近赤外分光法によるカンカニクジュヨウの6つの有効成分の迅速な同時測定
Mar 06, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Xinhong Wang、Xiaoguang Wang、Yuhai Guo
概要：
特定の植物の複数の有効成分を定量的に測定するには、通常、非常に大量の本物の天然物が必要です。 この研究では、エキナコシド、ベルバスコシド、マンニトール、スクロース、グルコース、およびフルクトースを同時に測定するための迅速で非破壊的な方法を提案しました。カンカニクジュヨウ近赤外分光法（NIRS）による。 近赤外拡散反射分光法（DRS）と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、116バッチのカンカニクジュヨウサンプルで実施されました。 DRSデータは、標準正規多様体（SNV）および乗法散乱補正（MSC）メソッドを使用して処理されました。 部分最小二乗回帰（PLSR）を利用して、カンカニクジュヨウの対象成分のキャリブレーションモデルを構築しました。 次に、すべてのモデルは、キャリブレーションの二乗平均平方根誤差（RMSEC）、キャリブレーションの相関係数（r）を計算することによって評価されました。 6つのキャリブレーションモデルすべてのr値は、0。94より大きいと判断され、各モデルが信頼できることを示しています。 したがって、この研究で報告された定量的NIRモデルは、6つの医薬品成分の含有量を正確に定量化するために認定することができます。カンカニクジュヨウ.
キーワード：Cistanche tubeulosa; 高速液体クロマトグラフィー; 近赤外分光法; 部分最小二乗
序章
Cistanche（Hoffmg。Et Link）は、ハマウツボ科の植物の多年生の幻覚属です。 Cistanche属に属するほとんどの種は、中国で何千年もの間薬用植物として使用されてきました。 優れた強壮剤としての評判があります。 そして「砂漠の高麗人参」として知られています[1,2]。カンカニクジュヨウ多年生植物タマリクス・チネンシスの根の絶対寄生虫です。 2005年版からCistanchesHerba（中国名：Roucongrong）の本物の情報源として中国薬局方に記録されています[3]。 ホンオニク属の種に関する現代の薬理学的研究は1980年代に開始されました[4]。 薬理学的調査により、Cistanche植物の抽出物は、腎臓の欠乏や老人性便秘の治癒、学習能力の向上、抗アルツハイマー病、免疫力の強化、老化防止、倦怠感など、幅広い活動を持っていることが示されました。 。[1,5–7]。 過去30年間で、包括的かつ体系的な薬理学的研究が植物化学的調査と組み合わされて、ホンオニク属植物の根の有益な効果の物質的基礎を明らかにしてきました。 これらの調査は、フェニルエタノイド配糖体（PhG）が、腎臓欠乏症、インポテンス[8]、アンチエイジング[9]、および抗アルツハイマー病[10]の治療に重要な役割を果たすCistanche植物の主要な有効成分であることを示しています。 中国薬局方では、2つのPhG（エキナコシドとベルバスコシド）の内容が必要でした。 一方、Cistanche植物のマンニトール、スクロース、グルコース、フルクトースなどの炭水化物は下剤機能を持っており、Cistanche植物の炭水化物クラスターは便秘の治療に使用されています[11]。
の野生資源カンカニクジュヨウ主に中国の新疆ウイグル自治区南部のタクラマカン砂漠周辺に分布しています。 漢方薬（TCM）として使用される他の多くの種と同様に、C。tubulosaは経済的価値が高く、過剰な採集のために野生の生息地でほとんど絶滅しています。 C.tubulosaの栽培は1990年代に中国で始まり、Cistanches Herbaの原材料の供給を確保し、野生植物資源を保護しました。 2017年現在、新疆ウイグル自治区のホータン県には13,000ヘクタール近くのカンカニクジュヨウが生息しています[12,13]。 植栽技術の進歩が求められており、栽培の拡大と品質の向上が求められています。カンカニクジュヨウ。
栽培の主な目的カンカニクジュヨウそれらの効果的な成分が豊富なCistanchesHerbaを生産することです。 ただし、PhGやオリゴ糖などのCistanches Herbaの有効成分の含有量は、製造中の多くの要因によって大きく影響を受ける可能性があります[12、13]。 カンカニクジュヨウの品質のリアルタイム検出システムを検討する必要があります。 したがって、短時間で多数のサンプルを分析するという要件を完全に満たすために、ハイスループットメソッドを開発する必要があります。 従来、C。tubulosaのPhGや炭水化物などの主要な有効成分の測定は、通常、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して行われました[14,15]。 正確で信頼性はありますが、データの収集と処理には時間と手間がかかります。 さらに、HPLCアッセイの粉砕、抽出、ろ過を通常含むサンプル前処理にも、多大な時間と労力が必要です。 したがって、比較的大量のデータを取得するには、明確な原理と操作が簡単なツールが必要です。 幸いなことに、近赤外分光法（NIRS）は、迅速かつ非破壊的であるため、農産物[16]、食品[17]、医療サンプル[18]、および医薬品[19]の評価に広く使用されています。 したがって、NIRSはTCMの効率的な測定の要件に正確に一致する可能性があり、NIRSがTCMの定性的同定[20,21]および化合物の定量化[22]に適用されたことは驚くべきことではありません。
この研究では、2013年から2015年に新疆ウイグル自治区のホータン県から収集されたC.tubulosaサンプルの116バッチに含まれる、エキナコシド、ベルバスコシド、マンニトール、スクロース、グルコース、フルクトースを含む6つの有効成分の含有量を最初にHPLCで測定しました。 その後、これら6つのコンポーネントのキャリブレーションモデルは、部分最小二乗回帰（PLSR）法で確立されました。 次に、これらのモデルは、キャリブレーションセットの相関係数と予測誤差で検証されました。 結果は、開発された方法がカンカニクジュヨウの定量分析のための信頼できる方法として使用できることを示した。
結果
HPLC分析
エキナコシドとベルバスコシドの含有量は、文献[3,23]で明確に定義されたHPLC-UV法によって決定され、4つの炭水化物（マンニトール、スクロース、グルコース、およびフルクトース）は明確に定義されたHPLC-ELSD法によって決定されました。 116サンプルすべての文献[24]。 サンプルの準備と決定の方法はセクション3.1と3.3で説明されています。 図1に、混合標準の特徴的なクロマトグラムを示します。 6つの有効なコンポーネントすべてがベースラインで分離されているため、定量化できることがわかります。 サンプルテストの前に、HPLCメソッドを検証しました。 HPLCメソッドの主な結果を表1に示します。エキナコシド測定メソッドの良好な線形関係（r=0。9998）と回収率（98.5％）が結果に示されています。これは、すべての5つのコンポーネント。 したがって、6つの有効なコンポーネントの内容を正確に決定できます。 決定されたすべてのコンテンツ範囲を表1に要約します。
NIRS分析
図2は、カンカニクジュヨウサンプルのNIRスペクトル（4 000 –10、000 cm-1）を示しています。 有意な吸収ピークはすべてのサンプルで4000cm-1から7500cm-1に現れ、穏やかな変動は7500cm-1から10,000cm-1に現れました。 NIRスペクトルのベースラインドリフトは、サンプルが粒子サイズや色などの要因の影響を受けやすいために発生しました（図2A）。 スペクトルの数学的前処理を使用して、不要な情報の影響をある程度減らしました。 数学的前処理には、1次導関数（1次導関数）、2次導関数（2次導関数）、標準正規多様体（SNV）、および乗法散乱補正（MSC）が含まれます。 図2Bは、カンカニクジュヨウのNIRスペクトルの2番目の導出を示しており、4000〜4500 cm-1、5000〜5500 cm-1、および7000〜7500cm-1の3つの領域から発生した有意な変動が明らかに観察されています。 。
定量的キャリブレーションモデルの確立
部分最小二乗回帰（PLSR）は古典的なモデリング手法であり、結果の品質が高いため、定量的モデルに広く適用されています。 PLSRの利点には、その優れた予測能力と比較的単純なことが含まれます。 PLSRは、TCMの定量的キャリブレーションモデルの確立にも広く適用されています[25]。 前処理されたNIRスペクトルに基づいて、C。tubulosaの6つの有効成分のNIR定量分析モデルが、HPLC分析データを真の値としてPLSR法を使用して確立されました。 116のサンプルは、3：1の比率でキャリブレーションセットと検証セットにランダムに分割されました。 キャリブレーションに最適な条件は、低いRMSECと高い相関係数によって選択されました。
キャリブレーションモデルの波長帯の選択
適切な波長帯の選択は、キャリブレーションモデルを構築するための重要なステップでした。 この研究では、4 000 – 7500 cm -1（TQアナリストソフトウェアが推奨）と4 000 – 10,000cm-1のNIR間隔スペクトルを比較しました。 この範囲は、表2の4000cm-1と7500cm-1の間の間隔では、キャリブレーションには不適切であることが観察されました。したがって、現在の研究では、6つの化学成分のスペクトル間隔は次のようになりました。 RMSECの性能と相関係数を比較することにより、すべて4000〜10,000cm-1の間隔から選択されます。
キャリブレーションモデルの最適な因子数の選択
PLSRは、因子の計算によってスペクトルデータの次元を減らすことにより、データの変動の最大量を説明します。 「不適合」の問題は、限られた数の要因に起因する不十分な情報が原因で発生しました。 ただし、モデルに導入された最適値よりも大きい係数を選択すると、「過適合」の問題が発生します。 「不適合」または「過適合」のいずれかは、確立されたモデルの予測力を低下させます[22]。 図3は、RMSECVと6つの化合物すべての因子との関係を示しています。 したがって、RMSECVの最低値に対応する要素を選択しました。 キャリブレーションモデルの因子の最適な選択を表3に示します。
キャリブレーションモデルのスペクトル前処理の選択
キャリブレーションモデルのもう1つの最も重要な影響要因は、散乱とベースラインドリフトの影響を減らし、信号対雑音比を高め、不規則な変動を取り除くことを目的としたスペクトル前処理です。 乗法散乱補正（MSC）および標準正規変量（SNV）法を使用して、通常の放射線散乱の影響を排除しました。 ベースラインドリフトの影響を解決するために、1次および2次微分スペクトルを比較し、2次微分を選択しました[26]。 望ましい効果を得るために、ノイズの拡大を防ぐために、導出前にSavitzky–Golay（SG）フィルターアルゴリズムを使用してスペクトルを平滑化しました。 表3は、スペクトル前処理に関する情報と、キャリブレーションモデルの結果を示しています。
確立されたモデルの評価
優れたNIRSキャリブレーションモデルは、RMSEC値とRMSEP値が低く、相関係数（r）が高く、RMSECとRMSEPの差が小さい必要があります[27–29]。 選択した6つの化合物のキャリブレーションモデルは、上記の手順に従って確立されました（表3）。 エキナコシドのキャリブレーションセットのRMSEC値とr値は、それぞれ27.6と0。9808でした。 他の化合物モデルの性能パラメータを表3に示します。この表から、確立されたモデルは満足のいく予測結果をもたらし、カンカニクジュヨウの迅速な定量分析に使用できると結論付けることができます。 キャリブレーションモデルをよりわかりやすく視覚的に観察できるように、6つの化合物の散布図を図4に示します。 図4に示すように、ほとんどのドットはy=xの式で回帰曲線の周りに分布していたため、予測値と測定値の間にわずかな違いが生じました。 したがって、優れた予測パフォーマンスが図4で観察されました。
材料および方法
サンプル準備
2013年から2015年にかけて、新疆ウイグル自治区のホータン県から116のカンカニクジュヨウのサンプルが収集されました。すべてのサンプルが栽培されましたが、さまざまな成長段階で収集されました。 サンプルの新鮮な重量は20gから1000gの範囲でした。 天日乾燥後、乾燥したサンプルを粉砕し、60-メッシュふるい[3,23]でふるいにかけました。
NIR分光データ収集
サンプルのNIRスペクトルは、Antaris MXFT-NIRシステム（Thermo Scientific、マディソン、ウィスコンシン州、米国）ハンドヘルド光ファイバー反射率アダプターを装備。 各スペクトルは、64回のスキャンを平均して得られました。 NIRスペクトルスキャンの前に、すべてのサンプルを室温（25°C）に平衡化させて、サンプルが同じ温度で分析されるようにしました。 実験室の湿度は周囲レベルに保たれました。
HPLCデータ収集
抽出の準備
1グラムのC.tubulosa粉末を、超音波処理（500 W、40 kHz）を使用して三角フラスコ内で50％メタノール50mLで30分間抽出しました。 抽出物は4℃で保存されました。 抽出物の上清をろ過して、HPLC分析用のサンプルを取得しました[3,23]。
HPLC-UVによるエキナコシドとベルバスコシドの同時定量
液体クロマトグラフィー分析は、2つのLC -20 ADXR溶媒デリバリーユニット、LC -20 ADポンプ、SIL -20ACXRautoサンプラーで構成される島津UHPLCシステム（島津製作所、京都、日本）で実施しました。 、CTO -20 ACカラムオーブン、SPD-M20A DAD検出器、DGU -20 A3Rデガッサ、およびICBM-20Aコントローラ。
クロマトグラフィー分離に使用されるGracePrevailCarbohydrate ESカラム（150×2.1mm、2.7 mm）は、35°Cに維持されました。 移動相は、アセトニトリル（A）と0。1パーセントギ酸水溶液（B）で構成され、次のようなグラジエントプログラムに従って送液されました。0 – 7分、10–20の直線グラジエントパーセントA; 7〜15分、20パーセントA; 15〜20分、20〜10パーセントAの直線勾配。移動相のフェローレートは0.4 mL/minでした。 UVモニタリングは330nmで実行されました。
HPLC-ELSDによるマンニトール、スクロース、グルコース、フルクトースの同時定量
HPLCは、aG1322Aデガッサ、G1311Aクォータナリポンプ、G1311Aオートサンプラ、G1316Aカラム温度コントローラ、およびG1315BDAD検出器で構成されるAgilent1100シリーズLCシステム（米国カリフォルニア州パロアルト）で実施しました。
Sigma Prevail Carbohydrate ESカラム（4.6×25 0 mm、5 µm）をクロマトグラフィー分離に使用し、カラム温度25°Cに維持しました。 移動相は、アセトニトリルと水（77：23、v / v）で構成され、0.7 mL/minの速度でアイソクラティックに供給されました。 流出物は、デフォルトのパラメータで蒸発光散乱検出器（ELSD）を使用して監視されました[23,24]。
情報処理
TQアナリスト（バージョン8. 0、Thermo Scientific、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して、キャリブレーションセットと検証セットの分割、スペクトルの数学的前処理、キャリブレーションモデルの確立、およびその他の計算を実行しました。 Origin（バージョン9.1）を使用して図を作成しました。
結論
謝辞：この作業は、中国の国家科学技術計画プロジェクト（2015BAD29B 00-04）によってサポートされました。
著者の貢献：Xinhong Wangは実験を考案し、設計しました。 XinhongWangとXiaoguangWangが実験を行いました。 XinhongWangとYuhaiGuoが論文を書きました。
利害の対立：著者は、利害の対立がないことを宣言します。
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