ピノセムブリンは、Nrf2 /HO-1シグナル伝達経路の活性化を通じて梗塞後の心不全を改善しますパート2
Mar 21, 2022
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統計分析
変数は平均±標準誤差として表され、比例変数はパーセンテージとして示されました。 すべてのグループの比較は、フィッシャー最小有意差検定によって修正された二元配置分散分析によって分析された心エコーデータのデータを除いて、テューキー事後検定によって修正された一元配置分散分析（ANOVA）を使用して実行されました。 p値<0.5 was="" defined="" as="" statistical="">
結果PinoはHFによる心機能の低下を改善しました最初に心エコー検査を実施して、LAD結紮によって誘発されたHF表現型の確立とPinoが心機能に及ぼす影響を調べました。 すべてのグループの代表的な2次元Mモード心エコー図を図2Aに示しました。 LVIDd、LVESV、LVEDV、それぞれ6週目と8週目対偽のグループ、8週目の血清BNP濃度と心臓重量/脛骨長の増加に加えて、特定のパラメーターで心機能障害と肥大を示しました（図2B、C）。 、を表1）に示しました。 ただし、すべての症状は、8週目にピノ対HFグループの適用によって部分的に逆転し、心機能におけるピノの有益な役割を示唆しています
PIHFの後。 さらに、ピノは6週目にベースラインの心機能を改善の方向に変えたが、その変化は有意に達していないことが注目された。 したがって、ピノの長期適用が顕著な改善につながることができるかどうかという仮定が提唱され、さらなる研究が必要でした。
ピノはPIHFのリモデリングを弱めました心筋細胞の再生能力がまばらであるか存在しないことを考えると、心機能の改善は、心筋細胞の再生ではなく、ピノによる生きている心筋細胞と組織の改善に起因していました。 したがって、以前に示唆されたように、PIHFリモデリングにおける3つの重要な要因である線維症、血管新生、およびアポトーシスをさらに評価しました（Wang et al2010）。 ピノは、MI境界領域でのコラーゲン線維の沈着を約2分の1に劇的に減少させました（図3A）。さらに、梗塞境界領域の判断における人為的なバイアスを回避するために、ポジティブコントロールとして同一のモデルを確立しました。ピノは、HFリモデリングの逆転で知られているアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ACEI）であるエナラプリルに置き換えられました。 HF群とACEI群で線維化の程度を観察した。
事前に確立されたモデルに対しておおよそのパーセンテージに達しました。 また、心筋の代わりに大量の沈着コラーゲンが存在する梗塞領域にもマークを付けました（追加ファイル1：図S1）。 さらに、PinoはVEGFR2の分布と発現の慢性的なHF誘発性の希薄化を相殺しました（図3B）。 以前の研究では、アポトーシス促進遺伝子の多様性を活性化できるp53タンパク質が、低酸素誘導因子-1（HIF-la）の阻害を介して抗血管新生に重要な役割を果たしていることが明らかになっています（Gogirajuet al.2019; Guo et al .2015）。 次に、HFグループでp53タンパク質の過剰発現を観察しましたが、これはPinoによって打ち消され（図3C）、VEGFR2の変化を部分的に説明しています。 また、Pinoの投与により抗アポトーシスタンパク質BCL -2の発現がアップレギュレートされ、対照的に、p53、Bax、切断型カスパーゼ-3などのアポトーシス促進タンパク質がダウンレギュレートされるウエスタンブロット実験も実施しました。 HFグループに対するbcl-2/ bax比の増加は、アポトーシス手順の活性化を示しています。これは、Pinoがアポトーシス率に逆効果を示したTUNELアッセイでも確認されました（図3D）。結論として、Pinoは改善しました。抗線維症、血管新生、および抗アポトーシスを含むそのよく知られた効果によるMI後のリモデリング。
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PinoはNrf2/HO -1経路の変調によってOSを軽減しましたが、それにもかかわらず、Pinoがそのような変化をもたらすメカニズムは未定義のままでした。 蓄積された研究により、多種多様な分子を修飾し、有害なリモデリングシグナル伝達経路を引き起こしたOSが、HFモデルでアポトーシスと線維症を引き起こす可能性があることが実証されています（Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Wang et al.2010 ; Chen et al.2020b）、したがって、我々は、PinoがOSの緩和を介してPIHFを改善したと仮定しました。 まず、HFにおけるPinoの抗酸化作用を決定するために、心臓組織でのROS生成と、血清中のSODおよびMDAをそれぞれ蛍光および生化学的試験によって調査しました。 予想通り、ピノは慢性によって生成されたROSを部分的に除去しました
DHEの蛍光強度の低下によって現れるHF（図4A、B）。 さらに、抗酸化酵素であるSODは、Pinoの適用によってアップレギュレーションされましたが、脂質過酸化を示唆するMDAは減少しました（図4B）。 上記のデータは、PIHFの齧歯動物モデルにおけるPinoの抗酸化作用を証明しています。
ピノのROS除去効果は確かでしたが、抗酸化防御の強化の根底にあるメカニズムは依然として解明を必要としました。 Nrf2は、内因性抗酸化防御の主要な構成要素であり、ストレス/刺激により阻害剤であるケルチリックECH関連タンパク質1（Keapl）と解離し、核に移行して抗酸化応答エレメント（ARE）のプロモーター領域に結合します。多数の抗酸化遺伝子および酵素の発現。その中でHO-1が代表的な酵素であり、重要な役割を果たしています（Maetal。2019;Bubbetal。2017;Habtemariam2019; Velusamyetal。2020 ; Tian et al.2019）。 HMOX1によってコード化されたHO-1は、ヘムを触媒して、ビリベルジン、ビリルビン、および一酸化炭素（CO）を含む3つの抗酸化分子に分解します（Wang et al.2010; Kishimoto et al.2019）。 以前の研究では、Nrf2またはHO -1の特定の活性化または過剰発現がPIHFを改善することが示されています（Ma et al.2019; Bubb et al.2017; Wang et al.2010）。 Nrf2 / ARE経路は、PIHFモデルでは定義されていない相互作用を伴い、うつ病（Wang et al.2020）、神経毒性（Jin et al.2015）などに保護効果を発揮します。 さらに、ウエスタンブロットによってこの相互作用を調査しました。 PIHFは、偽のグループと比較して、全体的なNrf2およびHO-1の発現の減少に寄与しました。 そして、ピノは、強い素因でHO -1の発現を増加させる能力に加えて、Nrf2のアップレギュレーションによってこの有害な影響を大幅に逆転させましたが、差は有意に達しませんでした（p=0。0845;図4C ）。 結果は、PIHFの心機能の改善とリモデリングに関与するNrf2 /HO-1経路の活性化におけるPinoの役割を示しました。
Nrf2のinvitro遮断はH9c2心筋細胞におけるPinoの効果を排除しました
Pinoの効果がHFの病理学的状態の完全な改善ではなく、Nrf2 / HO -1経路に依存することをさらに証明するために、以前に報告された方法としてH9c2心筋細胞を培養し、特定のNrf2阻害剤であるML385をinvitroで利用しました。 Pinoは、生体内と同様の応答パターンで、培地中のSODの増加とMDAの減少とともに、ISOによって誘発されるROSの蓄積を減衰させました（図5）。 しかし、ML385の投与によりすべての効果がほぼ無効になり、Pinoの抗酸化効果は主にNrf2の活性化によってもたらされたことが示唆されました。 さらに、このNrf2 /HO-1経路に依存します
ISO + Pino + ML385グループでNrf2とHO-1の発現が減少したため、効果がさらに決定されました（図6）。 Nrf2の有効性は主に酸化剤防御によって提示されたため、PinoのROSスカベンジングの能力が低下したことも注目に値します。 この現象の考えられる説明は、レドックスホメオスタシスの不均衡が25uMピノの最大掃気能力を超える過剰なROSを生成したことでした。
続いて、H9c2心筋細胞のウエスタンブロットを実行して、酸化還元の不均衡を調査しました。
ML385に起因する恒常性は、リモデリングに対する感受性の増大の原因でした。 ピノの投与は、コラーゲンI、p53、Bax、切断されたカスパーゼ-3の減少、およびBCL -2の増加によって証明される、抗線維症、抗アポトーシスにおいて平行した効果を示しました（図6A 、B）。 さらに、CCK -8は、CMFのウエスタンブロットによって調べられたコラーゲン分泌の抑制を伴う、ピノによるCMFの活性の阻害を示唆しました。 さらに、インビトロでのML385によるこれらすべての提示の逆転は、Nrf2 /HO-1がPIHEの改善におけるPinoの主な標的であることをさらに示した。
討論
本研究では、Pino治療が抗酸化作用を通じてPIHFに有益であると判断しました。 ピノは、ROSスカベンジングとNrf2 / HO -1経路の活性化によってPIHFに起因する心機能とリモデリングを改善し、コラーゲン線維の沈着とアポトーシスを含む心室リモデリングの主要な要因をさらに弱め、p53タンパク質のダウンレギュレーションにおける血管新生を促進しました-依存する方法。
酸化防止剤とHF
OSがHFの機能障害とリモデリングを悪化させるというコンセンサスが提示されています（Galli and Lombardi 2016; Dubois-Deruy et al.2020; Velusamy et al.2020; Tian et al.2019; Kishimoto et al.2019）。ますます多くの分子標的と新薬が発見され、研究されてきた抗酸化剤の効果のために実施された実験と試験の結果。 しかし、臨床試験でテストされたいくつかの抗酸化物質に加えて、HFの無効性またはリスクの増加を示す傾向がありました（Leeetal。2005;Madeetal。2015;Olesenet al.2014; Lonn et al。2005）、キナーゼ、マイクロRNA（Tian et al.2020; Vagnozziet al.2013; Pfister et al.2014）などの多くの分子標的は、基礎実験から試験への移行、さらには臨床応用への移行が非常に困難です。製造と安全に。
対照的に、ピノには、HFの治療における補助抗酸化剤として有望な次の利点があります：（i）以前の研究と私たちの現在の研究で証明された重要な抗酸化効果;（ii）ピノは多くの天然物から抽出することができます植物、蜂蜜、プロポリス、または人工的に合成されたもので、生産に十分であり、比較的安価です。（ii）蜂蜜とプロポリスにピノが豊富に含まれていることは、便利な食事の摂取を示しています。 実際、最近の第I相臨床試験は、ピノが十分な耐性と安全性を示した健康な被験者にピノを提供するために実施されました（Cao et al.2015）。 さらに、ピノは中国食品薬品監督管理局によって虚血性脳卒中の治療薬として承認されており、第II相臨床試験が実施されています（Shen et al.2019）。 これらの達成された進歩により、PIHFの関与により、ますます多くの疾患にピノンがさらに適用されることを楽しみにしています。
HFでのピノの役割
私たちの知る限り、この本研究は、PIHFの齧歯動物モデルにおけるピノの役割を調査した最初の研究でした。 ピノの効果は多くのモデルで広く調査されましたが、心筋梗塞、虚血/再灌流傷害、不整脈などの心血管疾患とピノとの関連に重点を置いた研究はごくわずかです（Ye et al.2019; Zhengetal。 2020）、これはピノによって与えられた心臓の保護の私たちの理解を制限しました。 さらに、以前に実証されたように、ピノは、PIHFの治療の重要な標的でもあった抗線維症、アポトーシス、炎症、および抗酸化効果を示しました。 炎症経路の1つである核因子-カッパB/腫瘍壊死因子-（NF-KB / TNF-）経路が私たちのグループで調査されたため（Ye et al.2019）、この研究では、アポトーシス、酸化ストレス、線維症、および血管新生の希薄化からなる、心機能およびリモデリングを悪化させたいくつかの要因。 予想通り、非常に重要なピノポストコンディショニングは、抗酸化物質に依存した方法でアポトーシスと線維症を軽減しました。 また、アルツハイマー病のモデルでPinoによって誘発されたものと同様に、生存を促進するために心筋細胞に酸素と栄養素を提供するVEGFR 2-依存性血管新生を観察しました（Liu et al.2014）。 しかし、PinoがVEGFR2結合、毛細血管の移動、および発芽を抑制するために認証され（Cuevas et al.2015; Tian et al.2014）、それによってPinoを利用して潜在的な新薬としての癌の増殖を妨げることができるという論争が残った。 したがって、梗塞境界ゾーンでの血管新生は、おそらくピノによる直接的な影響ではなく、他の要因の回復によるものでした。 PIHFでアップレギュレーションされたP53タンパク質は、部分的に変化を説明することができます。 ピノがプロテインキナーゼB（AKT）などの血管新生を調節する可能性のある他のいくつかの要因に影響を及ぼしたかどうかも不明でした。 したがって、PIHFでPinoによって付与された血管新生の根本的なメカニズムを解明するには、さらなる研究が必要でした。
Pinoは主にPIHFのNrf2/HO-1経路を変調しました
Nrf2 / HO -1経路は、OSによって引き起こされる損害に耐える主要なメカニズムでした。 Pinoが全体的なNrf2とHO-1の発現、および血漿から核へのNrf2の転座を促進することにより、OSを改善できることは十分に確立されています。これは、この経路を候補として選択した理由でもあります。 ただし、PinoがNrf2 / HO -1経路に及ぼす影響は、全体的な状態の改善が未定義のままだった後の直接的な活性化または間接的な変調によるものでした。 したがって、この研究では、線維症、アポトーシス、および血管新生に対するPinoの有益な効果をほぼ逆転させるML385によるNrf2の阻害を通じて、NrfをPinoの主な標的として決定しました。 それにもかかわらず、インビトロで行われたこの関連は、遺伝子沈黙のためにトランスフェクトされたNrf2阻害剤またはsiRNAまたはウイルスがインビボで適用される必要がある場合、さらなる調査を必要とした。 さらに、ROSスカベンジングがML385によって抑制されることも観察しました。これについては、不均衡なレドックスホメオスタシスが25μMの濃度でPinoの容量を超える過剰なROS生成を誘発したという仮定を提唱しました。 この仮定を証明するために、Nrf2 /HO-1経路の遮断によって引き起こされるROS生成を十分なPinoが打ち消すことができるかどうかを検出するために濃度勾配を調整することが提案されました。 ROSの生成は、一般にミトコンドリアからの電子リーク、活性化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシゲナーゼ、一酸化窒素シンターゼの脱共役、および高度なグリコシル化産物の蓄積に起因するため、PinoがROSを妨害した詳細なメカニズムを調査するためにさらに詳細な研究を行うことができます。生成し、ROSの蓄積を排除しました。
研究の限界
現在の研究にはいくつかの制限があります。 結果の精度に大きな影響を与える可能性のある梗塞境界ゾーンの定義には主観的なバイアスがあったことを認識しなければなりません。 この制限を解決するために、病理学的セクションは3人によって選択されましたが、バイアスを完全になくすことはできませんでした。 さらに、いくつかのウエスタンブロット画像は、図の品質に悪影響を及ぼしたポリクローナル一次抗体に起因する複数のバンドを示した。 また、Nrf2 siRNAやアデノウイルスのトランスフェクションではなく、Nrf2阻害剤であるML385を使用したため、説得力が低下したことも注目に値します。 最後になりましたが、ピノの抗酸化メカニズムは複雑であり、さらに解明するためにさらなる研究が必要でした。
結論
結論として、Pinoの投与は、心筋梗塞によって誘発された心不全を改善しました。これは、Nrf2 / HO -1経路において、部分的にOSの減衰を介して、心機能の改善と線維症、アポトーシス、血管新生などの構造的リモデリングによって証明されます。依存する方法。
この記事はChenらから抜粋したものです。 Mol Med（2021）27：100 https://doi.org/10.1186/s 10020-021-00363-7
