CistancheTubulosaからのフェニルエタノールグリコシドの予防効果

連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You、etal。

概要

バックグラウンド：Cistancheカンカニクジュヨウ免疫を調節するために広く使用されている伝統的な中国の漢方薬です。フェニルエタノイルド配糖体この植物からの（CPhGs）は主に有効な材料です。 この研究の目的は、ラットのBSA誘発性肝線維症および肝星細胞が関与する関連分子メカニズムに対するCPhGの予防および治療効果を評価することでした。 別の伝統的な漢方薬であるBiejiarangan（BJRG）を陽性対照として使用しました。

方法：インビボ実験では、75匹のSDラットをランダムに6つのグループに分けました：正常（蒸留水処理）、モデル（BSA処理）、陽性薬物（BSA処理+ BJRG 600 mg / kg /日）、およびBSA処理プラスCPhG（125、250、および500 mg / kg / day）グループ。 肝臓および脾臓の指標、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、ヘキサデセン酸（HA）、ラミニン（LN）、III型プロコラーゲン（PCIII）、IV型コラーゲン（IV-C）、ヒドロキシプロリン（Hyp ）、およびトランスフォーミング成長因子1（TGF - 1）をラット肝臓で測定しました。肝硬変の組織病理学的グレードは、H＆Eおよびマッソンのトリクローム染色を使用して各グループで評価しました。 TGF - 1、コラーゲンI（Col-I）、およびコラーゲンIII（Col-III）の発現は、免疫組織化学的染色法によって決定されました。 これらの効果は、定量的リアルタイムPCR分析によってNF-κBp65およびCol-Iの発現レベルを決定することにより、invitroでさらに評価されました。 Col-Iタンパク質の発現もウエスタンブロッティングで調べました。

結果：CPhGのすべての用量群（125、25 0、および5 0 0 mg / kg / day）は、肝臓および脾臓指数を有意に低下させ、ALT、AST、HA、LNを低下させました。 、PCIII、IV-C血清レベル、TGF - 1含有量（P<0。01、p><0。01、およびp><0.01）、およびhypコンテンツ。 cphgはまた、肝細胞の腫れを著しく軽減し、肝細胞の壊死と炎症性細胞の浸潤を効果的に防止しました。="" 免疫組織化学的結果は、cphgがtgf="" -="" 1（p=""><0.01、p><0.01、およびp><0.01）、col-i、およびcol-iiiの発現を有意に減少させたことを示しました。 hsc-t6に対するcphg（100、75、50、および25="" ug="" ml）のin="">

結論：ＣＰｈＧは、有意な抗肝線維症効果を有し、肝線維症の治療のための肝保護剤として使用され得る。

キーワード：肝線維症、カンカニクジュヨウ、フェニルエタノイルド配糖体、ケモカインBSA、予防と治療

フェニルエタノイルド配糖体のCistancheカンカニクジュヨウ

バックグラウンド

肝線維症は、さまざまな要因によって誘発される慢性肝炎の病因で発生する重度の肝損傷に対する創傷治癒反応です。 これらの要因は、ウイルス感染、アルコール乱用、胆汁うっ滞、代謝性疾患および自己免疫疾患です[1–3]。 細胞外マトリックス（ECM）の進行性の蓄積とリモデリングの減少は、肝臓の正常な構造を破壊し、肝線維症を引き起こします[4]。 肝線維症は慢性肝疾患において重要であり、しばしば不可逆的な肝硬変および発癌に発展します。 現在、肝線維症の治療のための方法や効果的な薬はありません。 したがって、線維症および癌への肝損傷の進行を弱める抗肝線維症薬を見つけることが急務である。

CistancheカンカニクジュヨウW（ハマウツボ科）は、中国の新疆ウイグル自治区南部で広く栽培されている寄生植物です[5]。 人々は通常、腎臓を活性化し、血液に栄養を与え、腸をリラックスさせ、老化を遅らせるためにそれを使用します。 中国薬局方[6]に正式に記載されています。Cistancheカンカニクジュヨウさまざまなアクティブコンポーネントが含まれています。 これらには以下が含まれますフェニルエタノイルド配糖体（CPhGs）、イリドイド、および多糖類。 の多くのアクティブコンポーネントの1つCistancheカンカニクジュヨウ、CPhGshaveは、invivoおよびinvitro研究の両方で、説得力のある抗酸化作用、抗疲労作用、神経保護作用、および抗炎症作用を示しました[7]。 近年、CPhGには肝保護効果があることが報告されています。 これらの影響の根底にある潜在的なメカニズムは、フリーラジカルの除去、肝膜の保護、免疫調節、アポトーシスの阻害、HBsAgおよびHBeAgの発現の阻害、およびHBV DNA複製の阻害などです[8–11]。 ただし、文献のいくつかの研究は、GPhCの抗肝線維症効果を扱っています。 したがって、この研究は、ラットにおけるウシ血清アルブミン（BSA）誘発性肝線維症のモデルを使用することにより、GPhCの抗肝線維症効果を調査することを目的とした。 関連する分子メカニズムは、HSC-T6細胞で調査されました。

メソッド

化学薬品および試薬

ヒドロキシプロリンキット（アルカリ加水分解）（ロット：20140616）は、南京江城生物工学研究所（中国）から購入しました。 ラットTGF- 1サンドイッチELISAキット（ロット：238240615）は、Lianke Biotech Co.、Ltd.（中国）から購入しました。 ウサギ抗コラーゲンI抗体（ロット：140619）、ウサギ抗コラーゲンIII抗体（ロット：980788 W）、およびウサギ抗TGF - 1抗体（ロット：140619）は、Beijing BiosynthesisBiotechnology Co.、LTD（Lot：140619）から提供されました。中国）。 通常の羊血清（作動油）（ロット：WP141214）、PV -6000（ロット：WK141225）、およびDABキット（ロット：K136621D）を同封し、中山ゴールデンブリッジバイオテック株式会社（中国）から購入しました。 一次抗体の検出は、2。抗体溶液（Alk-Phos。Conjugated、Anti-rabbit）および2. Invitrogen Company（USA）から購入した抗体溶液（Alk-Phos。Conjugated、Anti-mouse）（ロット：272387）を使用して行いました。 。

ウシ血清アルブミン（BSA）（ロット：SLBG8239V）は、Sigma（USA）から購入しました。 使用前に、BSAを通常の生理食塩水中で18 g / Lで調製し、細菌をろ過により除去し、BSAを4度で保存しました。 羊毛由来の脂質1gを含むフロイントの不完全アジュバント（ロット：AF0220LA14、上海元バイオテクノロジー株式会社（中国））を液体パラフィン2g（ロット：20130815、天津風湯ファインケミカル株式会社）と混合した。蒸気オートクレーブで滅菌し、4度で保存した。陽性薬物BJRGは、インナーモンゴルフルイメディカルサイエンス株式会社（中国）からBiejiarangan錠剤として入手した。BJRG薬物ストックは、BJRG錠剤を溶解して調製した。 600mg/kgの濃度の蒸留水。

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植物材料

Cistanche カンカニクジュヨウ（ハマウツボ科）は、中国の新疆ウイグル自治区のミンフェン地域から購入しました。 この資料は、新江のマテリアメディカ研究所のウイグル医学の主要研究所である研究者のJunZhaoによって認証されました。 バウチャーの標本は、新疆ウイグル自治区のマテリアメディカ研究所に寄託されました。

CPhGの準備

の乾燥およびスライスされた根茎Cistancheカンカニクジュヨウ（6. 0 kg）を70％エタノールで3回連続して還流抽出し、溶媒を除去してエタノール抽出物を得た。 AB -8樹脂を使用してエタノール抽出物を精製し、フェニルエタノイド配糖体（CPhGs）。 動物実験で異なる用量群に使用されたCPhGのストック溶液（それぞれ5 0 0 mg / kg、250 mg / kg、および125 mg / kg）を0.5％（5 g / L）のカルボキシメチルセルロース（5 g / L）に溶解しました。ナトリウム塩）。

CPhGの定量化

CPhGの2つの成分（エキナコシドとアクテオシド）の含有量は、以前に報告された方法（Zhangetal。2004）[12]を使用したHPLCによって決定されました。 HPLCは、UV検出器を備えた島津LC-10AHPLCを使用して実施しました。 HPLCカラムはPhenomenexGeminiODSカラム（250×4.6 mm、5μm）でした。 アイソクラティック移動相は、メタノール-アセトニトリル-1パーセントの酢酸（15：10：75、v / v / v）で構成されていました。溶出は40分間で、流速は0.6 mL/minに維持されました。 カラム温度は30度で一定に保たれました。 UV検出は334nmでした。

動物およびHSC-T6細胞株

[グレードSPF]健康な成体のオスのSprague–Dawley（SD）ラット（180–220 g）は、新疆医科大学動物センター、ライセンス番号：SCXK（新規）2011–0004から購入しました。 ラットには特定病原体除去（SPF）飼料を与えました。 動物実験に関連するすべての手順は、新疆医科大学第一付属病院の動物倫理委員会によって承認されました。 ラットは、制御された環境条件（25度および12時間の明/暗サイクル）でケージに収容され、標準的なラットペレットの餌と水道水を自由に摂取できました。 ラットは治療前に順応させた。

不死化ラット肝星細胞株、HSC-T6は、武漢プロセル遺伝子バイオテクノロジー株式会社から入手した。 （武漢、中国）。 HSC-T6細胞は、10％胎児ウシ血清（ギブコ、南アメリカ）、100 IU / mlペニシリン、および100 ug / mlストレプトマイシン（北京、中国）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（DMEM、北京、中国）で培養しました。 ）5％CO2の37度の加湿インキュベーター内。

BSAによる肝障害と治療

75匹のSDラットをランダムに6つのグループに分けました：正常（蒸留水処理）、モデル（BSA処理）、陽性薬物（BSA処理とBJRG 6 0 0 mg / kg /日） 、およびBSA処理とCPhG（125、250、5 00 mg / kg /日）グループ。 BSA処理とCPhG（125、250、5 00 mg / kg / day）のグループには、各グループに13匹のラットがあり、他のグループには、各グループに12匹のラットがいました。 BSA誘発性肝障害モデルは、一次感作とそれに続く免疫学的攻撃に分けられます）[13]。 正常群を除いて、他の群には、一次感作のために、1日目、15日目、22日目、29日目、および36日目に、0.5ml（9mg / ml）のBSAFreundの不完全アジュバントを複数回皮下注射した。 5回目の注射から7日後、ラット網膜静脈叢から血液を採取し、血清アルブミン抗体を検査しました。 ラット血清中のBSA抗体は二重寒天拡散法により検出された。 正常生理食塩水中の0.4mlのBSAを週2回10回BSA抗体陽性ラットの尾静脈から投与することにより、攻撃注射を行った。 注射の濃度と時間は、46日目で5。00、5.50、6。00、6.50,7。00、7.50、8.50、9.00、9.50、および10.00 g/Lでした。 、50日目、53日目、57日目、60日目、64日目、67日目、71日目、74日目、78日目。 正常群では、BSAの代わりに免疫学的一次（感作）および二次（攻撃）注射に通常の生理食塩水を使用し、他の条件はモデル群と同じでした。

正常群には、1 0 ml /kg/日の用量で蒸留水を経口投与した。 モデル群は10ml/kg /日0.5％CMC-Na溶液を経口投与しました。陽性薬物群は600mg /kg/日BJRGを経口投与しました。 BSA投与とCPhG（125、250、および500 mg / kg /日）のグループには、それぞれ125、250、および500 mg / kg /日のCPhGが経口投与されました。毎日の投与ラットは、最後の注射後2週間継続されました。

実験期間後、ラットを10％抱水クロラールの前に12時間絶食させ、すぐに安楽死させた。 各ラットから血清サンプルを収集し、すぐに使用した。 肝臓は2つの目的で採取されました：（1）Hypキット用の液体窒素での保存（2）組織学的および免疫組織化学的検査用の10％ホルムアルデヒドでの固定。 動物実験の全期間は93日でした。

フェニルエタノイルド 配糖体のCistanche予防効果があります

肝臓と脾臓の指数

肝臓と脾臓を腹腔切開により解剖し、4度の通常の生理食塩水で洗浄した。 ろ紙で余分な水分を吸収した後、肝臓と脾臓の重さを量り、対応する指標を計算しました：相対臓器重量=臓器重量（g）/個々の体重（g）×100パーセント[14]。

肝硬変のマーカーの分析

BSA誘発性肝障害に対するCPhGの保護効果は、ALTおよびAST（Mind ray自動生化学分析装置、A086A0182）を測定することによって評価されました。 肝硬変の発症と治療の効果は、HA、LN、PC III、およびIV-C（化学発光アナライザー、TaiGeKeXin、MP2808）を調べることによって決定されました。

HypコンテンツとTGF- 1分析

肝臓組織中のHypのレベルは、キットの指示に従って分光光度法によって決定されました。Hypのレベルは、Hyp（ug）/タンパク質（mg）として表されました。Hyp（ug / mg）=（測定されたOD -ブランクOD）/（標準ODブランクOD）×5（ug / ml）×10 /組織湿重量（ml / mg）。 TGF - 1の肝濃度は、ELISAキットを製造元の指示に従って使用して検出されました。線維症に対するCPhGの阻害効果は、TGF- 1の発現レベルによって確認されました。

組織病理学的検査

左葉の同じ部分の肝臓組織を切除し、10％ホルムアルデヒド溶液で固定しました。 組織を従来のH＆Eおよびマッソンのトリクローム染色で染色し、光学顕微鏡下で組織病理学的変化を観察した。 肝臓組織におけるI型コラーゲン、III型コラーゲン、およびTGF - 1の発現は、免疫組織化学的染色によって分析されました[15]。

半定量的免疫組織化学は、報告された方法[16、17]に従って実施されました。 次の分類がTGF- 1陽性細胞に使用されました。「-」はほとんど発現がないことを示します。20 =l; 「プラス」は、病変領域に個別に集められた陽性細胞を示します、21=2; 「プラスプラス」は、病変領域の周囲に集まった小グループの陽性細胞を示します22=4; 「プラスプラスプラス」は、23=8として表される分散した陽性細胞を示します。 結果は、階層的な統合を表しています。 コラーゲンタイプIおよびコラーゲンタイプIIIの発色度およびスコープは、統計分析のためにCRIに変換されました（発色度×発色範囲）。 発色度は、弱い「プラス」、中程度の「プラスプラス」、強い「プラスプラスプラス」に分けられます。 発色範囲は「プラス」に分けられ、その発色範囲<ビュー1 ;="" 「プラスプラス」、その発色範囲/="" 4-2="" 4;="" 「プラスプラスプラス」、その発色範囲2="" 4-3="" 4;="" 「プラスプラスプラスプラス」、その発色範囲="">3/4。 ブラインドスコアリングは、「プラス」が1の2人で実行されました。 「プラスプラス」は2、「プラスプラスプラス」は3、「プラスプラスプラスプラス」は4です。各セクションに3つの顕微鏡観察フィールド（倍率×200）をランダムに選択し、サンプルの平均レベルを半定量的レベル。

細胞実験

HSC-T6細胞を96-ウェルプレートにプレーティングしました。 最初に、細胞を10パーセントのFBSを含むDMEMで48時間培養しました。 次に、培地をFBSを含まないDMEMと交換して、細胞を12時間飢餓状態にしました。 次に、細胞を、5.0 ng / mLTGF - 1（FBSなし）を含むDMEMで24時間培養しました。 最後に、さまざまな濃度のCPhG（100ug / ml、50ug / ml、および25ug / ml）、アクテオシド（6 ug / ml、3 ug / ml、および1.5 ug / ml）、およびアンデキナコシド（500ug / ml、250ug / ml、および125ug/ml）を4つのウェルのプレートで実施し、48時間インキュベートした。

リアルタイムPCR分析

NF-κB、p65、およびcollagenIのmRNA発現レベルはリアルタイムPCRによって決定されました。 HSC-T6細胞でのmRNA発現を測定するために、細胞（4×1 0 5細胞）を10％FBSを含む3 mL DMEMを含む6ウェルプレートに播種し、37度および5％CO2で一晩インキュベートしました。細胞培養培地を無血清DMEMに変更しました。 次に、CPhG（100 ug / ml、50 ug / ml、および25 ug / ml）、アクテオシド（6 ug / ml、3 ug / ml、および1.5 ug / ml）、およびエキナコシド（500 ug / ml、250 ug / ml、および125ug / ml）をウェルに追加しました。 CPhGまたはモノマー組成物との48時間のインキュベーション後、TRIzol試薬（Invitrogen、USA）を使用して全RNAを抽出し、クロロホルムで15秒間激しく攪拌しました。 室温で3分間静置した後、ライセートを12、000×gで15分間、4度で遠心分離しました。 水相中のRNAをイソプロパノールで沈殿させ、上部の水相を新しいマイクロ遠心チューブに移しました。 0.75％エタノールを加えてRNAを沈殿させた後、マイクロ遠心チューブを12、000×g、4度で5分以内で遠心分離しました。 上清を除去し、RNAを室温で5〜10分間乾燥させました。 ラット-アクチン[GenBank：NM _031144。3]、コラーゲンI [GenBank：NM _ 053304。1]、およびNF-の増幅に使用されたプライマーの特定のセット（Sangon、Shanghai、China） κBp65[GenBank：NM _199267。2]遺伝子は、バッチプライマー3を使用して設計されました。フォワード（FW）およびリバース（RV）プライマーは次のとおりです。コラーゲンI（FW：GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG、RV： GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA）、NF-κBp65（FW：CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG、RV：TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA）、-アクチン（FW：TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG、RV：AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A）。 結果は、内部対照としてのハウスキーピング遺伝子-アクチンのmRNAに対して正規化され、相対的なmRNAレベルとして提示されます。

反応は、8μLのIQ SYBR GreenSupermix、1μLの10 pMプライマーペア、8.5μLの蒸留水、および2.5μLのcDNAを使用して行いました。 各ポリメラーゼ連鎖反応は、以下の条件下で実施された：95度で3分間、次に95度で10秒、55度で30秒、および55度で10秒の40サイクル-伸長のために-95度、続いて単一蛍光測定。 最終結果は、相対値（2-ΔΔCt）で記述されました。 計算と分析は、iQ5リアルタイムPCR検出システムによって実行されました。

ウエスタンブロット分析

コラーゲンI（Abcam、Cambridge、UK、Art No：ab3471 0）タンパク質発現レベルは、ハウスキーピングコントロールとして-アクチン（ロット：60008-1- lg; Proteintech、China）を使用したウエスタンブロッティングによって決定されました。 全細胞抽出物は、1％Haltprotease阻害剤カクテル（Thermo Scientific、USA）および1％Haltホスファターゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific、USA）を含むRadioimmunoprecipitation Assay（RIPA）（Thermo Scientific、USA）バッファーを使用して調製しました。 タンパク質濃度は、ブラッドフォード法[18]によって測定および定量化されました。 タンパク質（10〜50 ug）を10％SDS-PAGEゲルで分離し、PVDFメンブレン（Millipore、USA）に転写しました。メンブレンを5％BSAおよび一次抗体（Anti-Colla gen I）で室温で1時間ブロックしました。抗体、1：200希釈または-アクチンのマウスmAb、1：5000希釈）を4度で一晩インキュベートした。 対応するAlk-Phos。 コンジュゲートした二次抗体を室温でインキュベートした。 最後に、それらの膜を0.1％Tween 20を含む1×Tris–HClsalineで3回洗浄し、シグナルをスキャンしてGEL DOC XR Imaging System（Bio-Rad）で可視化しました。 デンシトメトリー分析は、目的のタンパク質で実行され、GEL DOCImage Studioソフトウェア（Bio-Rad）によって-アクチンに正規化されました。 -内部対照としてアクチンを使用した。

統計分析

シャピロ-ウィルク正規性検定とルビーンの分散均一性検定を適用して、分散の正規性と均一性を検証しました。 分散分析（ANOVA）とそれに続くテューキーの事後検定を使用して、不均一な正規分布データの統計的差異を特定しました。 Kruskal-Wallisノンパラメトリック検定を使用して、正規分布または均一ではないデータを分析しました。 結果は平均±SDとして表された。 有意性はP<0。05に設定されました。 すべてのデータは、spss="">

結果

におけるCPhGsCPhGの定量分析Cistancheカンカニクジュヨウ2つ含まれていますフェニルエタノイルド配糖体、エキナコシド、およびアクテオシド、およびCPhG中のそれらの含有量は、HPLC分析（図1）によって、それぞれ42.71±0.42パーセントおよび14.27±0。18パーセントであると決定されました。

肝臓と脾臓の指数

表1に示すように、モデルグループの肝臓と脾臓の指標は有意に上昇しました[P<><0.05]。 異なる用量群での陽性薬物bjrgおよびcphgの肝臓および脾臓指数は、モデル群[pliver="0。004、PLiver=0。003、PLiver=0。004、" pliver="0。005;" pspleen="0" .017、pspleen="0。027、PSpleen=0。024、PSpleen=" 0。070]。="">

ALT、AST活性、および肝線維症マーカーに対するCPhGの影響

本研究では、肝酵素ASTおよびALTの血清レベルは、BSA誘発肝硬変ラットの肝細胞損傷を反映して、モデル群で有意に増加しました。 ただし、実験では、BJRG（6 0 0 mg / kg）およびCPhG（125、25 0、および5 0 0 mg / kg）による治療が大幅に減少したことが示されました。 AST [PAST <0.001、past><0.001、past><0.001、past><0.001、それぞれ]およびalt [palt="0。117、PALT=0。139、PALT=0。189" 、palt="0。255、それぞれ]肝線維症ラットのレベル。">

モデルラットのHA、LN、PC、およびIV-Cのレベルは、有意に増加しました[PHA<0。00><0。{{39} }="" 0="" 1、ppciii=""><0.001]。 モデルグループと比較して、ha="" [pha="0。009、PHA=0。007、PHA=0。009、PHA=0。023、それぞれ]、LNのレベル[PLN=0。011、PLN=0。004、P" ln="0。026、P" ln="0。069、それぞれ]、PC" iii="" [p="" pciii="" {{26="" }}。006、p="" pciii="0。067、P" pciii="0。136、P" pciii="0。296]、およびIV-C" [p="" iv-c=""><><0.001、p iv-c=""><0.001、p iv-c=""><0.001]は、異なる用量群（125、250、および500 mg="" kg）でbjrg（600="" mg="" kg）およびcphgによって著しく減少しました。="">

HypコンテンツとTGF- 1

コラーゲン含有量は、肝臓組織のHyplevelsを測定することによっても検出されました。 表4に示すように、モデル群の平均Hypレベルは正常群よりも有意に高かったが、BJRG群と異なるCPhG投与群では著しく減少した。

ラットにおけるモデルグループのTGF{{0}}の肝濃度は、有意に増加しました[P<0。0 0="" 1]。モデルグループと比較して、陽性薬物のtgf-="" 1レベルおよび異なるcphg用量群は著しく減少した[ptgf-="" 1=""><0。001、p tgf="" -="" 1=""><0.001、p tgf="" {{10="" }}=""><0.001、ptgf -="" 1=""><0.001、それぞれ]。>

組織病理学的検査

H＆Eおよびマッソントリクロームで染色された正常な肝臓組織切片の観察は、明確な肝小葉および肝類洞を示しています。 モデルラットの肝臓組織構造は無秩序であり、肝臓組織と肝類洞は大量の結合組織に置き換えられた。 しかし、モデルグループよりも治療グループの方が、より正常な細胞構築と結合組織が検出されました。

H＆E染色

正常群では、異常な門脈領域および肝類洞を伴わない肝小葉の構造的完全性が観察された。 肝索は整然と配置され、芯は丸く透明でした。 核は細胞の中心に位置し、細胞質が豊富です。 門脈領域のみに少量の線維組織があります（図2a）。

モデル群では、小葉構造がひどく損傷していた。 肝細胞は、軽度の水様変性、主にバルーニング変性および/または脂肪変性を示した。 炎症性細胞浸潤の形成、広範な線維性組織過形成、多数の線維性中隔の形成、小葉の分裂、および有意な肝細胞増殖も観察された。これらの観察は、ラット免疫損傷動物モデルの確立の成功を確認した。肝線維症（図2b）。

モデルグループと比較して、異なるCPhGで炎症性細胞浸潤の減少が見られました。また、肝細胞の壊死と脂肪変性の減少、および線維症の緩和も観察されました。 CPhGは、ラットにおけるBSA誘発性肝線維症の病状を有意に軽減し、肝細胞の腫れを軽減し、肝細胞壊死および炎症性細胞浸潤を効果的に防止し、CPhGsexertがBSA誘発性ラット肝線維症に対する保護効果を示唆している。 （図2c–f）。

マッソンのトリクローム染色

正常群では、肝臓組織は正常でした。 肝門脈部は少数のブルーコラーゲン線維を示し、肝臓組織は正常に構造化されていた（図3a）。 正常群の肝組織と比較して、線維性組織は中央小葉によって増殖し、肝実質に拡大した。 コラーゲン線維は、小葉全体を伸ばして連結し、包み込み、中心静脈を取り囲んだ。 これらの効果は、肝細胞線維症、小葉構造損傷、門脈周囲線維症、および偽小葉形成（図3b）とともに、モデルが確立されたという証拠を提供しました。

モデル群と比較して、陽性薬物対照群のコラーゲン線維は、末梢門脈領域からわずかに外側に伸びていた（図3c）。 モデルグループと比較して、異なるCPhGs用量グループのコラーゲン線維は有意に減少し、線維増殖は阻害され、肝実質内の異常組織の増殖は有意に減少しました。 これらの結果は、CPhGがラットをBSA誘発性肝線維症から保護したことを示唆しました（図3d–f）。

免疫組織化学的染色

重要なことに、I型コラーゲンとIII型コラーゲンの発現は肝線維症の発症に重要な役割を果たしており、それらの生成と肝組織への沈着は、抗肝線維症の有効性の重要な決定要因として役立つ可能性があります。 結果を表5にまとめています。

コラーゲンタイプI

正常群は主に血管と門脈部にI型コラーゲンを発現していた。 モデルグループは、門脈領域でI型コラーゲン血管線維症を高発現しました。 Disseの空間では、I型コラーゲンの染色が筋状または斑状の分布として観察されました。 コラーゲンは線維性中隔を包み、偽小葉を形成した。 これらの実験では、BJRJ（600 mg / kg）およびCPhGの異なる用量グループ（125、250、および500 mg / kg）に対して形成された線維性中隔が少なくなりました[PCol I=0。002、PCol I {{6 }}。001、PCol I=0。023、およびPColI= 0。044]。 半定量的な結果は、それらのI型コラーゲンの発現がモデルグループと比較して有意に低いことを明らかにしました（図4）。

コラーゲンタイプIII

コラーゲンタイプIIIは正常群で弱く発現し、門脈と肝静脈を取り巻く周辺領域は、連続した線維の代わりに少量の細かい黄色を示しました（図5a）。 モデルグループでは、コラーゲン線維は幅が広く太い紐を示し、主に門脈および線維組織領域に位置する強い発現を示しています（図5b）。

BJRJのコラーゲン線維（600 mg / kg）およびCPhGの異なる用量群（125、250、および500 mg / kg）は糸状であり、中心静脈および門脈領域の周​​りに分布していた。 モデルグループと比較して、コラーゲン線維は有意に減少し、染色は薄く薄く、免疫組織化学的染色は弱陽性でした（図5c–f）。 これらの半定量的結果は、陽性および異なる用量群で陽性に発現された細胞[PCol III=0。015、PCol III=0。001、PColIII=0。010、およびPCol III=0。037、それぞれ]はモデルグループのものとは異なりました。

TGF - 1

正常なラット肝細胞ではTGIF- 1の発現はほとんどありませんでした。 発現は少数の間質細胞に限定されていました（図6a）。 モデルグループでは、TGF - 1の発現は、門脈領域、線維性空間、肝星細胞、炎症細胞、正弦波壁、および細胞質に広く分布していました。 特定のポータル領域は、茶色がかった黄色の染色で強い陽性の発現を示しました（図6b）

BJRJの門脈領域および線維性中隔（6 0 0 mg / kg）およびCPhGの異なる用量群（125、250、および500 mg / kg）で少量の発現がありました。 これらのグループの陽性染色の程度は、モデルグループのそれと比較して有意に減少した。 線維性中隔の間質細胞および炎症細胞の細胞質の染色は減少しました（図6c–f）。 半定量的結果は、BJRJおよびCPhGの異なる用量群[P TGF - 1=0。001、P TGF - 1 <0.001、p tgf="" -="" 1="0。009、PTGF-" 1="0を明らかにしました。">

記事の前半で述べたように、TGF - 1は肝硬変の病態生理学において重要なサイトカインであり、細胞外マトリックスの産生を刺激します[19]。 TGF - 1のレベルが、肝硬変の重症度と一致する方法でモデルグループで増加することを示しました。 肝臓におけるTGF- 1の発現レベルは、血清TGF- 1レベルと一致していました。 これは、CPhGがECMの合成と分解に関与することにより、TGF- 1の発現による肝硬変を大幅に軽減できることを示しています。

I型コラーゲン、III型コラーゲン、TGF - 1の発現により、肝線維症の病理学的過程を検出することができます。 治療群におけるそれらの発現レベルは有意に減少し、CPhGがコラゲナーゼ活性を改善し、肝臓のECM合成および分解の動的平衡を維持し、したがって肝臓線維症の形成を遅延および防止できることを示した。

HSC-T6細胞における薬物介入後のNF-κBp65およびコラーゲンIの発現

肝線維症のシグナルを特徴づけるために、肝臓の2つの重要な調節遺伝子がRT-PCRアッセイによって決定されました。 データは、対照群のtHSC-T6細胞がNFκBとI型コラーゲンmRNAのレベルが低いことを示しました。 逆に、TGF - 1は、HSC-T6細胞がNF-κB（P<0。01）およびcol-i（p><0.01）mrnaを著しくアップレギュレーションするように誘導しました。コントロールグループのもの。 異なる濃度のcphgの存在下で、nf-κbp65[pnf-κb="0。001（100" ug="" ml）、pnf-κb="0。002（75" ug="" ml）の結果、pnf-κb="0。007（50" ug="" mlの場合）、およびpnf-κb="0。012（25" ug="" mlの場合）]およびcol-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}。006、p="" col-i="0。009、P" col-i="0。014、P" col-i="">

HSC-T6細胞への薬物介入後のコラーゲンIレベルのウエスタンブロット分析

図8は、さまざまな実験グループのHSC-T6細胞におけるコラーゲンIタンパク質の発現レベルを示しています。コラーゲンIタンパク質の発現レベルは、CPhGのさまざまな用量グループ（100 ug / ml、75 ug / ml、50 ug / ml、 TGF- 1グループと比較して25ug/ ml）。

討論

CPhGsは、伝統的な中国の漢方薬として使用されているCistancheの根茎から分離および精製されたフェニルエタノイド配糖体です。 近年、CPhGshadは肝臓の損傷を防ぐ強力な能力を持っていることが示されています[20]。 したがって、我々は、CPhGがラットのBSA誘発性肝線維症による肝炎線維症に対して抑制効果を有するかどうかを調査することを目的とした。 BJRGは、中国で肝線維症の治療薬として一般的に使用されています。 亀の甲羅から作られています。 Radix PaeoniaRubra、Cordyceps Sinensis、Radix isatidisなどは、気と血液を補給し、倦怠感を和らげ、節を柔らかくする効果があります。 さらに、以前の研究は、それが初期の肝臓線維症をブロックし、脂肪貯蔵細胞の増殖を阻害し、そしてコラーゲン合成を減少させるという明らかな機能を持っていることを示しています[21]。 したがって、この研究ではBJRGを陽性薬として使用しました。

BSA注射によって誘発されたラットの肝線維症の病理学的変化は、ヒト門脈性肝硬変のそれと類似しています[22]。 CPhGは、用量依存的に肝線維症の程度を軽減し、筋線維芽細胞様細胞へのHSC形質転換を阻害し、血清ALT、AST、HA、LN、CIV、TGF - 1、および肝指数のレベルの上昇を抑制し、コラーゲンの発現を著しく抑制しました。肝臓組織のI、コラーゲンIII、およびTGF- 1。

肝線維症の病期は、HA、LN、およびIV-Cのこれらのレベルと相関しており、マーカーとして肝線維症の程度を検出する役割を果たしている可能性があります[23]。 HAは細胞外マトリックスの主要な資源であると報告されています。 基底膜の必須要素としてのIV-Cは豊富に合成され、肝硬変の初期段階で大量に沈着します。 LNおよびIV-Cの血清レベルは、基底膜の代謝回転率の指標であり、門脈領域および類洞毛細血管の線維化の程度を示します[24]。 PC IIIは、肝線維症および早期肝硬変の診断におけるマーカーですが、その感度と特異性は高くなく、多くの参考文献で線維症のさまざまな段階の間に有意差はありません[24、25]。 この研究でも同様の結果が得られました。

さらに、H＆Eおよびマッソンのトリクローム染色切片の観察では、明確な肝小葉および肝類洞を伴う正常な肝臓組織が示されています。 モデル群の肝組織構造は無秩序であり、肝組織と肝類洞は大量の結合組織に置き換わっていた。 しかしながら、モデル群と比較して、治療群では有意な改善が観察された。

重要なことに、I型コラーゲンとIII型コラーゲンの発現は肝線維症の発症に重要な役割を果たしており、その遮断により肝線維症を予防および治療することができます。 したがって、I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの肝臓組織における生成および沈着は、抗肝線維症の有効性の重要な決定因子として役立つ可能性があります。 TGF - 1は、肝障害における重要な線維形成促進性サイトカインでもあり、複数の薬理作用で生物学的に活性があります[26]。 組織の恒常性を維持するには、これらの作用のバランスが必要です。 TGF 1の異常な発現は、肝疾患の病因に関与しています[27、28]。TGF- 1は、肝硬変の初期段階に関与する重要なサイトカインであることが知られています。 酸化ストレスはTGF- 1を引き起こし、後者はECMの生成と沈着を刺激します[29]。 したがって、抗肝線維症薬を製造するための効果的な戦略の1つは、抗TGF- 1剤を特定することです。 免疫組織化学的分析は、I型コラーゲン、III型コラーゲン、およびTGF- 1の発現が肝線維症の病理学的過程を検出できることを示しました。 治療群におけるコラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII、およびTGF - 1の発現は減少し、特に高用量CPhG治療グループでは有意に低く、CPhGが有効なコラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIIIであることを示唆しました。 、およびTGF- 1阻害剤。 おそらく、CPhGscanはコラゲナーゼ活性を改善し、ECMの合成と分解の動的平衡を維持し、肝硬変の形成を遅らせて予防します。

CPhGは、ラットのBSA誘発性肝線維症を改善するだけでなく、invitroでのHSCの活性化の阻害にも関連している可能性があります。 HSCの活性化は、線維形成の重要なステップを表すと考えられています。 この研究では、結果は、25から100 ug / mlのCPhGの投与が、HSCにおけるNF-κBp65、コラーゲンI mRNA発現、およびコラーゲンIタンパク質発現の減少を著しく弱めることを示しました。

NF-κBは、感染または刺激に対する免疫応答を調節する上で重要な役割を果たします[30]。 肝細胞におけるNF-κBの蓄積は、炎症性サイトカイン/メディエーターの動員をもたらし、線維症の発症を誘発する可能性があります[31、32]。 さらに、コラーゲンは線維症のレベルを反映する敏感な指標でもあり、線維性肝臓の総タンパク質の約50パーセントを占めます[33]。 その結果、肝線維症に対する分子メカニズムは、CPhGを介したNF-κB発現の不活性化に関連していると仮定しました。この利点は、BSA損傷肝組織における免疫毒性と炎症ストレスの軽減という相乗的役割に寄与し、代謝異常をさらに矯正して肝臓機能を改善します。

結論

結論として、我々の研究は、CPhGがラットのBSAによって誘発される肝線維症の程度を有意に弱めることを示しています。 そのメカニズムは、少なくとも部分的には、ECMの組成およびECMの分解の刺激に対するCPhGの阻害効果、および/またはコラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIIIの合成、およびTGFの発現の直接阻害による可能性があります{{0 }}。 したがって、CPhGは、ヒト肝線維症の予防のためのヘルスケア製品または臨床薬に使用できると期待していました。 強力な抗肝線維症薬としてのCPhGの有効性を確立するには、将来の研究が必要です。

略語

CPhGs：シスタンシュからのアノール配糖体;

BSA：ウシ血清アルブミン;

HSC-T6：肝星細胞;

Hyp：ヒドロキシプロリン;

BJRG：CompoundBiejiarangan錠;

TGF - 1：トランスフォーミング成長因子1;

ALT：アラニンアミノトランスフェラーゼ;

AST：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;

HA：ヒアルロン酸;

LN：ラミニン; PC III：タイプIIIプロコラーゲン;

IV-C：タイプIVコラーゲン;

NF-κB：活性化B細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー。

RT-PCR：逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応;

SDS-PAGE：ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動。

競合する利益

著者は、競合する利害関係はないと宣言します

著者の貢献

TL、JZ、SPY、LM、MT、およびSLZが実験を考案および設計し、SPY、TL、およびJZがデータを分析しました。 SPYとJZが原稿を書きました。 TL、LM、JZが原稿をレビューしました。 すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。

了承

この研究は、中国国立自然科学財団（81260624）によってサポートされました。 著者は、この論文の執筆のために提案された改善についてタオ・リウ教授に心からの感謝を表明したいと思います。

著者の詳細

1中国、新疆ウイグル自治区、ウルムチ830011 Xinyi Road、Xinjiang MedicalUniversity、公衆衛生学部、毒物学科。 中国、ウルムチ830004、新疆ウイグル自治区マテリアメディカ研究所、維吾医学研究所の2KeyLaboratory。 3いいえ。 140 Xinhua South Road、Tianshan District、Urumqi 830000Xinjiang Uyghur Autonomous Region、China。

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