PRAT 1は、ERSアポトーシスメカニズムを阻害して心筋細胞アポトーシスをH2O 2-誘発小胞体ストレスから保護することにより、DeserticolaPhG-REをCistanchesします。
Mar 02, 2022
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中日聯大学薬学部、長春130033、中国
連絡はQianYuに宛ててください。 yuqian@jlu.edu.cn
2020年6月9日受領。 2020年7月15日改訂。 2020年7月24日受理。 2020年9月25日公開
アカデミックエディター：ミシェルマンスールマチャド
Copyright©2020TianweiLan andQianYu。 これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの下で配布されるオープンアクセスの記事であり、元の作品が適切に引用されている限り、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、および複製を許可します。
ハーブCistancheニクジュヨウいくつかの心筋保護効果があります。 この研究では、PhG-REが心筋細胞を保護するメカニズムを説明し、この保護が小胞体ストレス（ERS）に関連するアポトーシスメカニズムを調節することによって発生するかどうかを検証しようとしました。 ラット心筋細胞を150ugmL-1 PhG-REに24時間曝露し、次に100μmolmL-1H2O2に18時間曝露して、ERSを誘導し、細胞損傷モデルを確立しました。 実験の精度を検証するために、特定のERS活性化因子であるタプシガルギン（TG）とERS阻害剤である4-フェニル酪酸（4- PBA）を使用しました。 私たちの結果は、PhG-REが細胞の生存率を大幅に改善し、細胞を保護し、細胞の損傷とアポトーシスを減少させることを示しました。 PhG-REは、ERストレスによって誘発されるアポトーシスと損傷から心筋細胞を保護する上で、ERS阻害剤4-PBAと同様の役割を果たしました。 さらに、PhG-REは、ERS関連アポトーシス因子GRP78、CHOP、およびカスパーゼ-12のmRNA発現と、ERS関連アポトーシス因子GRP78、CHOP、カスパーゼ-12のタンパク質発現を大幅に減衰させました。およびp-JNK。 まとめると、これらの発見は、PhG-REが心筋細胞を効果的に保護し、細胞のアポトーシスと損傷を軽減できることを示唆しています。これは、ERS関連アポトーシスの調節に関連している可能性があります。
1.はじめに
ニクジュヨウ（C.deserticola）は、砂漠の環境で育つ伝統的な漢方薬で使用される薬草の1つです。 Theフェニルエタノイド配糖体-豊富な抽出物（PhG-RE）はの主要な有効成分ですニクジュヨウ。 研究によると、PhG-REは心筋を虚血再灌流（I / R）損傷から保護することができます[1]。
ERSが心筋細胞で発生し始めると、グルコース調節タンパク質78（GRP78）のレベルが上昇し、ERSによって誘発される損傷に拮抗します。 ERSが進行すると、アポトーシスが開始され、CCAAT /エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（CHOP）、c-Jun N末端キナーゼ（JNK）、およびアスパラギン酸システイニル特異的プロテイナーゼ-12（カスパーゼ{{8 }}）増加します。 たとえば、HFラットの心筋細胞におけるGRP78、CHOP、および切断されたATF6（c-ATF6）の発現は大幅に増加し、PERK（p-PERK）、IRE1（p-IRE1）、およびp-JNKが活性化されます。 [2]。 さらに、I / R損傷によって誘発されるERSは、GRP78およびCHOPの発現を増加させます[3]。 PERKとeIF2のリン酸化レベルが上昇します[4]。 アポトーシス促進タンパク質であるBaxおよびCaspase-3の発現が増加し、細胞破裂および心筋リモデリングを引き起こし[5]、心筋梗塞および心筋酵素活性の領域が増加します[3]。 私たちの以前の研究で、PhG-REは心筋を虚血再灌流傷害から保護し、I/Rによって誘発される心筋梗塞の領域を大幅に減らすことができることがわかりました[1]。 ただし、PhG-REがERS関連アポトーシスを抑制し、それによって心筋細胞の喪失とアポトーシスを減少させることができるかどうかは不明です。 この研究では、細胞をPhG-REで前処理して、PhG-REがH2O 2-誘発性ERSを阻害し、心筋細胞の喪失とアポトーシスを減少させることができるかどうかを観察しました。 特定のERS活性化因子であるタプシガルギン（TG）、およびERS阻害剤である4-フェニル酪酸（4- PBA）を使用して、ERSの媒介が細胞アポトーシスを効果的に低減できるかどうか、およびこのプロセスが効果的に減少するかどうかをさらに検証しました。 ERS関連を仲介することが示されているGRP78、CHOP、JNK、およびカスパーゼ-12の発現レベルに関連していますアポトーシス.
Cistancheは細胞アポトーシスを防ぐことができます
2。材料と方法
2.1。 試薬。
すべての手順を繰り返すことができるように、材料と方法のセクションは網羅的である必要があります。 いくつかの方法が説明されている場合は、見出しのサブセクションに分割される場合があります。 H9c2ラット心筋細胞は、中国科学院（上海、中国）のセルバンクから入手しました。C. ニクジュヨウCistancheニクジュヨウPhG-REはChangchunMedicinalMaterial Co.（Changchun、China）から入手し、Dr。Zhong-ying Liu（吉林大学薬学部）によって特定され、吉林大学薬学部の植物園に寄託されました（バウチャー標本番号：YQCD2014）。 ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）は、GIBCO（ニューヨーク州グランドアイランド）から入手しました。 タプシガルギンと4-PBAは、Sigma（St. Louis、MO）から入手しました。 乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）活性アッセイキットおよびCCK -8キットは、Dojindo Molecular Technologies（東京、日本）から購入しました。 ウシ胎児血清（FBS）は、HyClone（Utah、USA）から購入しました。 アネキシンV-FITC細胞アポトーシスアッセイキットは、Beyotime Biotechnology（上海、中国）から購入しました。 トリプシンはBeijingSolarbioLife Sciences（北京、中国）から購入しました。 ReverTra Ace qPCR RTキットはTOYOBO（東京、日本）から購入しました。 FastStart Universal SYBR Greenマスターミックス（Rox）は、Roche（バーゼル、スイス）から購入しました。
2.2。 抗体。
ウサギポリクローナルGADD153/CHOPおよびウサギポリクローナルGRP78/HSPA5 Absは、Novus（Colorado、USA）から購入しました。 マウス/ラットカスパーゼ-12アフィニティー精製ポリクローナル抗体は、R＆D Systems（ミネソタ州、米国）から購入しました。 Phospho-SAPK / JNK（Thr183 / Tyr185）（81E11）ウサギおよび-アクチン（13E5）ウサギmAbは、Cell Signaling Technology（Massachusetts、USA）から購入しました。 蛍光二次抗体は、LI-COR Biosciences（Nebraska、USA）から購入しました。
2.3。 グループ化と治療。
対数増殖期のH9c2細胞を選択し、以下のグループで処理しました。（1）コントロールグループ：H9c2心筋細胞を完全培地で培養しました。 （2）PhG-REグループ：150 ugmL-1PhG-REを含む培地で細胞を24時間処理しました。 （3）ERS誘発損傷モデルグループ（H2O2グループ）：細胞を100μmolmL-1H2O2を含む培地で18時間処理しました。 （4）（PhG-RE）–H2O2グループ：細胞を150 ug mL-1 PhG-REを含む培地で24時間処理した後、100μmolmL-1H2O2で18時間処理しました。 （5）（4- PBA）
–H2O2グループ：細胞を5 mmol・mL-1 4- PBAを含む培地で24時間処理した後、100μmol・mL-1H2O2で18時間処理しました。 （6）TGグループ：細胞は
50 nmol・mL-1TGを含む培地で18時間。 （7）（PhG-RE）-TG：細胞を150 ug・mL-1 PhG-REを含む培地で24時間処理した後、50 nmol・mL-1TGで18時間処理しました。
2.4。 細胞培養。
H9c2心筋細胞は、10％FBSと1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEMで、5％CO2のインキュベーター内で37度で培養されました。 完全な培地は2日ごとに交換されました。 細胞を顕微鏡で観察したところ、紡錘状によく成長していた。 増殖密度が70％〜85％に達したとき、細胞を1：4の比率で継代培養しました。
2.5。 CCK-8細胞生存率の評価。
H9c2細胞を顕微鏡で検査し、対数増殖期の細胞を選択しました。 細胞懸濁液はトリプシン消化によって得られ、1000rmin-1で5mLの遠心分離管で5分間遠心分離されました。 残留液を捨てた後、3mlのDMEM完全培地を使用して細胞ペレットをウェルあたり100μLに再懸濁し、
5.0 103細胞を顕微鏡でカウントしました。 細胞を96-ウェルプレートに移し、インキュベーター（37度、5％CO2）で24時間培養して、完全に接着した細胞を得ました。 光学密度（OD）は450nmの波長で測定されました。
細胞生存率（パーセント）（OD実験グループ-ODブランクグループ）/（ODコントロールグループ-ODブランクグループ）×100パーセント。
2.6。 細胞損傷の分光光度測定。
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）は細胞質内の酵素であり、細胞損傷時に放出され、培地中に安定して存在します。 細胞損傷の程度は、培地中のLDHの活性を測定することによって決定することができます。 この実験は、キットの指示に従って実施されました。 ODは490nmの波長で測定されました。 各グループには3つの井戸がありました。
2.7。 アネキシンV-FITC/PI染色によるアポトーシスの検出。
上清を除去し、フローサイトメトリーチューブに移しました。 トリプシン消化容器の底に付着細胞を含む細胞懸濁液を調製した。 懸濁液を1.2 103r min-1で6分間遠心分離した後、上清を廃棄し、細胞ペレットをPBSで3回洗浄しました。 この実験は、アネキシンV-FITC細胞アポトーシスキットの指示に従って実施されました。 細胞を暗所で室温で15分間培養した後、細胞をフローサイトメーターで分析した。
2.8。 GRP78、CHOP、JNK、およびカスパーゼ-12の相対的mRNA発現のRT-qPCR測定。
全細胞RNAをTRIzol試薬で抽出しました。 抽出の完全性を評価するために、2マイクロリットルのトータルRNAをゲル電気泳動で分離しました。 分光光度計を使用して、OD（260）/ OD（280）値を測定および計算しました。 TOYOBO ReverTra Ace qPCR RTキットの説明書に従って、トータルRNAを逆転写してcDNAを生成しました。 表1にプライマーのリストを示します。 Roche FastStart Universal SYBR Greenマスターミックス（Rox）の指示によると、反応条件は次のとおりです。95度で10分間、95度で10秒間、58度で30秒間、72度で30秒間の初期変性。 s合計45サイクル。
2.9.GRP78、CHOP、JNK、p-JNK、およびカスパーゼ-12のタンパク質発現のウエスタンブロット分析。
タンパク質溶解物（50 ug）は、10％分離ゲルでの電気泳動と、それに続くPVDFメンブレンへの転写によって分離されました。 PVDFメンブレンは、5％のスキムミルクを含むTBS-Resolutionで、室温で90分間ブロックされました。 ブロックされたPVDFメンブレンを抗体1、2、3、および4と4度で一晩インキュベートし、次にヤギ抗ウサギIgG（1：1000）と室温で90分間インキュベートしました。 最後に、メンブレンは2色の赤外線レーザーイメージングシステムで開発されました。
2.10。 統計的および分析的方法。
この調査のデータはSPSS24.0ソフトウェアで処理され、結果は平均値±SDとして表示されます。 複数のグループのデータをANOVAと比較し、2つのグループのデータをt検定と比較しました。 P <0 .05の値は、統計的有意性があると見なされました。="">
フェニルエタノイド配糖体のcistanche
3.結果
3.1。 細胞生存率に対するPhG-REの影響。
図1に示すように、対照群と比較して、PhG-RE群のH9c2細胞の生存率は有意に変化しませんでした（P>0。05）が、 H2O2グループとTGグループの両方のセルが大幅に減少しました。 H2O2グループと比較して、（PhG-RE）-H2O2グループと（4- PBA）-H2O2グループの両方の細胞の生存率が大幅に増加しました。 TG群と比較して、（PhG-RE）-TG群の細胞生存率は有意に増加しました。 すべての結果は統計的に有意でした（P <>
3.2。 PhG-REon細胞損傷の影響。
図2に示すように、PhG-REグループの細胞は対照グループの細胞と比較して損傷を受けていましたが、その損傷は統計的有意性に達しませんでした（P>0。05）。 H2O2およびTGグループの細胞損傷は大幅に増加しました。 H2O2グループと比較して、（PhG-RE）-H2O2および（4- PBA）-H2O2グループの細胞損傷は大幅に減少しました（P <0。01）。 tgグループと比較して、（phg-re）-tgグループの細胞損傷は大幅に減少しました（p=""><>
3.3。 細胞アポトーシスに対するPhG-REの影響。
図3に示すように、対照群と比較して、PhG-RE群の細胞アポトーシスは有意に変化しませんでした（P>0。05）が、H2O2およびTGの細胞アポトーシスはグループは大幅に増加しました（P <0.01）。 h2o2グループのそれと比較して、（phg-re）-h2o2および（4-="">
グループは大幅に減少しました（P <{{0}}。01）。 tgグループと比較して、（phg-re）-tgグループの細胞アポトーシスは有意に減少しました（p=""><>
3.4。 GRP78、CHOP、JNK、およびカスパーゼ-12mRNAの発現に対するPhG-REの影響。
各実験グループの相対的なmRNA発現は、RT-qPCRで定量的に測定されました。 図4に示すように、対照群と比較して、GRP78、CHOP、およびカスパーゼ-12の相対的なmRNA発現は、 H2O2グループ、およびJNKの相対的なmRNA発現も増加しました（P<0。05）。><0。01）。 h2o2グループと比較して、（phg-re）-h2o2および（4-="" pba）-h2o2グループにおけるgrp78、chop、およびカスパーゼ-12の相対的なmrna発現は大幅に減少しました（p="">< 0。01）、jnkの相対的なmrna発現は有意に変化しませんでした（p=""> 0.05）。 TGグループと比較して、（PhG-RE）-TGグループのGRP78、JNK、およびカスパーゼ-12の相対的mRNA発現は減少し（P <0.01）、chopの相対的mrna発現は減少しませんでした大幅に変化します（p> 0.05）。
3.5。 GRP78、CHOP、およびカスパーゼ-12のタンパク質発現に対するPhG-REの影響。
図5は、GRP78、CHOP、およびCaspase-12のタンパク質発現レベルを示しています。 対照群と比較して、H2O2およびTG群におけるこれら3つのタンパク質の発現は、細胞を処理した後に有意に増加しました（P<0。01）。 h2o2グループと比較して、grp78、chop、およびカスパーゼ-12の発現は、（phg-re）-h2o2および（4-="" pba）-h2o2グループで大幅に減少しました（p=""><0.01） 。="">
3.6。 JNKおよびp-JNKに対するPhG-REの影響。
図6に示すように、対照群と比較して、H2O2およびTG群でのp-JNKの発現は有意に増加しました（P<0。01）。 h2o2グループと比較して、（phg-re）-h2o2および（4-=""><0。{{24} }="" 1）。="" tgグループと比較して、（phg-re）-tgグループのp-jnkの発現は有意に減少しました（p=""><0.01）。 jnkの発現に関しては、どの実験群にも有意な変化はありませんでした（p=""> 0.05）。
Cistanche防ぐことができます細胞アポトーシス
