テストステロン合成および精子形成アポトーシスのシクロスポリン誘発性障害に対する新しい疫病神煎剤の保護効果
Mar 03, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN、XIYAN WANG、XUENAN WANG、WANSHENG ZHANG4、ZHANXUAN SUN1、XUAN XUAN LIANG、XUE ZHANG、WENJUN LI、ZHIXIN LI
概要
本研究は、新しい疫病神煎じ薬（新しいWSSJD; Cornu Cervi Nissan Parvum、Panax ginseng、Cynomorium solarium、ニクジュヨウ、Radix Astragali、Epimedium brevicornum、およびAngelica Sinensis）は、マウスのテストステロン合成および精子形成アポトーシスのシクロスポリン誘発性障害について説明しています。 合計90匹の成体雄Kunmingマウスを次の6つのグループに分けました：対照（介入なし）、ジメチルスルホキシド（DMSO; DMSOのみを投与）、シクロスポリンA（CSA）、クエン酸クロミフェン（CC; CsA + CC、15 mg / kg /日）、WSSJD（CsA + WSSJD、生薬12 g / kg / day）および新しいWSSJD（CsA +新しいWSSJD、生薬12 g / kg / day）。 すべてのマウスを強制経口投与により30日間治療した。 その後、精巣を固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、精細管上皮の発達を評価した。 免疫組織化学的手法を使用して、精巣ライディッヒ細胞における黄体形成ホルモン受容体（LHR）およびP450側鎖切断（P450scc）の発現を検出しました。 さらに、精巣の精子形成細胞のアポトーシスは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを介したdUTPニックエンドラベリングアッセイを使用して検出され、フローサイトメトリーを使用して、精巣上体の精子の生存率と初期アポトーシスを分析しました。 CsAおよびCCグループと比較して、新しいWSSJD投与は、精巣ライディッヒ細胞における血清テストステロンのレベルとLHRおよびP450sccの発現を有意に増加させました（P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
序章
シクロスポリンA（CSA）は、T細胞を特異的に標的とし、インターロイキン-2の分泌を阻害し、肝臓、腎臓、角膜の移植の成功率と、受信者（1-3）。 ただし、CsAの長期使用によって誘発される免疫抑制は、心血管疾患、感染症、および悪性腫瘍のリスクを大幅に増加させます（4）。 Eid et al（5）は、精子の濃度と運動性が男性の腎臓移植レシピエントの血清CsAの濃度と負の相関関係にあることを報告し、CsAが男性のレシピエントの生殖器系の機能障害を誘発する可能性があることを示唆している。 さらに、CsAが精子形成障害と男性生殖器系への損傷の原因である可能性があることが報告されています（6）。
以前の研究は、CsAが精巣のテストステロン生合成と分泌に影響を与えることによって血清テストステロンのレベルを低下させたことを示しました。 He et al（7）は、40 mg / kg / dayのCsAで治療されたラットが、血清中の黄体形成ホルモン（LH）のレベルが著しく高く、テストステロンのレベルが著しく低く、精巣の発達障害を引き起こすことを観察しました。 Ali et al（8）は、CsAによる治療により、ライディッヒ細胞の膜上のLH受容体（LHR）の発現が減少し、その後、LHを介したテストステロンの合成とライディッヒ細胞からの分泌が減少したことを報告しました。 Seethalakshmi et al（9）による別の研究では、CsAはテストステロン生合成中に17α-ヒドロキシラーゼの活性と17 -ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ活性を競合的に阻害することによりテストステロンレベルを低下させ、CsA阻害の主要部位はサイクリックアデノシンを中断したと報告しました一リン酸刺激。 さらに、この報告は、ライディッヒ細胞でCsAによって誘発されるテストステロン分泌の減少が、男性の生殖器系の発達と生殖能力の維持に直接影響することを示しました。 Seethalakshmi et al（10）は、内因性テストステロンレベルを上げるために、CsA処理ラットに外因性テストステロンを注射しました。 外因性テストステロンの高用量は、生殖器官の重量、卵胞刺激ホルモン（FSH）の血清レベルを有意に回復させ、生殖細胞数を増加させることが観察されました。テストステロンの投与（10）。 しかし、テストステロンの分泌と精子形成は依然としてCsAの影響を受けており、精子と精子形成細胞で高率のアポトーシスが観察されたため、外因性テストステロンは損傷した精巣組織の修復には不十分であることがわかりました（10）。
疫病神煎じ薬（WSSJD）は、主にコーヌセルビニッポンパルバム、オタネニンジン、オシャグジタケ、ニクジュヨウ、Radix Astragali、Epimedium brevicorneum、およびAngelica Sinensis（11）。 WSSJDは、シクロホスファミドによって誘発される精子形成アポトーシスを軽減することが実証されています（11）。 WSSJDの治療効果をさらに改善するために、本研究では、WSSJD成分の投与量を調整することにより、CsA誘発精巣組織損傷のメカニズムに基づく新しいWSSJDを開発しました。 現代の薬理学的研究は、WSSJDの枝角ベルベットが性ホルモンとして機能する可能性があることを示しています（12）。 Radix Astragaliは、精巣セルトリ細胞の増殖と栄養供給を改善する可能性があり（13）、Panax ginsengは、精巣の高酸化レベルを低下させ、精子形成アポトーシスを阻害する可能性があります（14）。 上記の薬はまた、腎臓機能を高め、精子形成細胞の発達を促進する可能性があります（12-14）。 クエン酸クロミフェン（CC）は、以前の臨床研究で男性不妊症に治療効果を発揮することが実証されています（15,16）。 さらに、CCはテストステロンと精液のパラメーターの改善に関連しており、CCの保護メカニズムはWSSJDのものと類似している可能性があります（15,16）。 さらに、Wang et al（17）による研究では、CCを治療対照として使用して、マウスの精子形成障害に対する漢方薬Shengjingの効果を調査しました。 これに基づいて、CCは本研究のポジティブコントロールとして使用されました。
本研究では、精巣組織における新しいWSSJDの保護効果の根底にあるメカニズムを調査して、改良薬の治療効果を決定しました。 保護メカニズムを解明することは、CsAによって誘発された精子形成損傷を改善するための新しいWSSJDの使用の基礎を提供するかもしれません。
ニクジュヨウの影響：予防精子形成障害
材料および方法
動物。 合計90匹の雄の昆明マウス（8-週齢; 35-40 g）は、長春生物製品研究所（中国、長春）から提供されました。 本研究は、吉林医薬学院（中国、長春）の倫理委員会の承認を得て実施されました。 マウスは、21±3℃、相対湿度55〜65％で、12時間の暗光サイクルで飼育されました。 マウスには、標準的な実験用マウスの食餌と滅菌水を自由に摂取させることができました。
WSSJDの準備。 Cornu Cervi Nissan Parvum、Panax ginseng、Cynomorium solariumを含むWSSJDの15の漢方薬コンポーネント、ニクジュヨウ、Radix Astragali、Epimedium brevicornum、およびAngelica Sinensis（11）は、Tongrentang（北京、中国）から購入しました。 これらの材料は、中国の薬用煎じ薬の伝統的な方法に従って煎じられました（18）。 手短に言えば、レシピに従って成分を秤量し、合計250mlの蒸留水を加えてハーブを沈めた。 ハーブを30分間浸し、続いて加熱しました。 ハーブは最初に10分間茹でられ、次に熱は20分間煮るまで弱められました。 30分間加熱した後、液体煎じ薬をハーブから分離し、ハーブをさらに200mlの蒸留水で80℃でさらに30分間煎じました。 このプロセスを繰り返し、煎じ液の最終量をガーゼの4-5層でろ過しました。 液体はまたハーブからろ過された煎じ薬に絞られました。 続いて煎じ薬を水浴中で80℃で6〜7時間加熱し、濃度が2g生薬/mlに達するまで煎じ薬を使用するまで4℃で保存しました。 新しいWSSJDは、オタネニンジン、オシャグジタケ、キバナオウギ、およびイカリソウの投与量をわずかに調整したWSSJDの配合に基づいて調製されました。 煎じる方法はWSSJDと同じでした。 次のもので構成される新しいWSSJD：Panax ginseng、6 g; シノモリウムソラリウム、9 g; Radix Astragali、12 g; Epimedium brevicornum、6 g; Cornu Cervi日本パルバム、1 g;ニクジュヨウ、9 g; アンジェリカシネンシス、6 g; Flatstem Milkvetch Seed、9 g; 根茎ヤマノイモ科、15 g; 大きな頭のAtractylodesRhizome、6 g; Ligusticum wallichii、3 g; Radix Paeoniae Alba、6 g; シナニッケイ、1 g; Costustoot、1.5 g、およびFructus Foeniculi、3g。
生薬抽出物の濃度は、以下のように決定された：粗物質の重量/最終容量。 この計算方法は、漢方薬（19-21）の研究で広く使用されています。薬物投与。 マウスをランダムに6つのグループに分け（1グループあたり15匹のマウス）、胃内に薬を投与しました。 グループは次のとおりです。コントロール（通常の生理食塩水）。 ジメチルスルホキシド（DMSO）; CsA; CC; WSSJD; と新しいWSSJD。 CsA、CC、WSSJD、および新しいWSSJDグループのマウスに、前述のように（8 ）。 対照群とDMSO群のマウスは、30-日間の実験期間中、それぞれ等量の生理食塩水またはDMSO溶媒を毎日腹腔内注射しました。 通常の生理食塩水で希釈したDMSOの濃度は3.25パーセント（v / v）でした。 CCグループには、前述のように21.6 mg / kg / day CC（GKH Pharmaceutical、Ltd.、広州、中国）を投与し（13）、これも3.25パーセント（v / v）DMSO（pH {{14}）で希釈しました。 } .2）。 WSSJDおよび新しいWSSJDグループのマウスには、それぞれ12gの生薬/kg/日のWSSJDおよび新しいWSSJDを投与しました。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色。 マウスの精巣を採取し、すぐに4％パラホルムアルデヒド（pH =7 .2）で室温で24時間固定した後、エタノール脱水、キシレン処理によるエタノールの除去、ワックスの埋め込み、切片化を行いました。 組織切片（5 µm）は、回転式ミクロトームを使用して取得しました。 これらは、H＆E染色のためにスライドガラスに貼り付けられました。 精巣切片は、ハイライト組織病理学的顕微鏡を使用して観察され、精細管の発達を評価し、組織計測データを取得しました。 精細管の発達は、ジョンセンスコアリングシステムを使用して評価されました（22）。
ELISA。 治療の3日目0に、CO2で安楽死させる前に、マウスを10％抱水クロラール（Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co.、Ltd）で0.004 ml/g体重ipで麻酔しました。 体幹血液を採取し、血清を分離して-20℃で保存しました。 簡単に説明すると、血液を1.5 mlチューブに採取し、4℃で一晩保存しました。 次に、チューブを1,300 xg、4℃で6分間遠心分離し、血清を回収しました。 ELISAキット（Shanghai Elisa Biotech Co.、Ltd.、Shanghai、China）を使用して、テストステロン（カタログ番号EIA -2380）およびLH（カタログ番号EIA -2385）の血清含有量を測定しました。 ）メーカーのプロトコルに従って。 モデル680マイクロプレートリーダー（Bio-Rad Laboratories、Inc.、Hercules、CA、USA）を使用して光学密度（OD）を決定し、標準曲線に基づいてテストステロンとLHのレベルを決定しました。
免疫組織化学。 精巣組織を4％ホルムアルデヒドで室温で24時間固定し、パラフィンに包埋しました。 パラフィン切片を5µmの切片に切断し、続いて脱ロウしました。 抗原の回収は、切片を0。0 1 Mクエン酸バッファー（pH =6。0）で95〜98℃で5分間インキュベートすることで達成されました。 続いて、切片を5％ウシ血清アルブミン（Sigma‑Aldrich; Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ; A3675）で室温で1時間ブロックしました。 ブロッキング後、切片をLHR（カタログ番号L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1：200）またはP450側鎖切断（P450scc;カタログ番号ab75497; Abcam、Cambridge、UK）に対するウサギポリクローナル抗体とともにインキュベートしました。 ; 1：200）暗所で4℃で一晩。 ストレプトアビジン-ビオチン複合体（SABC）法を使用して、SABCキット（SA2010; Boster Biological Technology、Pleasanton、CA、USA）を製造元のプロトコルに従って使用して、LHRおよびP450sccの発現を検出しました。 陰性対照マウスから単離された組織については、一次抗体をPBSに置き換えた。 膜または血漿に黄色または茶色の染色が見られるライディッヒ細胞は、LHR陽性細胞と見なされました。 各サンプルから5つのスライドを取得し、ライディッヒ組織領域の5つのフィールドをランダムに選択し、蛍光顕微鏡（倍率、x400）で評価しました。 ライディッヒ組織領域の陽性細胞の平均ODは、Image-Pro Plus 6.0ソフトウェア（Media Cybernetics、Inc.、Rockville、MD、USA）を使用して取得しました。 LHRとP450sccの発現はOD値に比例し、OD値が高いほどタンパク質の発現が高いことを示しています。
末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（TdT）を介したdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）アッセイ。 マウスの精巣を解剖し、ワックスに包埋し、切片にした。 次に、切片（5- µm厚）を、TUNELアッセイキット（MK1024; Boster Biological Technology）を使用して、製造元のプロトコルに従って染色しました。 簡単に説明すると、コントロール（通常の生理食塩水）、DMSO、CsA、CC、WSSJD、および新しいWSSJDグループの精巣組織を、ビオチン標識ジゴキシン抗体の1：100希釈液を使用して37℃で30分間染色しました。 染色されたラット間質上皮組織（キットで提供）をポジティブコントロールとして使用し、ビオチン標識ジゴキシン抗体の代わりにPBSでインキュベートしたサンプルをネガティブコントロールとして使用しました。 緑の核染色を示すTUNEL陽性細胞の頻度は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して評価されました。 合計10の確率場を高倍率（x400）で評価し、陽性細胞をカウントしました。 フィールドあたりの陽性細胞の平均数を計算した。
ヨウ化プロピジウム（PI）またはアネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）染色およびフローサイトメトリー分析。 次の犠牲で精巣上体尾部を採取し、精巣上体を刃で切断して、精巣上体から精子を37℃で2mlのPBSに放出し、精巣上体懸濁液を得た。 続いて、懸濁液を37℃で10分間インキュベートして、精子を泳ぎ出させた。 精子の凝集体を廃棄し、残りの精子サンプルを分離し、PBSに再懸濁して106細胞/mlの濃度にしました。 精子のアポトーシスは、アネキシンV-FITCアポトーシス検出キット（Nanjing KeyGen Biotech Co.、Ltd.、Nanjing、China）を使用して、製造元のプロトコルに従って分析しました。 簡単に説明すると、1mlの精子懸濁液を10µlのPIまたは500 µlの結合バッファーと5 µlのアネキシンV-FITCで、暗所で室温で10分間染色しました。 細胞は、Epics XLフローサイトメトリー（Beckman Coulter、Inc.）およびTetraONE™システム（6915050; Beckman Coulter、Inc.）を使用して直ちに分析されました。 アポトーシスの初期段階の細胞はアネキシンV陽性染色で識別され、壊死細胞はPI陽性染色で識別されました。
統計分析。 データ分析は、SPSS 13. 0ソフトウェア（SPSS、Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国）を使用して実行され、示されているように平均プラスまたは±標準偏差として表されました。 一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定を使用して、グループ間の差の有意性を評価しました。 P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
ニクジュヨウ
結果
精巣精細管の発達に対する新しいWSSJDの効果。 マウス精巣精細管の発達に対する新しいWSSJDの潜在的な保護効果を調査するために、H＆E染色されたマウス精巣の形態を光学顕微鏡下で比較しました。 CsAおよびCCグループのマウスの精細管は、対照と比較して、精細管の収縮、細管の直径の減少、および精巣の精細管の層の減少を示した。 さらに、精子形成細胞は無秩序な配置を示し、精子形成細胞の数が減少し、内腔に成熟した精子がほとんど見えませんでした（図1）。 DMSO、WSSJD、および新しいWSSJDグループのマウスでは、精巣の精細管上皮のより多くの層が見られ、精細管のフリンジは収縮または崩壊することなく統合されました（図1）。 ジョンセンスコアは、DMSOグループとコントロールグループ間、またはCCグループとDMSOグループ間で有意差はありませんでした。 しかし、ジョンセンスコアは対照群と比較してCsAグループとWSSJDグループで有意に減少し、WSSJDと新しいWSSJDグループのスコアはCCまたはCsAグループと比較して有意に増加しました（P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
新しいWSSJDが血清テストステロンとLHに及ぼす影響。 続いて、血清中のテストステロンとLHのレベルを測定しました。 テストステロンとLHの血清レベルはDMSO投与後も影響を受けませんでした。 対照的に、血清テストステロンは有意にダウンレギュレーションされ、LHはコントロールと比較してCsA治療マウスで有意にアップレギュレーションされました（P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
LHRおよびP450sccの発現に対する新しいWSSJDの影響。 P450sccおよびLHRの発現は、免疫組織化学によって精巣ライディッヒ細胞で評価されました（図3および4）。 対照群では、LHRは精細管間のライディッヒ細胞の外膜に発現し（図3A）、P450ccは精巣ライディッヒ細胞の細胞質に発現しました（図4A）。 DMSO処理は、LHRおよびP450sccの発現に有意な影響を及ぼしませんでした。 対照的に、CsA治療は、対照マウスと比較してLHRおよびP450sccの発現を有意に減少させました（P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
精子形成細胞のアポトーシスに対する新しいWSSJDの効果。 マウス精巣の精子形成細胞のアポトーシスは、TUNELアッセイによって分析されました。 アポトーシス細胞の核は、主に精原細胞と初代精母細胞で観察されました（図5A）。 精原細胞は精母細胞よりも大きく、基底膜の近くにあります（23）。 DMSO処理は、精巣のアポトーシス精子形成細胞の数に有意な影響を及ぼしませんでした。 対照的に、CsAによる治療は、対照群およびDMSO群と比較してアポトーシス精子形成細胞の数を有意に増加させました（P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
精子の生存と初期アポトーシスに対する新しいWSSJDの効果。 CsAによって誘発された精子アポトーシスに対する新しいWSSJDの保護効果を検証するために、精巣上体における精子の生存と初期アポトーシスが決定されました。 精巣上体の精子をPIまたはアネキシンVで染色し、フローサイトメトリーで分析しました（図6および7）。 前述の結果に続いて、CsA治療は生きている精子の割合を大幅に減らし、初期アポトーシス精子の割合を大幅に増やしました（P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
討論
免疫抑制剤としてのCsAの長期使用は、生殖能力に影響を与えることが以前に報告されています（6）。 Xu（24）は、さまざまな用量のCsAで治療された26人の腎移植レシピエントと12人の健康なボランティアの精液サンプルで観察されたように、CsAで治療された患者の精子の形態と活力は未治療群よりも有意に低いと報告しました。 また、精子の頭部変形率は、CsA治療を受けたレシピエントで有意に高かったことが観察されました（24）。 これらの結果は、CsAが精液パラメーターに用量依存的な影響を及ぼしたことを示唆しました。 したがって、CsA誘発精巣損傷を軽減し、臓器移植後の男性の生殖能力を改善することができる新規薬剤を特定するための研究が必要です。
精巣の特定の微小環境は精子形成を促進し、したがって精巣の構造と機能の障害は精子形成の停止につながる可能性があります（25）。 Monteiro et al（26）は、Wistarラットを15 mg / kg /日の用量のCsAで56日間処理し、CsA処理ラットで結合組織の体積比率の増加とライディッヒ細胞の体積比率の減少を観察しました。 また、CsAが精細管上皮の変性を引き起こし、セルトリ細胞の空胞化、異常な円形および伸長した精子細胞、および内腔に隣接する上皮境界での残存細胞質の蓄積をもたらすことも観察されました（26）。 本研究では、Kunmingマウスを15 mg / kg CsAで30日間毎日処理しました。これにより、精細管の収縮と直径の減少、精細管層の減少、精細管の配置の乱れ、成熟度の低下が生じます。内腔の精子と有意に減少したジョンセンスコア。
さらに、CsA治療による治療は、精巣構造に深刻な損傷を与えました。 本研究はまた、CsA処理マウスの精巣に対する新しい漢方薬としての新しいWSSJDの保護効果を評価しました。 精巣の精細管上皮層および精細管細胞の配置が、新しいWSSJDでの治療後に回復したことが観察された。 さらに、新しいWSSJDグループのマウスは、収縮や崩壊のない統合された精細管を示し、CsA処理マウスと比較して有意に高いジョンセンスコアを示しました。 これらの結果は、WSSJDがCsA誘発精巣損傷を有意に修復したことを示唆しており、この漢方薬化合物がCsA誘発精巣損傷の予防に効果的な治療法である可能性があることを示しています。 この細胞修復が上皮内のニッチに依存しているかどうかも重要な問題であり、今後の研究で調査する必要があります。
視床下部-下垂体-精巣軸は、生殖器の活動の調節に重要な役割を果たします（27）。 男性の生殖器の発達と機能は、視床下部と下垂体からのホルモンによって調節されています（28）。 Krueger et al（29）は、SpragueDawleyラットを25mg / kg /dayCsAまたは40mg/ kg / day CsAで6日間処理し、LHおよびFSHの血清レベルが2-4倍増加し、P450scc発現が増加することを観察しました。対照群のそれの30パーセントに減少しました。 さらに、血清テストステロンレベルはCsA処理マウスで有意に減少し、精子形成の障害をもたらしました（29）。 本研究では、CsA処理がライディッヒ細胞におけるLHRの発現を有意に減少させることが実証されました。 血清LHは増加しましたが、LHRの発現が減少すると、テストステロン生合成の律速酵素としてLHを介したテストステロン生合成の回復が損なわれ、P450sccの発現が減少し（30）、ライディッヒ細胞によるテストステロン生合成に影響を及ぼした可能性があります。 ピロースアントラーなどの新しいWSSJDの新規成分は、性ホルモンと同様の効果を示し（12）、血清テストステロンレベルを改善し、血清LHレベルを低下させ、ライディッヒ細胞でのLHRおよびp450sccの発現を増加させます。 特に、現在の結果は、新しいWSSJDがライディッヒ細胞のテストステロン生合成と分泌を刺激して精子形成を促進することを示しました。
CSAによって誘発される酸化ストレスと精巣の損傷は、精子と精子形成細胞の異形成を誘発します（31）。 長期のCsA治療は、動物の精巣組織の抗酸化システムに損傷を与え、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、過酸化水素のレベルを低下させ、精巣のマロン性ジアルデヒドのレベルを上昇させることが報告されています（31）。 したがって、精巣組織内の過剰なレベルの活性酸素種を排除することはできず、精子膜脂質の過酸化、DNA損傷、および精子の活力の低下につながります。 本研究では、CsA処理により、精細管内のDNA破壊と精子形成細胞のアポトーシス率が有意に増加することが観察されました。 精巣上体の精子の生存率も低下し、初期アポトーシス精子の割合が増加し、精巣の精子形成活性が著しく損傷したことを示しています。 Türketal（32）は、CsA誘発精巣損傷に対するエラグ酸の保護効果が雄ラットの酸化ストレスと関連していることを報告しました。 本研究で使用された新しいWSSJDには、精巣の過酸化レベルを大幅に低下させることが以前に実証されている漢方薬の高麗人参を含む、さまざまな抗酸化成分が含まれています（14）。
本研究では、テストステロン合成と精子形成アポトーシスのCsA誘発性障害に対する新しいWSSJDの影響を調査し、新しいWSSJDが精子形成細胞と精子のアポトーシス率を有意に低下させ、精巣精細管への損傷を修復することが観察されました。上皮。 精巣精細管の形態と精子形成細胞および精子のアポトーシスは、組織化学およびフローサイトメトリーを使用して調査されました。 細胞周期の分布と毎日の精子の生産は調査されていませんが、それらは私たちのグループによる将来の研究の焦点となるでしょう。
WSSJDは、精巣のテストステロンレベルを大幅に増加させ、精子形成細胞と精子のアポトーシスを減少させ、CsAによって誘発された精巣の損傷を効果的に修復しました。 これらの結果は、新しいWSSJDがCsA誘発精巣損傷の治療および予防において有用な薬剤である可能性があることを示しています。
ニクジュヨウ全体のルーツ
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