ラット脳虚血再灌流障害モデルにおけるサイスンチェのグリコシドの保護効果とメカニズム
Dec 19, 2024
抽象的な
客観的ラットの脳虚血再灌流障害（CIRI）に対するシスタンチ（GCS）のグリコシドの神経保護効果とメカニズムを調査する。方法48個のオスのウィスターラットを、偽、モデル、GC、およびニモジピン群にランダムに分割しました。焦点CIRIのラットモデルは、中大脳動脈閉塞によって確立されました。各グループのラットの感覚および運動能力は、ステッカーの除去、バランスビーム、およびオープンフィールドテストによって評価されました。脳梗塞の領域は2,3、5-トリヘニルテトラゾリウム塩化物染色で検出され、ニスル染色を使用して神経細胞の形態を観察し、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼDUTPニックエンド標識を使用して神経細胞のアポトーシスを検出しました。アポトーシス関連タンパク質Bcl -2関連X（BAX）、B細胞リンパ腫{-2（Bcl -2）、およびシステインアスパラギン酸プロテアーゼ-3}（caspase -3）の発現レベルは、西部-3）は、西部のBlothistochemicalによって検出されました。結果偽群と比較して、神経学的不足スコアは大幅に増加しました（P<0.05) and the times to remove stickers and passing the balance beam were significantly increased (P<0.05), motor ability was decreased, infarct size was increased, the number of neurons was decreased, and the number of apoptotic cells was increased after CIRI. Bax and caspase-3 expression were significantly increased (P<0.05) and Bcl-2/Bax was significantly decreased (P<0.05). Compared with the Model group, GCs improved the behavioral performance of CIRI model rats, reduced the infarct size, inhibited cell apoptosis, downregulated the expression of Bax and caspase-3 (P<0.05), and up-regulated the expression of Bcl-2/Bax (P<0.05). Conclusion GCs have a neuroprotective effect on CIRI, and may play a role in inhibiting cell apoptosis by regulating the expression of the apoptosis-related factors Bax, Bcl-2, and caspase-3. Keywords glycosides of cistanche; cerebral ischemia reperfusion injury; apoptosis; middle cerebral artery occlusion
脳虚血再灌流障害のための高品質のハーブサイスンチェ原材料
虚血性脳卒中すべてのストロークの約80％を占めており、人間の健康を脅かす主要な病気の1つです[1-3]。脳虚血再灌流障害（CIRI）は、静脈内血栓溶解や動脈血栓切除術などの再灌流療法後に発生する合併症です。虚血性脳卒中[4-5]。 CIRIは、重度の神経機能障害と不可逆的な神経死につながる可能性があります。したがって、神経保護に焦点を当てた効果的な治療計画を見つけることが重要です。
Cistanche Deserticolaは、主に内部モンゴルで生産される貴重な局所薬剤です。それは、気と血液を補充し、陰と腎臓の栄養を与え、腸機能を調節する効果をもたらします。シスタンチェ（GCS）のグリコシドは、抗酸化ストレスを与える可能性のあるCistanche Destericolaの主要な抽出成分です。虚血性脳卒中、細胞アポトーシスを阻害します虚血性脳卒中[6]。研究により、GCはフリーラジカルの蓄積を減らし、細胞アポトーシスを阻害することにより、ADの学習と認知機能を改善することが示されています[7]。 GCSは血管新生と神経リモデリングを促進し、血液脳関門の完全性を維持し、したがってCIRIを改善します[8]。ただし、GCSが細胞アポトーシスを調節して神経障害を軽減することでCIRIを改善できるかどうかはまだ不明です。したがって、この研究の目的は、GCがCIRIに神経保護効果があるかどうか、および細胞アポトーシスを調節することでCIRIを改善できるかどうかを調査し、CIRIの予防と治療における潜在的な応用値を明らかにし、CIRIのGCSの治療のための理論的および実験的基礎を提供することを目的としています。
1つの材料と方法
1.1実験動物
60のSPF男性6-月前のWistarラット（250-280 g）は、Beijing Sibeifu Biotechnology Co.、Ltd。[SCXK（Beijing）2024-0001]から購入しました。すべての実験動物は、モンゴル科学技術大学のバトウ医科大学の動物実験センターの標準化された動物室に保管されていました[SCXK（モンゴル）2018-0001]、20-24の温度で、20-24}の温度が50％-60}％の湿度、そして12時間ごとの明るい状態です。彼らは食物と水に自由にアクセスできました。この実験は、Baotou Medical Collegeの実験的な動物倫理基準に準拠しています[Baoyi Lunshen 2022 No.（60）]。 3Rの原則が摂食および実験プロセス中に続き、人道的なケアが与えられました。
1.2主要な試薬と楽器
Cistanche Deserticolaの総グリコシドは、Baoji Cosmai Plant Polysaccharide Development Co.、Ltd。（生産バッチ番号：KM20220609011）から購入し、総グリコシド含有量は85％以上です。 GCは蒸留水に完全に溶解し、50 mg/kgの用量に調製でき、投与量は動物の重量に従って計算されます。 TTC染色溶液（G3005）、NISSL染色キット（G1434）、高効率RIPA溶解溶液（R0010）、ECLプラス超敏感な発光溶液（PE0010）、30％ゲル調製溶液（A1010）、電気泳動緩衝液（T1070）、トランス転換溶液（D1060）、PAGE ASCELATORAT広範囲のタンパク質マーカー（PR1910）、タンパク質負荷バッファー（P1015）などはSolebaoから購入しました。免疫組織化学キット（PV {-9000）およびPBSバッファーパウダー（ZLI -9062）は、北京Zhongshan Jinqiaoから購入しました。 BCAプロテイン検出キット（23227）はThermo Scientificから購入しました。 bax（50599-2- ig）、bcl -226593-1- ap）抗体、ヤギ抗ウサギ二次抗体（sa 00001-2）はproteintechから購入しました。カスパーゼ-3（AF6311）は親和性から購入しました。 -actin（52901）はSABから購入しました。
スレッドプラグ（2636）は、Beijing Xinong Technology Co.、Ltd。から購入しました。スライサー（ライカ、ドイツ）;光学顕微鏡（ライカ、ドイツ）;オープンフィールド実験ボックス（上海Xinruan）;ピペット（エッペンドルフ、ドイツ）;顕微鏡イメージングシステム（ライカ、ドイツ）;電気泳動器具（Beijing Liuyi Biotechnology Co.、Ltd。）; Shaker（Beijing Liuyi Biotechnology Co.、Ltd。）;タンパク質ゲルイメージング
分析システム（タノンテクノロジー、上海）;マイクロプレートリーダー（米国サーモフィッシャー）。
1.3実験方法
1.3.1動物モデルの準備
ラット中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルは、修正されたZea-Longa縫合法によって確立されました[9]。計量した後、ラットを2％ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）の腹腔内注射により麻酔しました。動物が完全に麻酔された後、それらは仰pine位の操作テーブルに固定されました。首が剃られた後、ヨウ素で消毒されました。正中線の切開が左にわずかに作られ、筋膜と筋肉は、周囲の神経、血管、筋肉への損傷を避けるために、層によって率直に分離されていました。まず、左総頸動脈を見つけ、一般的な頸動脈とその迷走神経を分離し、4-0縫合糸を使用して左の一般頸動脈の近位端を結びつけ、次に左内頸動脈と左外頸動脈に沿って左内頸動脈に左内頸動脈に沿って左外の頸動脈に向かって左頸動脈を閉じ込めます。左の一般頸動脈で斜めに斜めに切開して糸プラグを挿入し、糸プラグが一般頸動脈を通過して内頸動脈に通過した後、動脈クランプをゆっくりと放出して糸プラグを通過させ、糸プラグが内頸動脈に沿って行き、次に中脳骨に到達し、surdりらを整えた後、糸プラグを実現します。ヨウ素との切開と消毒。
1.3.2実験動物グループ
この研究では合計59匹のラットが選択され、そのうち12個が偽操作グループとしてランダムに選択され、残りの47個がMCAOモデルの準備に使用されました。モデルの準備後、7匹のラットが死亡し、4匹のラットがモデルの準備に失敗しました。残りの36匹のラットは、モデルグループと薬物投与グループにランダムに分割されました。つまり、ラットは、次の4つのグループ（12ラット/群）、偽操作グループ、モデルグループ、サイスンチェデザイトコラ（GCS、50 mg/kg）グループの総糖剤およびニモジピン（NIM、20 mg/kg）グループにランダムに分割されました。偽群は、モデルグループと同じ外科手術を受けましたが、血管の結紮と糸プラグ挿入はありませんでした。モデルグループと各医薬品投与グループは、脳虚血再灌流モデルを確立し、継続的な胃内投与は14日間手術の24時間後に始まりました。 25 mg/kg、50 mg/kg、および100 mg/kgのGCの用量効果を調査するために、初期段階で予備実験が行われました。結果は、50 mg/kgの用量が最高であることを示したため、この実験では50 mg/kgが選択されました。
1.3.3神経機能スコア
この実験のすべてのラットは、International MCAOモデルスコアリング方法（Zea-Longa Scoring Method）を使用して採点されました[9]。 1〜3のスコアを持つラットを各グループから選択し、その後の実験のために選択し、0と4のスコアを持つモデルラットは除外されました。スコアリング基準は次のとおりです。
1.3.4ステッカー除去実験
1.2 cm×2。0 cmの長い接着テープストリップがラットの前足に取り付けられていました。触覚の後、ラットは歯でステッカーを引き裂きました。実験動物は、手術の3日前にステッカー除去トレーニングを受け、1日2回トレーニングを受けました。 30秒以内にステッカーを引き裂く可能性のあるネズミを選択して、各グループに入るために選択されました。ラットがステッカーを引き裂く時間は手術前にテストされ、3つの結果の平均はベースライン値としてとられました。ラットがステッカーを破壊する時間は、MCAO手術の14日後の各グループで記録されました。 120秒以内にステッカーを噛まなかった、またはステッカーを解体できなかったラットのスコアは、120秒として記録されました。
1.3.5バランスビーム実験
バランスビームは、長さ150 cm、幅4 cm、高さ3 cmにしました。バランスビームの高さは地面から80 cmで、両端の木製のフレームで支えられていました。バランスビームの一方の端は出発点として定義され、もう一方の端はエンドポイントとして定義されました。ラットケージはエンドポイントの後ろに置かれました。長さ1 m、幅1 m、厚さ12 cmのマットをバランスビームの下に置いて、ラットが落ちないようにしました。実験の開始時に、ネズミはケージの方向に向いて出発点に置かれ、ラットがバランスビーム全体を横切って歩くのにかかった時間が記録されました。各グループのラットは、手術の3日前に1日3回トレーニングを受けました。ラットがバランスビームを横切って歩くのにかかった時間は手術前に記録され、各グループのラットがバランスビームを横切って歩くのにかかった時間は、MCAO手術後1日、2日、3日、7日、14日後に記録されました。水平バーを歩くのに許容される最大時間は120秒でした。
1.3.6オープンフィールド実験
実験動物の各グループをオープンフィールドの実験ボックスに入れ、行動分析ソフトウェアを使用して、5分以内にラットの活動軌跡と移動距離を記録します。環境は実験中に静かにする必要があり、実験機器は、2つの実験の間にきれいな水とアルコールで拭き取り、以前の実験動物の残留情報が次の実験の結果に影響を与えるのを防ぎます。
1.3.7 TTC染色
実験後、ラットを腹腔内注射により計量し、麻酔しました。その後、ネズミが殺され、脳が取り出されました。脳組織を生理食塩水ですすいで、スライスのために-20程度30分間置きました。脳は冠状位置の5つのスライスに分割されました。切断された脳スライスを予熱したTTC染色溶液に入れ、37度の水浴で30分間染色しました。染色後、それらは4％パラホルムアルデヒドで固定されました。固定された脳組織のスライスを整頓し、写真撮影しました。頭蓋骨と動脈環血症の根元に血栓がある動物は排除されました。画像プロプラス（IPP）画像分析ソフトウェアを使用して、脳梗塞の領域を計算しました。梗塞面積比/％=各セクションの梗塞領域の合計/各セクションの領域の合計×100％[10]。
1.3.8 nissl染色
脳組織を4％パラホルムアルデヒドで固定した後、勾配アルコールで脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンバスでワックスに完全に浸し、脳組織をパラフィンに埋め込みました。パラフィン切片の厚さは5 µmでした。パラフィン切片をシレン、勾配アルコールに連続的に配置し、蒸留水で5分間洗浄しました。切片を事前に調製したNISSL染色溶液に配置し、60度40分間染色しました。切片を95％アルコールで区別し、分化は顕微鏡下で観察されました。背景が明るい青であり、nissl体がはっきりと色付けされたときに、分化が停止されました。切片を無水エタノールで脱水し、キシレンで透明にし、中性ガムで密閉した。切片を乾燥させた後、神経細胞の形態を顕微鏡下で観察し、画像を収集して画像取得システムで写真を撮ることで分析しました。
1.3.9免疫組織化学染色
定期的な脳組織の脱水、埋め込み、切片化、水への脱線、高圧マイクロ波抗原熱修復、PBS洗浄、PBS洗浄、各5分、内因性ペルオキシダーゼブロッカーが追加され、室温で10分間インキュベートされ、PBS洗浄、3回、5分。一次抗体インキュベーション、4度の一晩、室温で30分間再炭水化し、PBS洗浄3回、各時間5分、反応増強溶液を追加し、37度で25分間インキュベートし、PBSを3回、5分間洗浄し、酵素標識ヤギ抗ラビットIGGポリマーを37分間洗浄します。水道水洗浄、ヘマトキシリン対比染色、上昇勾配エタノール脱水、キシレン透明、およびシール。
1.3.10 TUNEL染色
パラフィン切片を水に脱水し、切片を乾燥させ、プロテイナーゼK作動溶液を追加し、37度で25分間洗浄し、3回3回、毎回5分間洗浄し、室温で室温で20分間インキュベートし、PBS 3回、5分間洗浄します。 37度で1時間インキュベートし、PBSで3回、毎回5分間洗浄し、DAPI染色溶液を加え、暗闇で10分間室温でインキュベートし、PBS 3回、5分間洗浄し、抗蛍光クエンチャーで切片を密封し、蛍光顕微鏡下で画像を観察して収集します。
1.3.11ウエスタンブロット
脳組織をタンパク質溶解緩衝液に加えた後、脳組織は研削棒で完全に粉砕され、タンパク質は氷浴で数回超音波的に壊れていました。上清を低温超遠心で15分間遠心分離しました。上清を抽出し、BCAキットを使用して濃度を決定しました。タンパク質荷重緩衝液を加え、5分間変性のために100度の金属浴に入れました。濃縮ゲルと分離ゲルを調製し、電気泳動のために各ウェルに20 ugのサンプルを加えました。電気泳動後、膜を一定流量で2.5時間移し、5％のスキムミルク粉末を室温で2時間ブロックしました。一次抗体を一晩4度振り返り、二次抗体を室温で2時間インキュベートしました。バンドは、イメージング分析システムを使用してスキャンおよび分析されました。
1.4統計的方法
すべての実験結果は、平均±標準偏差（xs）として表され、統計分析はGraphPad Prism 9.5ソフトウェアを使用して実行されました。一元配置アノナを使用して各グループのデータを比較し、グループ内のペアワイズ比較にはt検定またはノンパラメトリックテストを使用しました。 p <0。05は、統計的に有意な違いを示しています。
