキナコシド、およびアクテオシドの阻害は、非特異的な細胞毒性によるものではありません。
2.4。 TGF- ^ iによって誘発されるHSC増殖に対するCPhG、エキナコシドおよびアクテオスデの効果
HSCの増殖、活性化、分化はさまざまな要因によって調節されています。 肝硬変に関与するさまざまな要因の中で、TGF {{0}}は、HSCを活性化し、筋線維芽細胞の分化を促進し、ECM合成を増加させ、ECM分解を阻害し、ケモカインを放出するため、最も重要であると考えられています。肝硬変に関与するサイトカイン[13]。 この研究では、対照群を除いて、静止HSCをin vitroでTGF-P1で刺激して、初期肝線維症の形成をシミュレートし、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドがTGF-pに及ぼす影響を調査しました1- HSC増殖を誘発した。 表3に示すように、対照群と比較して、TGF -61群はHSCの増殖を有意に促進しました（p<0。01）。 tgf-p1グループと比較して、tgf-p1とcphg（tc）（5="" 0、1="" 00卩g/ml、p=""><0.05）、tgf {{18}="" }プラスエキナコシド（te）（125、250、500卩g="" ml、p=""><0.05）、tgf-p1プラスアクテオシド（ta）（3.0、6.0卩g ml、p=""><0.05）はすべて、 tgf-|3="">
2.5。 CPhG、オクマコシド、およびHSCへのアクテアシド介入後のsmad2）smad3およびsmad7mRNAの発現
Smad3とsmad2はTTGF-pシグナル伝達経路の重要な下流エフェクターであり[14,15]、smad7はsmadシグナル伝達の阻害剤です。 理論的には、smad7の発現の増加またはsmad2 / smad3の発現の減少は、TGF-p 1/smadのシグナル伝達経路の伝導をブロックする可能性があります。 図3に示すように、リアルタイム定量的PCR分析では、TGF-|31グループと比較して、smad2とsmad3のmRNA発現は低いレベルを示し、smad7はコントロールグループで高いレベルを示しました。 TC（25、5 0、75,1 0 0|dg / mL）グループでは、smad2のmRNAレベル（p<0。{{37 }}="" 5）およびsmad3（p=""><0.01）は、tgf-pf群と比較して有意に減少し、対照群と同様でした。 しばらくの間、smad7のmrnaレベルはtc（50、75,100卩g="" ml）グループで有意に増加しました（それぞれp=""><0.05、p><0.05、p><0.01）。 でも;="" smad7の発現は、tgf-p1グループと比較してtc25卩g/="">
平均して、TGF-p1グループと比較して、smad2およびsmad3 mRNAの発現はTEで有意に減少しました（62.5、125、25 0、5 00卩g / mL）グループ（p<0。01）、およびsmad7 mrnaの発現はte（125、250,500昭/="" ml）グループ（p=""><0.01）で有意に増加しました（図4） 。="" 同様に、ta（0.75、1.5、3.0、6.0="" ^="" g="">
2.6。 HSCのTGF-^ i / smadシグナル伝達経路に対するCPhG、エキナコシド、およびAc）エオシドの影響
TGF-p 1 / smadシグナル伝達経路は、smad2、smad3、phospho-smad2（p-smad2）、phospho-smad3（p-smad3）、およびsmad7に依存します。ここで、p-smad2、p-smad3はsmad2の活性化型です。 smad3。 この研究では、omad2、smad3、p-smad2、p-smsd3、およびsmad7のタンパク質レベルを分析しました。 ウエスタンブロット分析は、TGF-p1によるsmad2、smad3、p-smad2、p-smad3レベルの増加を検出し、CPhG、ecヒナコシドおよびアクテオシドによるこれらの増加の阻害を検出しました。 一方、wesiernブロット分析では、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドによってアップレギュレーションされたsmad7レベルが明らかになりました。 （図6〜8）。
図6に示すように、c on2rolグループと比較して（smad2、smad3、p-smad2、p-smad3のタンパク質発現は有意に増加し、smad7タンパク質発現はTGF-p1グループで減少しました。TC（25 、5 0、75、100昭/mL）薬物グループ、smad /（図6A）、p-smad2（図6B）、smad 3（図6C）、p -smad3 （図6D）発現はTGF-p1グループよりも有意に低く（卩<0.01）、smad7（図6E）タンパク質発現はTGF-S1グループよりも高かった（p <0.01）（図6）。
同時に、smad 2、smad3、p-smad2、p-smad3、およびsmad7タンパク質の発現は、HSCへのエキナコシドおよびアクテオシドの介入後に測定されました。 図7および8に示すように、smad2、smad3、p-smad2、およびp-smad3タンパク質の発現レベルは有意に阻害されました（p<><0。01 ）、smad7タンパク質の発現レベルはtgf-p="" 1グループと比較して上昇しました（p=""><>
3.ディスカッション
肝硬変は、世界中の罹患率と死亡率の主要な原因の1つですが、現在この状態で利用できる治療オプションは非常に限られているため、肝硬変の発症を防ぐための治療的介入の潜在的なターゲットを探すことが非常に重要です。 16]。 最近、研究者は、さまざまな漢方薬が抗線維化効果の肝保護を持っていることを発見しました。 Fufang Biejia Ruanganピル[17]やXiao-chai-hu煎じ薬（日本ではしょうさいこ）[18,19]などの多くのTCHMは、何千年もの間、中国、韓国、日本で肝線維症の治療に広く使用されてきました。 カンカニクジュヨウには、CPhG、イリドイド、多糖類などのさまざまな有効成分が含まれています。 カンカニクジュヨウの有効な材料ベースの1つとして、CPhGは優れた肝保護活性を持っていますが、GPhCとその関連化合物の抗線維化効果に関する情報は限られています。 この研究では、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドが、invitroで潜在的な抗肝線維症剤としてTGF-p1/ snaadのHSC活性化を抑制し、シグナル伝達を遮断する方法を調査しました。
あらゆる病因の肝障害は、最終的にHSCの活性化につながり、HSCは線維形成性筋線維芽細胞様細胞への分化転換を起こします[20]。 つまり、筋線維芽細胞は
HSCの活性化と増殖に由来し[21]、肝線維症形成のメディエーターと見なされています。 このため、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドに曝露されたHSCの細胞生存率を比較するためにinvitro試験を実施しました。 結果は、HSCに対するアクテオシドの阻害効果が最も強く、CPhGの効果がエキナコシドの効果よりも優れていることを示した。 CPhG、エキナコシドおよびアクテオシド薬用血清はすべて、用量依存的にHSC増殖を阻害しました。
LDHは生細胞の細胞質酵素であり、通常の状況では細胞膜に浸透することはできません。 細胞が損傷すると、膜の透過性が高まり、LDHが細胞の外部に放出されます。 通常、LDHは細胞損傷の程度を検出できます[{{0}}]。 調査では、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシド薬用血清のLDH活性は、細胞対照群と比較してわずかな増加しか示さず、その差は統計的に有意ではなく（p> 0.05）、ほとんどの細胞膜が完全性を維持していることが示されました。 、およびCPhG、エキナコシドおよびアクテオシドによるHSCの阻害は、非特異的な細胞毒性によるものではありません。
肝障害が発生すると、活性化された肝細胞がTGF-piを放出し、それがHSC-T6を活性化するため、TGF-piは線維症と密接な関係があります[25-27]。 この研究では、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドは、HSCがinvitroでwTGF-piで刺激された後のHSC増殖の阻害のための魅力的な治療戦略と見なすことができます。 CPhG、エキナコシドおよびアクテオシドは、肝硬変の一種の治療および/または予防として使用され、初期の肝硬変の形成を阻害する可能性があると推測されます。 肝線維症の形成は、多因子および多細胞の関与の複雑なプロセスです。 この病理学的プロセスでは、細胞間相互作用、細胞間相互作用、細胞間相互作用が厄介なネットワークを構成します。 このネットワークでは、肝線維症の発症は、さまざまなシグナル伝達経路と手段によって調節することができます。 TGF-piは、HSCの古典的な活性化因子であり、肝硬変の病因における重要なメディエーターです[28]。 CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドは、HSCにおけるTGF-pi/smad経路関連のmRNAおよびタンパク質の発現を阻害する可能性があります。
TGF-piは、smadシグナル伝達経路を介して細胞効果を発揮し、肝硬変および炎症の発症における重要なメディエーターと見なされています。 TGF-piがTGF-p-タイプII受容体に結合すると、タイプII受容体キナーゼはTGF-pタイプI受容体のGSドメインをリン酸化し、タイプI受容体の活性化をもたらします[29]。 C末端のSSXSモチーフの2つのセリン残基でのp-smad2とp-smad3の作用により、smadシグナル伝達経路の下流の反応がI型受容体の活性化によって活性化されます[30]。 P-smad2およびp-smad3はsmad4とオリゴマー複合体を形成し、次に核に入り、それらの生物学的転写活性を発揮します。 したがって、smadタンパク質は受容体キナーゼから核に直接シグナルを伝達します[3i]。 一方、smad7はTGF-pi受容体としっかりと結合しているため、smad 2/3を活性化できず、シグナル伝達経路が阻害されます[32]。 Smad7は、p-smad2およびp-smad3、活性化smad複合体の核移行、および（CAGA）（9）-MLP-Lucの活性化を阻害するように作用し、コラーゲンI発現の低下とTGF-pシグナル伝達の完全な阻害をもたらします。 [33,34]。 私たちの結果は、CPhG、エキナコシド、アクテオシドがsmad2とsmad3のmRNA発現を減少させ、smad7mRNAの発現を増加させる可能性があることを示しました。 smad2、p-smad2、smad3、p-smad3タンパク質の発現を阻害し、smad7タンパク質の発現をアップレギュレーションします。これは、CPhG、エキナコシド、アクテオシドもHSCの活性化を阻害し、肝線維症を阻害する役割を果たしていることを示唆しています。機構。
3つの試験薬の肝保護効果のシーケンスは、アクテオシド>CPhGs>エキナコシドであることが示されました。 CPhG、エキナコシドおよびアクテオシドが肝硬変から保護するメカニズムの違いの理由をさらに解明するために、それらの化学構造を分析した。 フェネチルアルコール配糖体部分は、肝保護効果に不可欠な構造であるようです[35]。 アクテオシド（C29H36Oi5）は二重配糖体であり、エキナコシド（C35H46O20）はトリグリコシドです。つまり、エキナコシドは、アクテオシドと比較して構造に余分なグリコシドがあり、空間サイズが大きくなります。 アクテオシドの肝保護またはHSC活性の阻害は、エキナコシドよりも優れています。これは、立体障害が存在するためである可能性があります。
肝臓を保護する：シスタンチェ抽出物
4.実験セクション
4.1。 化学薬品および試薬
TGF-piは、Peprotech（Rocky Hill、NJ、USA）から購入しました。 HSC-T6細胞株は、武漢プロセル遺伝子バイオテクノロジー株式会社（武漢、中国）から購入しました。 ジメチルスルホキシド（DMSO）は、Sigma Inc.（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 Smad2、smad3、およびsmad7プライマーは、Shanghai Sangon Biological and Technological Company（上海、中国）によって製造されました。 Revert AidファーストストランドcDNA合成キットは、Thermo Scientific（上海、中国）から購入しました。 Quantifast SYBRグリーンPCRキットは、QIAGEN GmbH（ヒルデン、ドイツ）から購入しました。 p-smad2（ser465 / 467）抗体、Smad3（C67H9）ウサギmAbおよびp-smad3（ser423 / 425）ウサギmAbは、Cell Signaling Technology（ボストン、マサチューセッツ、米国）から購入しました。 Smad7抗体はBoster（Wuhan、China）から購入しました。 Smad2ポリクローナル抗体とp-アクチンモノクローナル抗体はProteintech（武漢、中国）から購入しました。 一次抗体の検出は、Invitrogen™（Carlsbad、CA、USA）から購入した2度抗体溶液（Alk-Phos。Conjugated、Anti-rabbit）および2度抗体溶液（Alk-Phos。Conjugated、Anti-mouse）を使用して行いました。 乳酸デヒドロゲナーゼアッセイキットは、Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute（Nanjing、China）から入手しました。
4.2。 植物材料
C. tubeulosaは、2006年5月に中国の新疆ウイグル自治区のTulufanから収集されました。植物材料は、新疆ウイグル自治区のマテリアメディカ研究所のJiangHeによってC.tubulosaとして識別されました。 バウチャーの標本は、中国の新疆ウイグル自治区のマテリアメディカ研究所に寄託されました。
4.3。 CPhGとその化合物の単離と精製
C.tubulosaの乾燥およびスライスした根茎（6. 0 kg）を、7 0パーセントのエタノール（4.8 L）を用いて還流下で3回連続して抽出し、次に溶媒を合わせた抽出物から除去してエタノール抽出物（1.146kg）を得る。 エタノール抽出物をAB-8樹脂で精製して、粗フェニルエタノールグリコシド（CPhG s）抽出物を得た。 水に溶解した後、抽出物をAB -8吸着マクロポーラス樹脂クロマトグラフィーで精製し、C。tubulosa（CPhGs、21 0 g）から総フェニルエタノール配糖体を得ました。 CPhGをODSOP{{1 0}}カラムにアプライし、MeOH-H？。（0：1 - ^ 1：0）の混合物で連続的に溶出しました。 溶媒システムCHCh-MeOH-H？。（6：4：0.5）を使用して、TLCの動作に従って、溶出液を5つのサブフラクションに結合しました。 1％FeCihをスプレーした後、スポットを可視化しました。さまざまな画分を、溶離液としてメタノールを使用したSephadex LH -20カラムクロマトグラフィーで繰り返し精製し、CPhGから2つのフェニルエタノール配糖体を分離しました。 それらの構造は、MS、1H-、およびMC-NMR [35]を使用して、エキナコシド（C35H46O20）およびアクテオシド（C29H36O15）として確認されました。これらの純度は、UV-HPLCによってそれぞれ99.17パーセントおよび98.92パーセントと決定されました。 エキナコシドとアクテオシドの構造を図9に示します。
4.5。 CPhGの定量的決定
液体クロマトグラフィー（HPLC）（LC {{0}} HPLC機器、島津製作所、京都、日本）を使用して、CPhGのエキナコシドとクテオシドの含有量を分析しました。 Phenomenex Gemini ODSカラム（250 x 4.6 mm、5|^ m）を30度で使用しました。 メタノール-アセトニトリル-1パーセント酢酸（15：10：75、v / v / v）からなるアイソクラティック移動相を、流速0.6 mL / min、UVで40分間使用しました。 334nmでの検出。
4.6。 細胞培養
HSC細胞は、1 0パーセントのウシ胎児血清（FBS、ギブコ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（DMEM、北京、中国）で培養しました。10 0 IU/mLペニシリンおよび100^g / mLストレプトマイシン（HyClone、Logan、UT、USA）、37度、5％CO2の加湿インキュベーター。 これらの細胞は、トリプシン0.25パーセント（1x）溶液（HyClone、Logan、UT、USA）で定期的に継代培養され、培地は2日ごとに交換されました。 最初に、細胞を10パーセントFBSを含むDMEMで48時間培養しました。 次に、培地をFBSを含まないDMEMに交換して、細胞を12時間飢餓状態にしました。 これらの細胞を48時間増殖させ、48時間後、血清を0.5％FBSで12時間飢餓状態にしてから、5 ng / mL TGF-＆1を添加しました。
4.7。 IC50値の決定
{{0}}。5パーセントのFBSを含む飢餓培地で一晩インキュベートした後、HSC細胞を96-ウェルプレートに5x104細胞/mLの密度で24時間播種しました。 HSC細胞は、CPhG、エキナコシド、およびアクテオシドをさまざまな濃度（0、3.90625、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、および500 ^ g / mL）で48時間処理しました。 各濃度には4つのウェルがありました。 処理の最後に、20卩LMTT [3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド]（Sigma; 5 mg / mL）を添加し、細胞をさらに4時間インキュベートしました。 上澄みを除去した後、DMSO（200rL）を各ウェルに加えた。 プレートをシェーカーで10分間振とうした後、酵素標識装置（Benchmark PLUS、Hercules、CA、USA）を使用して490 nmの波長での吸光度を測定することにより、IC50値を取得しました。このアッセイは3回行いました。 CPhG、エキナコシド、アクテオシドのIC50値は、それぞれ119.125、520.345、6.999 Rg/mLでした。
4.8。 細胞増殖阻害効果と細胞生存率
HSC細胞は、さまざまな濃度のCPhG（25,50,100 Rg / mL）、エキナコシド（125,250,500 Rg / mL）、およびアクテオシド（1.5,3、6 Rg / mL）に曝露されました。 異なる濃度のCPhG、エキナコシドおよびアクテオシドを4つの連続したウェルのプレートに適用し、48時間インキュベートしました。 細胞増殖阻害効果および細胞生存率のレベル（損傷した細胞から上清に放出されたLDH活性の測定に基づく[36]）は、MTTアッセイによって決定されました。 阻害率は、次の式を使用して計算されました[37]。
阻害率（パーセント） "[1 —（実験群の平均吸光度/ブランク対照群の平均吸光度）]x100パーセント
キットの指示によると、
LDH（U / L）{{0}}（測定OD —コントロールOD）/（標準OD — blankOD）x 0.2 mmol / L x 1000
私たちの予備研究は、CPhG、エキナコシドおよびアクテオシドが細胞生存率に影響を与えなかったことを示しました。
4.9。 TGF-^1による抗増殖活性
TGF-p1によって活性化されるHSCは肝硬変と関連していると長い間考えられており、肝硬変を治療する方法としてHSC増殖の阻害が提案されています[36,38]。 TGF-p1によって活性化されたHSCに対するCPhG、エキナコシド、およびアクテオシドの抗増殖効果は、MTTアッセイによって決定されました[39]。 説明されている手順と薬物濃度を使用して、
実験群には、対照群、TGF-pi群、TGF-piに加えて異なる濃度の薬物群が含まれていました。 対照群を除くすべての細胞群は、5。0 ng / mL TGF-p1（FBSなし）を含むDMEMで24時間培養されました。 細胞増殖に対する阻害活性は、100 x（処理された化合物の吸光度-背景光の吸光度）/（モデルの吸光度-背景光の吸光度）として計算されました。
4.10。 逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
smad2、smad3およびsmad7のmRNA発現レベルはリアルタイムPCRによって決定されました。 HSC細胞でのmRNA発現を測定するために、細胞（5 x 1 0 4細胞）を3。0 mL DMEMと10％FBSを含む6ウェルプレートに播種し、37度で一晩インキュベートしました。 5パーセントのCO2。 培地を無血清DMEMに変更した後、CPhG（100,50,25卩g / mL）、エキナコシド（500,250,125昭/ mL）およびアクテオシド（6、3,1.5 ^ g / mL）をウェルに添加しました。 CPhGおよびモノマー組成物と48時間インキュベートした後、TRIzol試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）を使用して全RNAを抽出し、クロロホルムで15秒間激しく攪拌しました。 室温で3分間静置した後、ライセートを12、000xgで15分間4度で遠心分離しました。 水相中のRNAをイソプロパノールで沈殿させ、上部の水相を新しいマイクロ遠心チューブに移しました。 0.15％エタノールを加えてRNAを沈殿させた後、マイクロ遠心チューブを使用し、12、000 xg、4度で5分以内で遠心分離しました。 上清を除去し、RNAを室温で5-10分間乾燥させました。 プライマー（Sangon）はBatch Primer 3を使用して設計され、表4にリストされています。結果は内部対照としてのハウスキーピング遺伝子p-アクチンのmRNAに対して正規化され、相対的なmRNAレベルとして表されます。 反応は、8|^ L iQ SYBR Green Supermix、1 10 pMプライマーペア、8.5蒸留水、および2.5rLcDNAを使用して実行されました。
各ポリメラーゼ連鎖反応は、以下の条件下で実施された：95度で3分間、次に95度で10秒、55度で30秒、および55度-95度で10秒の40サイクル、続いて伸長。単一の蛍光測定。 最終結果は、相対値（2_ AACt）で記述されました。 計算と分析は、iQ5リアルタイムPCR検出システムによって実行されました。
4.11。 ウエスタンブロット分析
全細胞抽出物は、1％Haltプロテアーゼ阻害剤および1％Haltホスファターゼ阻害剤カクテル（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を含むRadioimmunoprecipitation Assay（RIPA）バッファー（Thermo Fisher Scientific、Inc.）を使用して調製しました。 総タンパク質は、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、およびsmad7の検出に使用されました。 タンパク質濃度は、ブラッドフォード法によって測定および定量化されました。 タンパク質（10-30 Rg）を1 0パーセントのSDS-PAGEゲルで分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレン（ミリポア、ボストン、マサチューセッツ州、米国）に転写しました。 膜は、5％ウシ血清アルブミンおよび一次抗体（smad2ポリクローナル抗体、p-smad2抗体、smad3ウサギmAbおよびp-smad3ウサギmAb、1：1000希釈、smad7のウサギmAb、1）で室温で1時間ブロックされました。 ：200希釈、p-アクチンモノクローナル抗体、1：5000希釈）を4度で一晩インキュベートしました。 対応するAlk-Phos。 コンジュゲートした二次抗体を室温でインキュベートした。 最後に、メンブレンを0.1％Tween20を含む1x Tris-HCl生理食塩水で3回洗浄し、信号をスキャンしてGEL DOC XR Imaging System（Bio-Rad、Hercules、CA、USA）で可視化しました。 デンシトメトリー分析は、目的のタンパク質で実行され、GEL DOC Image Studioソフトウェア（Bio-Rad）によってp-アクチンに正規化されました。 内部対照としてp-アクチンを使用した。
4.12。 統計分析
データは平均土標準偏差（SD）として表されました。 統計分析は、SPSS 16. 0ソフトウェア（新疆医科大学）を使用して実行されました。 プロビット分析を使用して、IC50値を分析しました。 差の有意性は一元配置分散分析によって計算され、p<>
5。結論
結論として、C.tubulosaとその成分であるエキナコシドおよびアクテオシドからのCPhGは、有意な抗線維化効果を示します。 それらの中で、アクテオシドの活性が最も強力であり、CPhGの活性は2つの化合物の間にあります。 TGF-p1 / Smadシグナル伝達の活性化の阻害は、CPhGが線維症に関連する慢性肝疾患から保護する根本的なメカニズムである可能性があり、エキナコシドとアクテオシドはC.tubulosaの効果的な抗線維化物質の基礎です。
謝辞：この研究は、中国国家自然科学基金（81260624）によってサポートされていました。 本稿の執筆を改善してくださったTaoLiu教授に心から感謝いたします。
著者の貢献：TL、JZ、S.-PY、LM、S.-LZが実験を考案し、設計しました。 S.-PY、TL、JZがデータを分析しました。 S.-PYとJZが原稿を書きました。 TL、LM、JZが原稿をレビューしました。 すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
利害の対立：著者は、利害の衝突はないと宣言します。
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