A要約

バックグラウンド：ビスレゾルシノールは、ヘリコプシス末端の幹（ヤマモガシ科）の主成分として単離された。 最近、レゾルシノールは美白有効成分として様々な化粧品に配合されています。 レゾルシノールの構造模倣のため、老化酵素アンタゴニストとしてのビス レゾルシノールの利点がこの研究で実証されました。

関連する研究によると、カンサスは「寿命を延ばす奇跡のハーブ」として知られる一般的なハーブです。 主成分はシスタノシドで、抗酸化作用、抗炎症作用、免疫機能促進作用などさまざまな作用があります。 シスタンケと美白のメカニズムは、シスタンケ配糖体の抗酸化作用にあります。 人間の皮膚のメラニンはチロシナーゼによるチロシンの酸化によって生成されますが、その酸化反応には酸素の関与が必要となるため、体内の酸素フリーラジカルはメラニン生成に影響を与える重要な因子となります。 シスタンケには抗酸化物質であるシスタノシドが含まれており、体内のフリーラジカルの生成を減らし、メラニンの生成を抑制します。

ホワイトニングにはカンカ・ツブロサをクリックしてください

詳細については:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

方法:ビスレゾルシノールは、H.ターミナルの幹の粗エタノール抽出物から、それぞれ溶媒抽出および分取クロマトグラフィーによって精製した。 この化合物のコラゲナーゼ、エラスターゼ、チロシナーゼに対する阻害活性を、別の分光学的手法を使用して調べました。 分子ドッキングは、酵素活性部位周囲の物質の可能な相互作用を予測するために実行されました。

結果：ビスレゾルシノールとカフェ酸のコラゲナーゼに対する IC50 値は、それぞれ 156.7 ± 0.7 と 308.9 ± 1.6 μmole L-1 でした。 エラスターゼ活性については、ビス レゾルシノールおよびウルソール酸について、それぞれ 33.2 ± 0.5 および 34.3 ± 0.3 μmole L-1 の IC50 が測定されました。 ビスレゾルシノールは 22.8 μmole L-1 の IC50 を示し、チロシナーゼに対して阻害性を示し、α-アルブチンでは 78.4 μmole L-1 の IC50 が存在しました。 ビスレゾルシノールは、それぞれ-5.89、-5.69、および-6.57 kcal mol-1の結合エネルギーでコラゲナーゼ、エラスターゼ、およびチロシナーゼに結合しました。 これらの結合エネルギーは、試験した阻害剤と同じ範囲内でした。 構造内の芳香族フェノール基は、酵素との結合相互作用の原理およびサポートに関与しています。 ヒドロキシル基による水素結合と芳香環からのπ関連引力により、ビス レゾルシノールへの結合の多様性がもたらされました。

結論：H末端から精製されたビスレゾルシノールは、老化酵素拮抗剤として化粧品に配合するのに役立つ可能性がある。

科目 生化学、生物情報学、細胞生物学、皮膚学、データマイニング、機械学習

キーワードヘリオプシス末端、ビスレゾルシノール、コラゲナーゼ、エラスターゼ、チロシナーゼ、アンチエイジング特性、分子ドッキング、酵素阻害

序章

ビスレゾルシノール、(8'Z)-3、5-ジヒドロキシ-1-[16'-(3'', 5''-ジヒドロキシフェニル)-8'-ヘキサデセン{{ 11}}′-イル]ベンゼンは、ヤマモガシ科の植物であるヘリコプシス終末（クルツ）スルーマーの幹から豊富な成分として単離されており、ベトナムの民族によって肝臓保護効果のために使用されてきました。 現在までに、抗炎症剤、マロンジアルデヒド (MDA) 産生の阻害剤、肝保護剤としてのこの化合物の医学的利点が in vitro および in vivo で明らかにされています (Giang et al., 2019)。 ビスレゾルシノールの分子には、メタ-C7H14C=CC7H14 結合で結合した 2 つのレゾルシノール分子 (EC No 203-585-2) が含まれていることは明らかです (図 1A)。 レゾルシノールは最近、ホワイトセラピー用の顔用濃縮美容液の形で使用されています。 ベルギー、ブリュッセルの消費者安全科学委員会 (SCCS 1270/09、欧州委員会、消費者安全科学委員会、2010) に基づいて、レゾルシノールはまつげの着色を目的とした製品の酸化剤として、最大 1.25 パーセントの濃度範囲で規制されています。またはヘアローションやシャンプーに最大 0.5 パーセントの濃度範囲で含まれます。 このように、レゾルシノールの化粧品への応用は多岐にわたります。 美白剤では、表皮の基底細胞層に存在するメラノサイトによるメラニン合成の阻害が想定されています。 チロシナーゼ (EC 1.14.18.1) は、L-チロシンが基質として使用されるメラニン生成を触媒するための重要な酵素です。 メラニンは紫外線によるダメージから皮膚を守るのに役立ちますが、過剰なメラニン生成は色素沈着過剰、そばかす、シミの原因となることがあります。 レゾルシノールに加えて、異なる化学構造を持つさまざまな合成および天然化合物が抗チロシナーゼ活性を示すことが実証されています (Dobos et al., 2015)。

紫外線は皮膚の老化を引き起こす主要な外的要因です。 その代わり、紫外線にさらされた後に内部で生成される活性酸素種（ROS）と過酸化脂質によって、皮膚は時間の経過とともに老化する可能性があります。 過酸化脂質の代謝による二次生成物は、細胞外マトリックス (ECM) のエラスチンおよびコラーゲン線維を損傷する可能性があります。 したがって、紫外線にさらされると、皮膚の乾燥、弾力性の喪失、およびシワが発生する可能性があります。 私たちの知る限り、ECMは正常な組織構造を維持するために定期的に再構築され、期限切れの組織タンパク質はコラゲナーゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼやエラスターゼなどのセリンプロテアーゼによって適切に分解されます（Thring、Hili、Naughton、2009）。 さらに、老化酵素の量と活性の両方が酸化ストレスによって増加し、広範なECM分解と進行性の老化につながります（Sherratt et al.、2019）。 したがって、金属イオンと錯体を形成できる化合物は、それに応じてコラゲナーゼ、エラスターゼ、およびチロシナーゼを阻害すると予想される（Selvaraj et al., 2014）。 このプロジェクトは、チロシナーゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼに対するビス レゾルシノールの生物学的効果を in vitro で測定することを目的としており、それらの相互作用を分子レベルで明らかにするためにドッキング技術が実施されました。 ビスレゾルシノールにより老化プロセスを遅らせ、肌の外観を改善することが期待されています。

材料と方法

化学薬品および器具

化合物の精製、同定、および批准

H.ターミナルの幹のエタノール中の粗抽出物は、ベトナム、ハノイのベトナム国立大学化学部のPM Giang教授から、伝票標本番号HNIP-18473で寛大にも入手しました。 その後、メタノール／ｎ－ヘキサンでの分配を３回繰り返した。 メタノール層を蒸発させてほぼ乾燥させ、続いて酢酸エチル/1-ブタンに分配した。 酢酸エチル層を、その体積が８０パーセント減少するまで蒸発させた。 次いで、得られた粘稠な液体を、次のようなクロロホルム/メタノール勾配溶出を使用してシリカゲルカラム上で精製した:100パーセントクロロホルム、30:1、20:1、10:1、7:1、5:1、3:1、3クロロホルム/メタノール:2、2:1、および 100% メタノール。 ５：１混合溶媒からの溶離液を収集し、４分の１の体積まで蒸発させ、続いてメタノールとアセトンの勾配溶出を使用してＯＤＳカラム上で分離した。 目的の化合物、すなわちビス レゾルシノール (図 1) は、70% アセトンを含む溶離液から得られ、機器ライブラリ データに関する MS、NMR、および IR 分光法によって確認されました。 薄層クロマトグラフィーを純度の推定に使用しました。

生物活性アッセイ

インビトロでは、ビスレゾルシノールおよび既知の阻害剤に対するコラゲナーゼ、エラスターゼ、およびチロシナーゼの酵素阻害アッセイからなる実験を以下のように実施した。

コラゲナーゼ阻害

最近の抗コラゲナーゼ アッセイは、Widyowati らによって以前に記載されたものから修正されました。 （2016年）。 簡単に言うと、400 mmol L-1 NaClおよび10 mmol L-1 CaCl2を補充した50 mmol L-1 トリシン緩衝液pH 7.5を緩衝希釈剤として使用した。 Clostridium histolyticum (EC.3.4.24.3) 由来のコラゲナーゼを緩衝液に 1 mg L-1 の濃度で溶解しました。 酵素基質である MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2 を事前に DMSO に溶解し、その後緩衝液で 1 mmol L-1 の濃度に希釈しました。 DMSOに溶解したサンプルをバッファーを使用してさまざまな濃度に希釈しました。 2-μl のサンプル溶液を 100 μl の酵素溶液と 37℃で 10 分間インキュベートしました。 次に、50-μl の基質を加え、完全に混合しました。 405 nm での蛍光発光 (F) を直ちに記録し、励起に 320 nm の波長を使用して 30 分間継続的に監視しました。 カフェ酸を位置コントロールとして使用しました (図 1)。 ネガティブコントロールは水を用いて実施した。 阻害パーセント (パーセント) は、以下の方程式から計算されました。

阻害パーセント {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100。

エラスターゼ阻害

Abhijit & Manjushree (2010) によるアッセイを一部変更して適用しました。 簡単に説明すると、緩衝系は、0.2 mM トリス-HCl 緩衝液 (pH 8.0) でした。 1 μg mL-1 ブタ膵臓エラスターゼ (EC.3.4.21.36) の溶液を滅菌水で調製しました。 酵素基質である N-スクシニル-Ala-Ala-Ala-p-ニトロアニリド (SANA) を、80 mmol L-1 の濃度まで緩衝液に溶解しました。 DMSOに溶解したサンプルを緩衝液を用いて様々な濃度に希釈した。 100-μl のサンプル溶液を 50 μl の酵素溶液と混合し、15 分間インキュベートしました。 その後、50μlの酵素基質溶液を添加し、十分に混合した。 OD410は、マイクロプレートリーダーを使用して、直ちに(0分)、および37度で一晩(o/n)インキュベートした後測定した。 ウルソール酸をポジティブコントロールとして使用し(図1)、水をネガティブコントロールとして使用しました。 阻害率 (パーセント) は次の方程式で計算されました。

阻害パーセント {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

チロシナーゼ阻害

使用したチロシナーゼ阻害アッセイは、以前に記載された方法 (Jiratchayamaetharakul et al., 2020) から適応されました。 簡単に言うと、アッセイは、0.05 mol L-1 リン酸緩衝液 pH 6.8 中で実施されました。 マッシュルームチロシナーゼ (EC.1.14.18.1) をバッファーに 100 単位 mL-1 の濃度で溶解しました。 酵素基質である L-チロシンは、緩衝液中で 0.25 mg mL-1 の濃度に調製されました。 DMSOに溶解した試験化合物を0.625～10 mg mL-1の範囲の濃度に希釈しました。 96- ウェルプレートのウェルに、10 μl のサンプルと 40 μl の L-チロシン溶液を混合し、室温で 10 分間インキュベートしました。 その後、50μlの酵素溶液を接種し、完全に混合した。 その後、氷上で１分間インキュベートすることにより反応を停止させた。 OD475 はマイクロプレートリーダーを使用して測定しました。 - アルブチンと水をそれぞれ陽性対照 (図 1) と陰性対照として使用しました。 阻害率 (パーセント) は、次の式によって計算されました。

分子ドッキング研究

リガンドと受容体の調製

ビス レゾルシノール (CID 8917124) および基質および阻害剤を含む参照化合物の三次元 (3D) 構造は、分子ドッキング研究のために PubChem データベースからダウンロードされました。 オンライン SMILES Translator および Structure File Generator を使用して、リガンド構造を Protein Data Bank (PDB) 形式のファイルに調製しました。 コラゲナーゼ (PDB ID 2Y6I)、エラスターゼ (PDB ID 1BRU)、チロシナーゼ (PDB ID 2Y9X) などの酵素の結晶構造は、RCSB タンパク質データベースから取得しました。 選択されたすべてのタンパク質構造から、水とそれに付着した分子が切り取られました。 一方、極性水素原子は、AutoDockTools 1.5.6 によって結晶化されたタンパク質構造に追加されました。 分子ドッキングを実行する前に、標的タンパク質およびその他の使用した化合物のファイルを PDBQT 形式で保存しました。

活性部位残基の選択と分子ドッキング

活性サイト予測のグリッドおよびドッキング プロトコルは、AutoDockTools 1.5.6 を使用して準備されました。 グリッドサイトは、0.375 Åの間隔で設定されました。 xyz 寸法は、コラゲナーゼの場合は 126-135-160 Å3、エラスターゼの場合は 130-120-126 Å3、チロシナーゼの場合は 80-80-80 Å3 に設定されました。 グリッド ボックスの中心 (AutoDockTools のオフセット値) は 31.869 (5.000)、-19.41 (-25.{{20}})、コラゲナーゼの場合は 17.815 でした。 、30.048 (-0.972)、51.253 (-2.722)、エラスターゼについては17.6、および-8.407 (-1.000)、-23.795 (-0.250)、-36.019 (-3.500) ) それぞれチロシナーゼ。 タンパク質構造を剛体として使用し、リガンド化合物を柔軟な分子として設定しました。 ドッキング研究は、AutoDock4 バージョン 4.2 によって実装された Lamarckian 遺伝的アルゴリズム (GA) を使用して実行されました。 GA 実行数は 50 で、一般的なサイズは 200 でした。結合エネルギー (ΔGbind) は ADT によって分析されました。 インタラクションは、BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA、2020) を使用して視覚化されました。 化合物とタンパク質受容体間の分子相互作用は、BIOVIA Discovery Studio ソフトウェア (BIOVIA、2020) を使用して分析および視覚化されました。 タンパク質結合部位化合物の構造は、Visual Molecular Dynamics (VMD) パッケージ (Humphrey、Dalke & Schulten、1996) を使用して視覚化されました。

統計分析

結果

主要成分は、それぞれ溶媒抽出および逆相 HPLC 技術を使用して、H. ターミナルの幹から首尾よく精製されました。 取得した 1 H-NMR および 13 C-NMR スペクトルを SciFinder (https://scififinder.cas.org/) を通じて参照物質のスペクトルと比較したところ、(8'Z)-1,{ {6}}ジヒドロキシ-5- [16'-(3'',5''-ジヒドロキシフェニル)-8'-ヘキサデセン-1'-イル] ベンゼン (Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02)。 ビスレゾルシノールの一種として分類されました。 この最近のビス レゾルシノールは、C28H40O4 の分子式を持ち、分子量は 463.2819 ダルトンでした。 抽出収率は、幹の乾燥重量に基づいて 0.086 パーセントと計算されました。 得られた 1 Hおよび 13 C-NMRスペクトルに関して、その純度は98パーセント以上でした（図S1およびS2を参照）。

インビトロ生物活性分析

コラゲナーゼ、エラスターゼ、チロシナーゼなどの老化酵素に対するビスレゾルシノールの拮抗作用は、別個の分光法を使用して in vitro で測定されました。 結果を表 1 および図 2 にまとめました。コラゲナーゼ阻害については、MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 を使用して 50 ～ 550 μmol L-1 の範囲の試験サンプルを調製しました。酵素基質としてのコーヒー酸と酵素阻害剤としてのカフェ酸。 156.7 μmol L-1 の濃度のビスレゾルシノールは酵素活性を 50 パーセント (IC50) 減少させることが示されました。 代わりに、カフェ酸の IC50 は 308.9 ± 13.7 μmol L-1 でした。 したがって、ビスレゾルシノールの抗コラゲナーゼ活性は、カフェ酸よりも著しく強かった。

詳細については: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501