Hsa-microRNA-4535-媒介TGF /SmadシグナルⅡを介したH2O2/UVB誘発性真皮線維芽細胞コラーゲン分解に対するカンクの保護効果

議論

この研究では、シスタンシュの保護的な役割は、Smad4 を標的とする hsa-miR- 4535 の減弱によって媒介され、Smad2/3/4 シグナル伝達と、紫外線にさらされた皮膚のコラーゲン合成を調節します。 H2O2/UVBによる皮膚損傷 試験管内でと生体内。 私たちの発見は 6 つの主要な点に要約できます: (1) シスタンシェ減衰 H2O2- 30 μM 用量では HS68 細胞の老化は誘導されましたが、アポトーシスは誘導されませんでした。 (2)H2O2/UVB誘発性細胞内とミトコンドリアl ROS 形成と MMP の不均衡は次のように逆転しました。カンクン治療; (3) cistanche は、H における TGF /Smad シグナル伝達および Samd2/3/4 複合体の活性化を有意に増強しました。2O2- 曝露された細胞; (4) Hによるhsa-miR-4535の上方制御2O2/UVB は次のように抑制されましたカンクン治療; (5) hsa-miR- 4535 は、TGF /Smad シグナル伝達の調節に関与しています。Hにおけるコラーゲン合成障害に対するSmad4の標的化2O2/UVBに曝露された細胞。 (6)カンクサの局所塗布で裸体の背部皮膚マウスはUVB誘発性を大幅に減少させた皮膚の光老化,しわの形成, 皮膚過形成, そして障害TGF /Smad シグナル伝達経路の説明。

図 10. UVB 誘発 C57BL6/J ヌードマウス皮膚光損傷に対するカンザシの効果。 (A) 動物実験の概略手順。 生後4週間のC57BL6/Jヌードマウス（n=6）の背部皮膚をUVB放射線に曝露し、2日に1回シスタンシュで8週間処理した（B）ヌードマウスの背部皮膚のしわ形成を示す写真マウスを UVB 曝露し、続いてカンクサを局所塗布した。

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図 11. 局所カンザス塗布により UVB 誘発性が軽減される皮膚過形成C57BL6/J ヌードマウスの背部皮膚におけるコラーゲン分解。 皮膚組織を連続切片にし、H&E、マッソントリクロームで染色し、p-Smad2/3 Smad4 および -gal について免疫組織化学的に染色しました。 H&E 染色では表皮の厚さが示されました。 赤い双頭矢印は表皮の肥厚を示します。 マッソントリクローム染色により、真皮層のコラーゲン線維含有量が示されました。 コラーゲン線維は青色に見えます。 LD、低用量。 HD、高線量。

カンクン報告によれば、ケラチノサイトや心筋細胞などのさまざまな細胞において抗アポトーシス特性および抗酸化特性を示した[13、39、40]。 シスタンケの経口投与は、ミトコンドリアの酸化損傷を軽減し、Nrf2 抗酸化シグナル伝達を増強することにより、糖尿病ラットのストレプトゾトシン誘発性肝損傷を効果的に抑制した[13、41]。 他の研究では、カンクサが酸化ストレスと炎症を軽減することにより、シクロホスファミド誘発性肝毒性とシスプラチン誘発性腎毒性を改善することが示されている[42、43]。 真皮線維芽細胞が UVB または H2O2 に曝露されると、ミトコンドリア内に ROS が蓄積し、ミトコンドリアの断片化と細胞の老化につながります [44]。 以前の研究では、断片化したミトコンドリアがコラーゲンの生成を損なうことが示されました[45]。 私たちの研究は、カンクサが、ROS 誘発ミトコンドリア膜電位の不均衡と、UVB および H2O2- 誘発細胞における ROS 蓄積を防ぐラジカル消去能力を持っていることを示しました。 (図 3A ～ 3C)。 最近の研究では、真皮線維芽細胞が ECM が豊富な環境の組織化に関与していることが報告されています。

図 12. UVB 照射マウスにおける TGF /Smad シグナル伝達および hsa-miR-4535 発現に対するシスタンシュの効果。 (A および B) UVB に曝露されたマウスの背部皮膚からの hsa-miR-4535 および Smad4 の mRNA レベルを qRT-PCR によって検出しました。 (C) 背部皮膚組織における TGF 、p-smad2/3、および Smad4 のタンパク質レベルをウェスタンブロッティングによって検出しました。 -チューブリンをローディングコントロールとして使用しました。 データは平均値 ± SD として表示されます。 結果の定量化が示されます。 *P < 0.05、**P < 0.01 対車両対照群。 #P < 0.05、##P < 0.01 対 UVB プラス媒体グループ。

主に I 型と III 型のコラーゲンから構成されます [46]。 I 型および III 型コラーゲンの恒常性は、本質的に皮膚の構造的および機械的支持の維持に関与しています [47]。 新たな証拠は、加齢中に豊富なROSが生成され、その結果、真皮層のコラーゲン束の進行性の損失をもたらし、その結果、TGF /Smad経路の障害とMMP発現の上昇によるしわの形成に寄与することを示唆している[48、49]。カンザス媒介性TGF /Smad シグナル伝達の活性化により、皮膚の完全性を維持するコラーゲンが生成されます。 ただし、がん細胞に対しては異なる影響を及ぼします。 肝臓がんでは、カンザス処理TGF /Smad シグナル伝達を活性化することで HepG2 細胞の増殖を阻害しました [50]。 対照的に、cistanche は TGF /Smad シグナル伝達を阻害するだけでなく、Smad3 を不活性化し、前立腺がん細胞および膵臓がん細胞の増殖阻害を引き起こしました [51]。 しかし、TGF /Smadシグナル伝達におけるcistancheの役割は、皮膚の真皮線維芽細胞不明のままだった。 ここで、我々は、シスタンシュがCOL1A1およびCOL3A1の発現を上方制御し、H2O2/UVB処理細胞ではTGF /Smadシグナル伝達の活性化を通じて下方制御されることを観察した（図4A-4C、8E、9A）。 さらに、H2O2/UVB による MMP-1 の誘導は、シスタンケ処理後に逆転しました (図 4A、9A)。 我々の発見は、カンクサがTGF /Smadシグナル伝達を活性化し、コラーゲン産生を誘導することにより、H2O2/UVB誘発性損傷から皮膚線維芽細胞を保護することを示しています。

皮膚真皮のコラーゲン生成は複雑な生理学的プロセスであり、マイクロRNAを介した制御はECMのリモデリングと組織化に寄与することが示されている[23、52、53]。 コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸（HA）は、皮膚の完全性を維持する 3 つの主要なタンパク質です。 蓄積された証拠は、いくつかのマイクロRNAがECM制御を通じて皮膚の老化に関与していることを示唆しています。 miR-181a は老化ヒト皮膚線維芽細胞で上方制御され、XVI コラーゲンが ECM 成分を調節できるようになりました [54]。 興味深いことに、miR-23a-3p の高発現は、HA を合成する膜貫通型 HA シンターゼアイソザイムの 1 つであるヒアルロン酸シンターゼ 2 を直接抑制することにより、真皮老化を誘導する可能性があります [21]。 最近、さまざまな天然化合物がマイクロRNA制御を介して皮膚の老化を軽減することが報告されています[55-57]。 さらに、カンクサは胆管癌および肝細胞癌におけるマイクロRNA制御に関与し、細胞増殖および転移の抑制を引き起こしたと報告されている[58、59]。 これまでのところ、マイクロRNA制御などの分子メカニズムを特定した研究はありません。カンクサ処理済み人間の皮膚の真皮線維芽細胞。 ここでは、microRNA アレイのプロファイルを分析して、コントロールと 30 µM の間で異なるいくつかの microRNA を特定しました。カンクサ処理済みグループ (図 5A)。 miRDB と TargetScanHuman データベースを使用して、Smad4 を hsa-miR-4535 として予測しましたmRNA ターゲット (図 5B)。 hsa-miR-4535 発現は、H2O2/UVB 誘導細胞におけるシスタンケ処理後に下方制御されました (図 6C、9B)。 対照的に、その標的である mRNA-Smad4 の発現は、H2O2/UVB に曝露された細胞では有意に阻害され、シスタンケ処理後に増加しました (図 6D、9C)。 さまざまな研究により、ROS が p53、NF-κB、HIF などのストレス誘導性転写因子を刺激する中間体として機能することが示されています [60]。 したがって、我々は、特定の miRNA がこれらの転写因子の制御を通じて調節される可能性があると推測しました。 転写因子結合部位データベース (PROMO) を使用することにより、hsa-miR-4535 プロモーターに 1 つの推定上の p53 結合要素が存在することを特定しました。 私たちの今後の研究は、hsa-miR-4535 プロモーターにおける p53 の転写制御に焦点を当てる予定です。 さらに、H2O2-誘発コラーゲン分解は、hsa miR-4535過剰発現細胞またはsi-Smad4トランスフェクト細胞では、cistanche処理後でも減衰できませんでした（図8C、8E）。 これらの発見は、Smad4を標的とすることによるコラーゲン合成の調節におけるhsa-miR- 4535の関与をさらに裏付ける。

図 13. シスタンシェ作用のメカニズムの模式図。 cistanche は、H2O2-誘発 has-microRNA-4535 を減少させることで TGF /Smad コラーゲン合成経路を強化し、ヒト皮膚真皮線維芽細胞の光老化を改善します。 略語: ECM: 細胞外マトリックス。 TGF : トランスフォーミング グロース ファクター ベータ。 T RI: TGF 受容体 I 型。 T RII: TGF 受容体 II 型。

結論として、我々の発見は、シスタンシュがH2O2/UVB誘発性ROS生成、MMP不均衡、細胞老化、およびヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン分解から保護することを示した。 カンクサの皮膚保護効果は、hsa-miR-4535 の阻害とコラーゲン合成を促進する Smad2/3/4 複合体の活性化に関連していました。 Smad2/3/4複合体の活性化は、Smad4-3'-UTRへの結合を介してhsa-miR-4535によって制御されていた。 したがって、H2O2/UVB誘発性皮膚損傷に対するキスタンシュの保護機構には、hsa-miRによるSmad4/コラーゲン合成の阻害が関与している可能性がある- 4535

材料および方法

細胞培養と処理

HS68 ヒト皮膚線維芽細胞は、バイオリソース コレクションおよび研究センター (BCRC、台湾、新竹) から入手し、10% ウシ胎児血清 (Invitrogen、カリフォルニア州、米国) を含むダルベッコ改変必須培地 (DMEM、サーモフィッシャー サイエンティフィック、米国マサチューセッツ州) で維持しました。 )、2 mM L-グルタミン (Sigma-Aldrich、ミズーリ州、米国)、100 U/mL ペニシリン (Sigma-Aldrich)、および 100 ug/mL ストレプトマイシン (Sigma Aldrich)、37 度、5% CO2。 H2O2- 誘発細胞損傷に対するシスタンシュの効果を評価するために、HS68 細胞を 200 μM の H2O2 で 1 時間処理し、次にシスタンシュ (282200、Sigma-Aldrich) で 23 時間共処理しました。 細胞をＰＢＳで洗浄し、ＵＶＢ曝露前に１ｍＬの新鮮なＰＢＳ中に置いた。 UVB 照射では、細胞をクロスリンカー (CX-2000、米国カリフォルニア州アップランド) および UVB 電球に 40 mJ/cm2 の強度で曝露し、その後シスタンシュで処理しました。

MTT アッセイ

処理後のHS68細胞生存率は、MTTアッセイを使用して測定されました。 HS68 細胞を 96- ウェルプレートに播種し、200 μM H2O2 で 1 時間処理するか、40 mJ/cm2 UVB で照射してから、さまざまな濃度のシスタンケ (10, 20、30μM）23時間。 24時間後、培地を100μLのMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)と交換した。溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ；ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ原液を培地で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した）を３７℃で４時間培養した。 次に、紫色のホルマザンを 100 μL のジメチルスルホキシド (DMSO) に可溶化し、分光光度計 (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用して 570 nm での光学密度を測定しました。

トランジェントトランスフェクション

マイクロアレイ解析

ルシフェラーゼレポーターアッセイ

細胞に、それぞれ野生型および変異ルシフェラーゼ Smad4-3'-UTR-WT または Smad4-3'-UTR-MT レポーター構築物、および内部対照ルシフェラーゼ プラスミドを同時トランスフェクトしました。 トランスフェクション後、製造元の指示に従って、Dual-Glo ルシフェラーゼ アッセイ システム (Promega、米国カリフォルニア州サニーベール) によってルシフェラーゼ活性を検出しました。 プレートは、Reporter Microplate Luminometer (Turner Biosystems、Sunnyvale、CA、USA) で読み取られました。 相対ルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼの活性に対して正規化されました。

ウェスタンブロット分析

細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して洗浄し、溶解緩衝液(50 mM Tris塩基(pH7.5)、{{10}}.5 M NaCl、 1 mM EDTA (pH 8.0)、1 mM -メルカプトエタノール、1 パーセント NP-40、1 パーセント グリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (Roche Molecular Biochemicals, Upper Bavaria, Germany) を氷上で 30 分間洗浄し、次に 30 分間遠心分離しました。 12,000 × g、4 度で 10 分間、上清を 1.5 mL 微量遠心管に収集し、これらの上清中のタンパク質濃度を Bradford 法 (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) によって測定しました。等量のタンパク質 (20 μg) を含むサンプルを 6% ～ 12% の勾配ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分離し、ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Millipore、米国マサチューセッツ州ベッドフォード) に転写しました。ブロッキング緩衝液 (5% 脱脂粉乳、20 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl、および 0.1% Tween 20) を使用してメンブレンを室温で 1 時間ブロッキングしました。その後、メンブレンを一次抗体 (1: 1、000 希釈）対 TGF 1（sc-31609、サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）、p-smad2/3（sc- 11769、サンタクルーズ）、Smad4（sc{{ 50}}、サンタクルーズ)、COL1A1 (sc-28657、サンタクルーズ)、COL3A1 (sc-271249、サンタクルーズ)、p16 (10883-1-AP、プロテインテック)、p21 (sc{ {60}}、サンタクルーズ）、MMP-1（sc-1731、サンタクルーズ）、GAPDH（sc-32233、サンタクルーズ）、ヒストン H1（sc-10806 、サンタクルーズ）4度で一晩。 次に、それらを適切な二次抗体 (1:80、000 希釈)、抗ウサギ (A0545)、抗マウス (A9044)、または抗ヤギ (A5420) IgG (Santa Cruz Biotechnology) とともに RT で 1 時間インキュベートしました。 イムノブロットは、ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences、リトルチャルフォント、英国) を使用して、増強化学発光 (ECL) 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 基質 (Millipore) で検出されました。

核タンパク質の抽出

RNA抽出とqRT-PCR

メーカーのプロトコールに従って、Direct-zol™ RNA MiniPrep 市販キット (Zymo Research Corporation、カリフォルニア州、米国) を使用して、全 RNA を抽出しました [65、66]。 miRNA は、以前に記載されているように [16、67]、miRNA cDNA 合成キット (Takara、Shiga、Japan) を使用して cDNA に逆転写されました。 hsa-miR-4535 および Smad4 の発現は、標準の LightCycle 480 SYBR Green I Master プロトコルを使用する LightCycle 96 Systems (Roche、スイス、バーゼル) でのリアルタイム PCR によって検出されました。 10 μL PCR 反応には、2 μL cDNA、5 μL 2× SyberGreen PCR Mix、0.5 μL フォワードプライマー (10 μM)、0.5 μL リバースプライマー (10 μM)、および 2 μL ddH2O が含まれていました。 すべての反応は 3 回繰り返して実行されました。 mRNA 検出では、各遺伝子の閾値サイクル (Ct) を決定し、GAPDH の発現と比較した各遺伝子の発現を 2ΔCt として計算しました。ここで、ΔCt =(Cttarget 遺伝子 – CtGAPDH) です。 miRNA 検出では、各遺伝子の Ct を決定し、U6 rRNA の発現と比較した各遺伝子の発現を 2ΔCt として計算しました。ここで、ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNA) です。 miRNA および mRNA 発現の検出に使用したフォワード (F) およびリバース (R) プライマーは次のとおりです。 hsa-miR-4535 (3'-CAGGG TCGGUCCA5'); ヒト-Smad4 (F'-TGACCCAAA CATCACCTTCA、R'-ATACGTGGACCCTTCTG GA); ヒト-GAPDH (F'-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG、R'-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); マウス-Smad4 (''-GTGGAAGCCACAGGAATGTT、R'-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); マウス-GAPDH (F'-CCTT CCACAATGCCAAAGTT、R'-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT)。

免疫蛍光分析