植物化学分析、invitro抗増殖性、抗酸化剤パート1
Apr 21, 2022
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バックグラウンド：Rumex rothschildianusは、タデ科のRumex属のユニークなセクションの唯一のメンバーです。 この種は非常にまれな小さな雌雄異株の年次であり、伝統的に食物として、そして様々な病気の治療のために使用されているパレスチナに固有のものです。 したがって、現在の調査は、R。rothschildianusの葉の4つの溶媒画分の化学成分、抗酸化剤、抗α-アミラーゼ、抗α-グルコシダーゼ、予測、および細胞毒性効果をスクリーニングすることを目的としていました。
方法：R. rothschildianusの葉の乾燥粉末を、極性の異なる4つの溶媒で抽出しました。 抽出物の成分を決定するために、いくつかの定性的および定量的な植物化学物質試験が実施されました。 比色分析は、フェノール、フラボノイド、およびタンニンの定量分析に使用されました。 抗酸化剤、抗α-アミラーゼ、抗α-グルコシダーゼについて抽出物を評価し、抑制活性、ならびに子宮頸癌細胞株（HeLa）および乳癌細胞株に対するMTSアッセイによる細胞毒性を予測するために、インビトロアッセイを実施した。 （MCF7）。
結果：R.rothschildianusの葉のアセトン画分が最も有意であった酸化防止剤トロロックスの3.1±0。9ug/mlと比較して、6.3±0 .4 ug / mlのICso値で、フラボノイドとフェノール類の含有量が最も高いため、リパーゼ阻害活性アセトン画分は、オルリスタット陽性対照ICso 12.3 ug / mlと比較して、26.3±{{10}}。6ug/mlのICso値で最も強力な活性を示しました。 同じ抽出物がα-アミラーゼとα-グルコシダーゼの最も強力な阻害剤であり、ICso値はそれぞれ19.1±0。7ug/mlと54.9±0。3ug/mlでした。それぞれ28.8、37.1±0.3ug/およびアカルボース。 ヘキサン画分は、HeLa細胞に対して99.9％の阻害を示し、MCF7細胞に対して97.4％の阻害を示しました。
結論：R. rothschildianusの葉のアセトン画分は、酸化ストレスの治療のための生物活性化合物の供給源を提供する可能性があります。 同様に、ヘキサン画分は、R。rothschildianusの有望な抗腫瘍能を示しています。 明らかに、これらの最初の適応症は、潜在的に活性な化合物のさらなる精製、そして最終的にはそれらの有効性を決定するためのインビボ研究を必要とします。
キーワード：Rumex rothschildianus、抗酸化剤、リパーゼ、アミラーゼ、トロロックス、植物化学、抗増殖活性
バックグラウンド
植物は古くから治療法として使用されてきました。 根、種子、樹皮、葉、花はすべて修復目的で使用されてきました。 現在、合成薬が利用可能であり、幅広い病気の治療に効果的です。 しかし、人体への害が少ないと見なされているため、ハーブ薬を好む人もいます[1,2]。 薬用植物は、定義上、治療活性を持つ植物化学物質の供給源です。 これらの特性は、フェノール類、テルペノイド、アルカロイドなどのさまざまな二次代謝産物の存在に依存しています[3]。 RumexrothschildianusAarons。 タデ科のRumex属のユニークなセクションの唯一のメンバーです。 この種は非常にまれな小さな恐ろしいほど毎年恒例であり、パレスチナに固有のものです。 それは45cmの平均の高さを持ち、根元で短い葉柄であり、頂点で短い尖頭である急進的な葉柄の葉を保持する直立した茎によって特徴付けられます。 花の直径は3-4mmですが、花は直径約2mmで、珊瑚状の膜状層があります[4]。 Rumexspp。 トルコのさまざまな地域に広まっており、22種で表されます。 最も一般的な種のいくつかは、R。patientia L、R。Crispus L、R。acetosa LR caucasicus rech、R。alpinus LR alpinus、およびR. caucasicusは、アナトリア中部および東部の標高{{10 }}海抜m。 Rumex属は、便秘、下痢、湿疹などの障害を治療するためにトルコの伝統医学で広く使用されています[5、6]。 この属には、下剤、利尿剤、解熱剤、創傷治癒、および抗炎症作用もあります。 トルコ東部の多くの人々は、ルメックス属の若い葉を使用しています。 チーズの防腐剤として、また食品の香りを与える[7]。
Rumex種については、抗菌活性が報告されている種など、さまざまな研究が行われています。 カロテノイド、トコフェロール、ポリフェノール、フラボノイド、アスコルビン酸など、抗酸化剤や天然の解毒剤としての役割を果たすいくつかの生物活性植物化学物質が、Rumexの代用Lで以前に発見されています。 カロテノイドなどの抗酸化植物化学物質の食事摂取量、フェノール類、 とフラボノイド癌、心血管障害、および酸化ストレスに関連する他の健康問題など、人間の非感染性疾患から保護する可能性があります[5、8]。 有害なフリーラジカルは、癌、心臓血管疾患、関節リウマチ、白内障など、多くの主要な健康問題で重要な役割を果たすことが知られています。アルツハイマー病、および老化に関連する他の変性疾患。 抗酸化物質は、細胞を攻撃する前にこれらのフリーラジカルを中和する有益な成分であり、したがって、細胞のタンパク質、脂質、および炭水化物。 人間の病気の治療のために、様々な天然および合成の抗酸化剤が提案されてきた。 人間の健康における抗酸化剤の役割へのそのような関心は、抗酸化剤としてのハーブの機能を評価する、食品科学および薬草の分野での研究を促しました。 抗酸化作用には、フリーラジカル捕捉能、脂質過酸化の抑制、金属イオンキレート能、および還元能が含まれます[9,10]。
癌は最も世界的な医療問題の1つです。 新規抗がん剤の開発と発見は、さまざまな要因により非常に重要なままです。 これらの要因には、主要な副作用を引き起こす可能性のある、またはかなり高価になる可能性のある治療が含まれます。 生物学的により安全で手頃な価格の代替品が依然として非常に望ましい[11-14]。
ベラドンナの葉からのアトロピン、コカの葉からのコカイン、ビンカ植物からのビンクリスチンなど、いくつかの植物種は、現代医学で依然として重要な役割を果たしている他の多くの生物活性分子の潜在的な供給源と見なされています[15,16]。
有用な治療効果は、薬用植物に存在する二次製品を混合することから得られます。 これらの化合物は主に、アルカロイド、ステロイド、タンニン、フラボノイド、フェノール類などの二次代謝産物であり、これらの植物の特定の部分で合成および沈着します[17、18]。 本研究は、R。rothschildianusの葉から抽出されたさまざまな画分のinvitro抗α-アミラーゼ、抗- -グルコシダーゼ、抗リパーゼ、抗増殖および抗酸化活性を調査します。
メソッド
植物材料、化学薬品、および器具
R. rothschildianusの葉は、2018年2月から3月の間にパレスチナの西部地域から収穫されました。これらは、バウチャー標本コードPharm-PCT {{3}の下で、アンナジャ国立大学の生薬学研究所のNidalJaradat博士によって特定されました。 }。 すべての化学物質はSigma-Aldrichから購入しました。 分光光度計-UV/Visible（Jenwaydegree 7135、Stafford-shire、UK）、濾紙（Whitman No. 1、Washington、USA）、シェーカーデバイス（Memmert 531-25-1、Stockholm、Sweden）、rotavap装置（Heidolph -VV 2000、Schwa-bach、ドイツ）、グラインダー（Aero Plus 500 W Mixer Grinder、I01、Wan Chai、中国）、電子天びん（Radwag、AS 220 / c / 2、Torunska、ポーランド）、凍結乾燥機-BT85 （Millrock Technology、中国）およびクライオデシケーター（Mill-rockテクノロジー、BT85、キングストン、米国）を使用しました。
抽出物の調製と分画
R. rothschildianusの葉の乾燥粉末は、無極性溶媒であるヘキサン、次にアセトン（極性非プロトン性有機溶媒）、メタノール（極性アルコール）、最後に蒸留水（a極性プロトン溶媒）。 抽出ごとに、約25gの粉砕した乾燥葉を0 .51ヘキサンに入れ、シェーカー装置で25度で毎分100回転させました。 最初に、ヘキサンを0.5Lのアセトンで置き換え、次に、等量のメタノールと水で置き換えました。 溶媒中でのインキュベーションは、ヘキサンについて上記した通りであった。 各有機画分を濾過し、ロータリーエバポレーターで真空下で濃縮し、水性画分を凍結乾燥機を使用して乾燥させた。 最後に、すべての粗画分を4度で保存しました[19,20]。
各画分の収量は、次の式を使用して計算されました。
予備的な植物化学物質の評価
R. rothschildianusの葉の4つの画分の植物化学的スクリーニング試験を実施して、活性な二次代謝産物を同定しました。 定性的な結果は、生物活性のある植物化学物質が存在する場合は（プラス）、存在しない場合は（-）として表されました[10,21]。
総フェノール含有量（TPC）の決定
TPCを決定する手順は、Cheungetal。の手順に基づいていました。 TPCは、葉の乾燥重量1グラムあたりの没食子酸当量のミリグラムで表されました（mg GA / g乾燥重量）。 メスフラスコに7.5gのNa2CO3を入れ、蒸留水で容量を1 0 0mlに調整することにより、新たに調製した7.5％炭酸ナトリウム溶液を作成しました。 標準参照溶液（没食子酸溶液）は、100mgの没食子酸を蒸留水に溶解して最終容量を100mlにすることにより調製しました。 このことから、100、70、50、40、および10ug / mlの没食子酸の溶液を得るために段階希釈を行った）。 葉の画分の原液は、植物抽出物100mgを蒸留水に溶解して調製し、総量100mlに調整しました。 反応混合物は、各画分溶液0.5mlを10％フォリン-チオカルト試薬2.5mlと混合し、7.5％重炭酸ナトリウム2.5mlを含む水に溶解して調製した。 サンプルチューブを45度で45分間インキュベートしました。 次に、それぞれの吸光度を、波長765nmで分光光度計で測定した。 作業サンプルは、分析試行ごとに3回ずつ準備され、そこから平均値と標準偏差値が計算されました[21]。
総フラボノイド含有量（TFC）の決定
4つのR.rothschildianusの葉の画分のTFCは、ルチン（標準参照化合物）の検量線を使用して評価されました。 結果は、葉抽出物の乾燥重量1グラムあたりのルチン当量のミリグラム（mg RU / g乾燥重量）として表されました。 ルチンの検量線は、1 {{1 0}} 0 ug/mlのストック溶液から生成された段階希釈を使用して確立されました。 原液を作るために、10mgのルチンを10mlの蒸留水に溶解し、次に100mlに希釈した。 続いて、ストック溶液を希釈して、10、30、40、50、70、および100 ug/mlの濃度のルチンを提供しました。 作業溶液の調製のために、0.5mlの各画分溶液を3mlのメタノール、0.2mlの10パーセントAlCl3、0.2mlの1M酢酸カリウム、および5mlの蒸留水と混合し、次に室温で30分間インキュベートした。 各画分について前のステップを繰り返し、その後、415nmの波長で吸光度を測定しました。 ブランクコントロールの場合、サンプル抽出物の代わりに蒸留水を使用して作業溶液を設定しました。 サンプルは、分析試行ごとに3回ずつ準備され、そこから平均値と標準偏差値が計算されました[22]。
総タンニン含有量（TTC）の決定Sunらのプロトコル。 最も一般的に使用される手順である、4つのR.rothschildianusの葉の画分のTTCを決定するために使用されました。 カテキンは、検量線を作成するための参照化合物として使用されました。 メタノール中の100ug / mlストックを調製し、そこから希釈系列を生成して、カテキン濃度を10、30、50、70、および100 ug/mlにしました。 メタノール中のバニリンの4パーセント溶液を新たに調製した。 100 ug / mlの画分のストック溶液は、溶媒としてメタノールを使用して調製しました。 作業溶液については、0.5mlの各画分溶液を3mlのバニリン溶液および1.5mlの濃HClと混合した。 混合物を15分間静置した後、サンプル抽出物の代わりにメタノールをブランクとして設定した作業溶液を使用して、500nmでの吸光度を測定しました。 すべての作業サンプルを3回分析し、そこから平均値と標準偏差値を計算しました。 各画分の総タンニンは、カテキン当量（CAEのmg /葉の乾燥重量g）で表されました[23]。
抗酸化作用法
遊離の2、2-ジフェニル-ピクリルヒドラジル（DPPH）ラジカル捕捉アッセイを使用して、R。rothschildianusの葉のさまざまな画分における抗酸化活性を測定しました。 各植物画分の1000ug/mlストック溶液をメタノールで調製しました。 さらに、トロロックスの1000 ug / ml溶液も調製しました（参照標準）。 各フラクションのストック溶液から希釈系列を作成し、2、5、10、20、50、および100 ug/mlで6段階希釈しました。 各抽出物希釈液の1mlを、メタノール中の1 ml 0.002 g /mlDPPHと混合しました。 1mlのメタノールを加えて3mlの最終作業容量を得た。 DPPH溶液は、光に非常に敏感であるため、新たに調製しました。 一連の濃度のブランクコントロールは、抽出物を添加せずに、1：2の比率のメタノール中のDPPHでした。 すべての作業溶液を室温（25度）で暗所で約30分間インキュベートしました。 次に、光学密度を、517nmの波長で分光光度計を用いて測定した。 次の式を使用して、標準化合物としてTroloxを使用し、各植物画分のDPPH阻害率を計算しました。
ここで、Agはブランク溶液の記録された吸光度であり、Atsはテストされたサンプル溶液の記録された吸光度です[21]。
ブタ膵臓リパーゼ阻害アッセイ
5 0 0 ug / mlのストック溶液は、10パーセントのDMSOで各植物画分から作成されました。 これらから、50、100、200、300、および400 ug/mlの5つの濃度の希釈系列が作成されました。 Tris-HClバッファー中のブタ膵リパーゼの1mg/ mlストック溶液は、使用直前に新たに調製しました。 基質であるp-ニトロフェニルブチレート（PNPB）は、20.9mgを2mlのアセトニトリルに溶解して調製しました。 各作業溶液について、0.1mlのブタ膵リパーゼを希釈系列の各メンバーからの0.2mlの植物画分と混合しました。 Tris-HClを加えて作業溶液の最終容量を1mlにし、37℃で15分間インキュベートしました。 インキュベーション後、0.1mlのp-ニトロフェニルブチレート溶液を各試験管に加えた。 次に、混合物を３７度でさらに３０分間インキュベートした。 膵臓リパーゼ活性は、UV分光光度計を使用して、410nmでPNPBのp-ニトロフェノラートへの加水分解を測定することによって決定されました。 標準参照化合物としてorlistatを使用して、同じ手順を繰り返しました。 植物画分によるリパーゼ阻害の割合は、次の式で計算されました。
ここで、Apはブランク溶液の記録された吸光度であり、Atsはテストされたサンプル溶液の記録された吸光度です[24]。 a-アミラーゼ阻害アッセイ
各画分のA100mgを数ミリメートルの10パーセントDMSOに溶解し、さらに0.02 M NaHPOq/に100mlまで溶解しました。 NaH-PO4,0.006M NaCl、pH 6.9で、最終的に1000 ug/mlの濃度のストック溶液が得られます。 これらから、希釈剤として10％DMSOを使用して、10、50、70、100、および500 ug/mlの以下の希釈液を調製しました。 0.2ml容量の2units/mlブタ膵臓-アミラーゼを0.2mlと混合した
植物画分を30度で10分間インキュベートしました。 インキュベーション後、0 .2mlの新たに調製した1％デンプン水溶液を加え、チューブを少なくともさらに3分間インキュベートしました。 この時点で、0.2mlの3、5-ジニトロサリチル酸（DNSA）着色試薬を添加して反応を停止し、5mlの蒸留水で希釈した後、水中で90度で10分間加熱しました。浴。 次に、混合物を室温まで冷却し、540nmで吸光度を測定した。 ブランクコントロールは、上記と同じ量を使用して調製しましたが、植物画分を0.2mlのバッファーに置き換えました。 上記の手順に従って、アカルボースを標準参照として使用しました。 α-アミラーゼ阻害活性は、次の式を使用して計算されました。
ここで、Ag：はブランクサンプルの吸光度、Arはテストサンプルの吸光度です[25]。
この記事は、Jaradatetalから抜粋したものです。 BMC補完医学と治療（2021）21：107
