腎CD169プラスと常駐マクロファージは急性全身性カンジダ症からの保護に重要です
Mar 21, 2022
序章全身性カンジダ症は、病院での衛生管理にもかかわらず、毎年250人以上の集中治療室の患者に影響を与えると推定される4番目の一般的な血流院内感染症です（Delaloye＆Calandra、2014; Kullberg＆Arendrup、 2015）。 この感染症の現在の治療は主に抗真菌薬を使用していますが、患者の死亡率は驚くほど高いままです（40〜60パーセント）（Delaloye＆Calandra、2014; Bassetti et al、2018; Lamoth et al、2018）。 しかし、現在のところ、臨床的に利用できるワクチンはありません。 慢性疾患に苦しむ入院患者の増加と抗真菌薬耐性の新たな症例により、そのような感染に対する宿主の免疫を理解することは、現在の抗真菌介入を改善または補完する免疫療法を開発する上で重要になります（Armstrong-James et al、2017; Desai et al、2017; Bassetti et al、2018）。 侵襲性抗真菌免疫の中心的役割を果たしていることで広く知られている食細胞、特に多形核食細胞（好中球）は、食作用、活性酸素種（ROS）や殺菌性タンパク質の放出、NETosis形成（ Borregaard、2010; Mantovani et al、2011）。 カンジダ免疫における好中球の極めて重要な役割は、全身性カンジダ症の素因としての好中球減少症と好中球欠損症の臨床的関連によってさらに強調されています（Lehrer＆Cline、1969; Wisplinghoff et al、2004; Pfaller＆Diekema、2007; Yapar、2014） 。 ただし、in vivoでのこの感染におけるさまざまな単核食細胞の役割については、ほとんど知られていません。これは、一部には、さまざまなマクロファージおよび樹状細胞サブセットを描写するための利用可能なツールがないためです。腎臓,これらは全身性カンジダ症の主な標的臓器です（Schraml et al、2013; Gottschalk＆Kurts、2015）。
キーワード：肝臓; 腎臓障害; 腎臓組織; 腎臓真菌; 腎臓の損傷; 腎機能
侵襲性カンジダ免疫におけるマクロファージの重要性は、私たちの知る限りでは、Lionakis et al（2013）によって最初に強く実証されました。 CX3CR1gfp / gfpマウスを利用して、腎臓マクロファージの個体数は大幅に減少し、Lionakis et al（2013）は次のことを示しました腎臓常駐マクロファージは、カンジダ・アルビカンスの襲撃に対する重要な第一線の防御者です（Lionakis et al、2013）。 また、これらのマクロファージは、好中球の動員の調節に関与しているようでした。腎臓カンジダ感染中（Kanayama et al、2015）。 真菌の除去を促進することに加えて、マクロファージは腎臓組織修復（Tran et al、2015）。 CD169は、Sialoadhesinまたはシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン1（Siglec -1）とも呼ばれ、肺などのさまざまな末梢臓器の組織内に存在するマクロファージ（TRM）を識別する特定のマーカーであることが以前に報告されています。 、脾臓、肝臓、および腎臓（Purnama et al、2014; Karasawa et al、2015; Gupta et al、2016; Svedova et al、2017）。 興味深いことに、腎臓CD169とマクロファージは、疾患/傷害モデルに応じて、免疫病理学の進行または免疫の消散に向けて、免疫調節に関連付けられています（Chavez-Galan et al、2015）。 ただし、全身カンジダ免疫におけるCD169とマクロファージのinvivoでの機能的役割についてはほとんど知られていません。 ここでは、腎臓CD169 plus plusマクロファージは、急性全身性カンジダ感染症における重要な免疫調節因子です。 CD169 plus plusマクロファージが存在しないと、IFN応答と好中球ROS産生が低下します。腎臓。その結果、CD169プラスマクロファージを欠くマウスは、低用量のカンジダ感染症に屈し、非常に高い真菌負荷と重度を示します腎臓免疫病理学。
結果
CD169プラスプラスマクロファージは腎TRMの亜集団です腎TRMを調査するために、CD169発現のためにジフテリア毒素（DT）治療時にTRMを特異的に除去するCD 169- DTRトランスジェニックマウスモデルを利用しました（Purnama et al、2014; Gupta et al、2016; Chen＆Ruedl 、2020）。 CD169に加えて、高発現レベルのF4 / 80と中レベルのCD11bを仲間のサイトメトリー分析で使用して、TRMを他のマクロファージ亜集団と区別しました（Sheng et al、2015）（図1A）。 興味深いことに、腎臓F4 / 80hi CD11bintマクロファージは、DT処理したCD 169- DTRトランスジェニックマウスで除去され（図1AおよびB）、F4 /80hiCD11bintマクロファージ集団の不均一性を示唆しています。肝臓。私たちの観察と並行して、Karasawa et al（2015）はまた、腎臓TRMはCD169を表現します（Karasawa et al、2015）。 特に、彼らはCD169 plusplusTRMが主に腎臓髄質領域、蛍光抗体染色で裏付けられています（図1C）。
ここで、アブレーションされたCD169 plus+TRMは適度に低いレベルのF4/80およびCD11b（F4 / 80 plus + CD11b plus）を発現し、一方、アブレーションされていないTRMは比較的高いレベルのF4 / 80およびCD11b（F4 / 80 plus plusプラスCD11bプラスプラス）。 ただし、これら2つのTRM集団は、WTマウスでは区別できません（図1A）。 したがって、アブレーションされたTRMとアブレーションされていないTRMに基づいて、フラクションI（Fr I）（CD169 plus + F4 / 80 plus + CD11b plus）とフラクションII（Fr II）（CD169 + F4 / 80 plus plus plus CD11b）に大まかに分類しました。プラスプラス）集団（図1AおよびB）。 注目に値するのは、CD 169-DTRマウスにおけるFrII集団の顕著な、しかしわずかな減少も、FrII集団の一部がCD169を発現していることを示しています。 CD 169- DTRマウスのTRM除去プロファイルは、CD169転写産物の発現と一致しており、FrI集団はFrII集団と比較して有意に高いレベルのCD169を発現します（図1D）。 これに対応して、DTの受容体であるヒトヘパリン結合性EGF様成長因子（HB-EGF）のレベルが、Fr II TRMと比較してFrIで観察され、DT治療に対する感受性を説明しています（図1E）。
CISTANCHEは腎臓/腎不全を改善します
腎CD169プラスマクロファージの欠如は、播種性カンジダ症に対する宿主の耐性を大きく損ないましたCD169プラスマクロファージの重要性を評価するために、CD 169- DTRおよびWTマウスを5×104cfuのC.Albicansの低用量で静脈内投与し、それらの生存を18日間モニターしました。 感染の過程で、CD 169-DTRマウスのFrI集団の継続的な切除を確実にするために、マウスをDTで継続的に治療しました（図S1）。 Fr Iマクロファージの部分的な減少は、感染後3日目（pi）に感染したWTマウスでも観察されました（図1F）。これは、病原性感染中に発生することが報告されているマクロファージネクロトーシスの結果である可能性があります（Lai et al 、2018; Cao et al、2019）。 逆に、CD 169-DTRマウスにおけるFrIマクロファージの完全な除去は、主にDT治療によって誘導されたアポトーシスによるものでした。 それにもかかわらず、CD 169-DTRマウスのFrIマクロファージの数は、感染の過程を通じて、WTマウスのマクロファージよりも一貫して実質的に少なかった。 一方、Fr IIマクロファージの総数は、感染したWTマウスとCD 169- DTRマウスの間で同等でした（図1F、右パネル）。 その結果、FrITRMを欠くCD169-DTRマウスは、全身性カンジダ感染症に感染した場合、WTマウスよりも明らかに脆弱でした（図1G）。
CX3CR1gfp / gfpマウスは、以前は肝臓合計が失われたためのTRM腎臓F4 / 80 + CD11b +人口（Lionakis et al、2013）。 したがって、CX3CR1gfp/gfpマウスとCD169-DTRマウスを比較することで、腎TRM集団の部分的喪失と全体的喪失の間の機能的影響を理解することができます。 これを達成するために、CD 169- DTR、CX3CR1gfp / gfp、およびWTマウスに5×104 cfuC.Albicansを感染させました。 以前に報告されたものと同様に、CX3CR1gfp / gfpマウスは腎TRM（Fr IおよびII集団の両方）の完全な欠如を示しましたが、CD 169-DTRマウスはFrI集団のより特徴的な喪失を示しました（図S2AおよびB ）。 同様に、Fr IおよびIIマクロファージの両方が欠如しているため、CX3CR1gfp / gfpマウスは全身性カンジダ症に非常にかかりやすく（図S2C）、感染したWTおよびCDと比較した場合、早ければ1日目で非常に高い腎真菌負荷を伴います{{20 }} DTRマウス（図S2D）。 対照的に、CD 169- DTRマウスは、CX3CR1gfp / gfpマウスよりも低い死亡率を示し（図1GおよびS2C）、腎臓真菌の負荷は、10日目に感染したWTマウスよりも有意に高かっただけでした（図2AおよびB）。 DT処理CD169-DTRおよびCX3CR1gfp/gfpマウスは他の臓器でTRMを欠いているため（Hochheiser et al、2013; Gupta et al、2016; Lee et al、2018）、複数の末梢臓器での真菌負荷を評価しました、 あれは、肝臓、脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、感染したWT、CD 169- DTR、CX3CR1gfp / gfpマウスの1日目pi興味深いことに、CD169-DTRマウスとCX3CR1gfp/gfpマウスの両方、腎臓調査した他の臓器よりも明らかに高い真菌負荷を示した唯一の臓器でした（図S2D）。 1日目のCX3CR1gfp/gfp腎臓におけるカンジダ負荷の増加は、Lionakis et al（2013）によって報告された発見を再確認します。腎臓TRMは腎臓全身性カンジダ感染に対する一次防御（Lionakis et al、2013）。
一方、腎臓CD 169- DTRマウスの真菌負荷は、CX3CR1gfp / gfpマウスの真菌負荷よりも有意に低かったが、感染したWTよりも明らかに高くはなかった。腎臓1日目pi（図S2D）。 FrII集団はCD169-DTRマウスでは比較的無傷のままであるため（図S2AおよびB）、CX3CR1gfp/gfpマウスと比較した場合にCD169-DTRマウスで観察された耐性の増加が主にあるかどうかを疑問視しました。ほとんどのC.Albicansが定常状態で免疫細胞がほとんど検出されなかった尿細管に侵入するのを妨げるように機能する、衰えることのない腎FrIIマクロファージが残っているためです。 この目的のために、1、3、6、および1 0 piで、WTおよびCD 169- DTRマウスのさまざまな臓器の真菌負荷を監視しました（図2）。 ここで、我々のデータは、CD 169- DTRマウスの腎臓を除くすべての臓器が10日目までにC.Albicansを除去されたため、真菌クリアランスにおけるCD169プラスマクロファージの腎臓制限依存性を示しました（図2A） 。 興味深いことに、Fr Iサブセットが失われたにもかかわらず、CD 169- DTRマウスの真菌負荷は感染したWTマウス（0〜6日目）と同様に発生し（図2AおよびB）、腎臓のCD169プラスプラスの役割が最小限であることを示唆しています。この感染に対する一次防御を引き出すマクロファージ。 CD 169- DTRマウスとWTマウスの間の腎臓の真菌負荷の不一致は、pi 10日目にのみ検出され、CD 169-枯渇した腎臓の真菌負荷は増大し続けましたが、WTマウスの場合は封じ込めまたはクリアされた（図2B）。 したがって、私たちのデータは、腎臓のカンジダ免疫におけるCD169プラスとマクロファージの不可欠な役割を示していますが、そのような感染に対する腎臓の第一線の防御にはほとんど貢献していない可能性があります。 驚くべきことに、CX3CR1gfp /gfpマウスはFrIとFrIIの両方のマクロファージを欠いており、1日目までに感受性の増強を示したため（図S2）、FrIICD169とマクロファージが主に初期腎真菌の重要な生来のメカニズムに関与していると仮定しました。コントロール。
CD 169- DTRマウスは、カンジダ感染中に不可逆的で進行性の腎障害を患っていました腎臓は感染中にC.Albicansが蓄積した唯一の臓器であったため（図2A）、次に定期的な酸シフ（PAS）（図2C）およびH＆E（図3AおよびS3）で染色された切片の組織病理学的検査を行いました。感染したWTおよびCD169-DTR腎臓から3、6、および10 pi 3日目に、CD 169- DTR腎臓で腎損傷および出血の兆候が観察されました（図S3A）。 6日目に、感染したWT腎臓は尿細管および内皮の損傷の軽微な兆候を示しましたが、感染したCD 169- DTR腎臓は、より重度の出血と尿細管壊死を示しました（図S3B）。 感染したWT腎臓とCD169-DTR腎臓の両方で、ほとんどのC. Albicansが腎盂に発生しているように見えました（図2C）。 注目すべきことに、WTとの両方でinsituで白血球の蓄積がありました
CD 169- DTR腎臓、CD 169-DTR腎臓での制御されていないC.Albicansの成長は、白血球動員の欠如によるものではないことを示唆しています（図2Cおよび4A）。 10日目に、CD 169- DTR腎臓の構造的完全性が悪化し、線維性組織の出現を伴いました（図3AおよびS3C）。 具体的には、ボーマンの空間の拡大と、CD 169- DTR腎臓のいくつかの尿細管の内腔内の管状上皮細胞および白血球のクラスターの顕著な脱落がはっきりと見えた（図3A）。 対照的に、10日目までに、WT腎臓のほとんどの腎臓領域は無傷のままであるように見え、初期感染からの回復を示しています（図3AおよびS3C）。 腎臓の組織学的分析と並行して、感染したWTおよびCD 169- DTR腎臓、タイプ-1膜貫通タンパク質における腎臓損傷分子-1（Kim -1）のレベルを評価しました。その発現は、尿細管の損傷時にのみ増強されます（Ichimura et al、
1998; ハンら、2002; Bonventre、2009）。 私たちのデータは、感染したCD 169-DTRマウスの腎臓におけるKim-1の発現が、感染したWTよりも10日目で劇的に高かったことを示しました（図3B）。 さらに、CD 169- DTR腎臓に保持されているエバンスブルーの量が多いことから明らかなように、CD 169- DTRマウスの腎臓の内皮層の完全性は著しく衰弱していました（図3C）。 CD169とマクロファージは抗炎症性であることが以前に示され、これらのマクロファージの欠如は、細菌感染または虚血再灌流傷害における過剰炎症を引き起こしました（Karasawa et al、2015; Svedova et al、2017）。 これらのモデルと一致して、CD 169- DTRマウスの腎臓は、より高いレベルの炎症（すなわち、TNF-、G-CSF、およびM-CSF）と関連しており、腎機能は、
腎臓のCD169プラスマクロファージの不在は、カンジダ感染中のエフェクター細胞の動員を損なうことはありませんでしたCD {{0}} DTR腎臓におけるカンジダの非効率的なクリアランスは、エフェクター細胞の動員の欠如が原因である可能性があるため、WTおよびCD169-DTRマウスの腎臓における好中球および単球の浸潤をモニターしました。 0、1、3、6、および10 pi日目組織学的観察（図2C）と同様に、腎CD169プラスFr Iマクロファージの不在は、感染中の白血球の動員に影響を与えませんでした（図4A）。 代わりに、CD 169- DTR腎臓は、好中球および単球を誘引するケモカイン（CXCL1、CXCL2、CCL2など）および細胞接着分子（ICAM -1など）のより高い発現と関連していました（図4BおよびC）。 CD 169- DTR腎臓のケモカインレベルの上昇は、おそらくC. Albicansの無制限の成長によるものであり、6日目から10piまでの免疫細胞浸潤量の増加と相関しています。対照的に、兆候はほとんどありませんでした。 C. WT腎臓のアルビカンス、および免疫細胞は、pi 10日目に大部分が除去されました（図2Bおよび4A）。 したがって、我々のデータは、腎CD169プラスマクロファージが、カンジダ感染中のエフェクター細胞、特に好中球の動員における主要なプレーヤーではなかったことを示唆している。
CD 169- DTR腎臓の好中球は、より低いROS産生を生成します次に、CD169 plus plusマクロファージの欠如が、腎臓における宿主のカンジダ酸反応に悪影響を与えるかどうかを調査しました。 この目的のために、感染したWTおよびCD 169-DTR腎臓のROS産生好中球および単球の量を6日目（WTおよびCD 169- DTR腎臓の両方が同様の真菌負荷を示した日）に評価しました。および細胞浸潤（図2Bおよび4A）。 興味深いことに、WTと比較した場合、CD 169- DTR腎臓では、単球ではなく、ROS産生好中球の量が少ないことが観察されました（図5AおよびB）。 これに対応して、CD 169- DTR腎臓のこれらの好中球は、WTの好中球よりも有意に低いレベルのROSを生成し、好中球の殺傷能力が低いことを示唆しています（図5CおよびD）。
次に、CD 169- DTR腎臓のカンジダ酸機能の低下が、好中球の生存率の低下によるものかどうかを調べました。 驚いたことに、感染したWT腎臓とCD 169- DTR腎臓の両方で、PInegアネキシンVとアポトーシス、PIとアネキシンVと死んだ好中球の比率が同じでした（図5EおよびF）。 これは、好中球の生存率が、CD 169- DTR腎臓におけるカンジダ酸機能の低下に寄与する要因の1つではないことを示しています。CD169プラスマクロファージがない場合、腎IFN発現は有意に低かった非効率的なカンジダクリアランスとROSの低下の関連CD 169- DTR腎臓の好中球のレベルは、感染したWTおよびCD 169-DTR腎臓の6日目のpiにおけるIFNの発現レベルを調査するように促しました。このサイトカインは、増強することによって侵襲性カンジダ症を予防することが知られています。好中球のカンジダ酸能力（Diamond et al、1991; Kullberg et al、1993; Stevenhagen＆van Furth、1993; Nader-Djalal＆Zadeii、1998）。 興味深いことに、感染したCD 169- DTR腎臓での腎IFN発現の低下が、qPCR（図6A）および他のサイトメトリー分析（図6B）によって観察されました。
IFN産生細胞は、CD19intカッパ軽鎖と細胞集団に限定されています次に、pi 6日目にIFNを産生する免疫細胞のタイプを描写しようとしました（図7A）。 驚いたことに、これらのIFN産生細胞は、Ly6CintLy6Glo、F4 / 80loCD11blo、MHCIIとCD11clo、CD49bnegCD3neg、およびCD8negCD4negであり、Tリンパ球、古典的なAPC、および顆粒球ではないことを示しています。 代わりに、感染したCD 169- DTR腎臓で明確に減少するこれらのIFN産生細胞（図7B）は、MHCII、カッパ軽鎖、およびCD19intを発現し、B細胞様集団を示唆します（図7A）。 。 NK細胞は、カンジダ感染におけるIFN分泌によって食細胞の抗真菌メカニズムを強化するための重要なモジュレーターであるため（Bhatnagar et al、2010; Costantini et al、2010; Bar et al、2014; Voigt et al、2014）、最後にNK細胞は、この感染症におけるIFNの産生を調節するために必要です。 この目的のために、我々はインビボでNK細胞を免疫枯渇させ、感染した腎臓におけるIFNの発現レベルを2日目と6日目に評価しました。我々のデータは、NK細胞の枯渇がIFNの産生にもIFN産生細胞の量にも影響を与えないことを明らかにしました（図S4A–C）。
討論
TRMは、さまざまな感染症における重要な先天性応答を仲介し、一般にF4/80hiおよびCD11bプラス集団として認識されます。 CD169としても知られるSialoadhesinは、腎臓のTRMのサブセットによってのみ発現されることが強調されました（Karasawa et al、2015）。 しかし、腎CD169とTRMに関するその後の報告はありませんでした。 私たちのデータは、腎TRMが均質ではなく、F4 / 80plusplusの2つのサブセットに大まかに分類できるという最近の発見を裏付けています。
CD11b plus（CD169 plus plus）TRMおよびF4 / 80 plus plus plus CD11b plus plus（CD169 plus）TRM。 CX3CR1gfp/gfpおよびCD169-DTRマウスを使用して、CD169 plus+TRMおよびCD169plusTRMの両方が全身性カンジダ免疫に不可欠であり、各サブセットがカンジダ腎免疫において異なる機能を示すと結論付けました。 具体的には、CD169 plus + TRMは、感染後期の腎臓のC. albicansの増殖を制御するのに不可欠であるように見えますが、CD169 plus TRMは、感染の初期段階で真菌の増殖を制限することにより、腎臓の一次防御に重要であるようです。 同様に、CD169プラスTRMの欠如は、好中球および腎IFNにおけるROS産生の明確な減少をもたらしました。 真菌の増殖とIFN産生の制御における腎CD169プラスTRMの機能のメカニズムを理解するために、さらなる調査が必要です。
私たちのデータは、腎臓がC. albicansが存続する主要な標的器官であることを示しており、これは、実験的播種性カンジダ症およびその後のマウス死亡率における腎免疫の重要性を示す以前の報告と一致しています（Spellberg
et al、2003; MacCallum＆Odds、2005; Lionakis et al、2011; Navarathna et al、2012、2019; Hebecker et al、2016）。 特に、CD 169- DTRマウスのすべての末梢臓器でTRMが除去されたにもかかわらず、C。Albicansが持続する唯一の臓器として腎臓が残ったため、全身性カンジダ免疫における腎臓TRMの特徴的な役割が浮き彫りになりました。 腎臓が主要な標的臓器であるが、ヒトの対応物に一貫して反映されていない可能性があるが、免疫不全患者で重篤な腎カンジダ感染が観察されているため、腎免疫はこの感染に対する宿主抵抗性の不可欠な部分であると依然として考えられている（Lionakis、2014; Xu＆Shinohara、2017）。 腎臓での制御されていないカンジダ・アルビカンスの成長は、以前は、先天性骨髄細胞の動員が遅いか遅れていることに起因すると考えられていました（Lionakis et al、2011）。 しかし、私たちの感染モデルでは、WTマウスの腎臓における免疫細胞の機能的浸潤を観察しました。 さらに、感染したWT腎臓のCXCL1とCCL2は、感染後12時間で検出可能であると説明されており、先天性骨髄細胞の迅速な動員をサポートしています（MacCallum et al、2009）。 免疫細胞の動員は、マクロファージ、DC、上皮細胞、および内皮細胞によって調節されることも報告されています（Netea et al、2002; Tuite et al、2004; Tran et al、2015）。 具体的には、マクロファージは、CXCL2発現を介して感染の初期段階で好中球を動員することが示されています（Kanayama et al、2015; Xu＆Shinohara、2017）。 それにもかかわらず、CD 169- DTRマウスは、WTマウスと同様の腎臓への細胞動員を示し、細胞浸潤のオーケストレーションがCD169 plus+TRMによって開始または支援されないことを示唆しています。
最近、Karasawa et al（2015）は、CD169を発現する血管系に存在する腎Ly6Clo単球の小さなサブセットを報告し（Karasawa et al、2015）、CD169とマクロファージとともに、腎虚血における過剰な炎症の予防に重要な役割を果たしています。再灌流傷害。 血管関連TRMは、腸（Honda et al、2020）や脂肪組織（Silva et al、2019）などの他の臓器でも説明されており、血管の緊張と完全性をサポートしています（未発表のデータ）。 したがって、血管関連単球/ TRMは、腎臓で同様の役割を果たし、全身性カンジダ症の進行に寄与する可能性があります。 腎マクロファージの理解は、これらの単核食細胞を描写するための利用可能なツールと表現型マーカーがないために制限されています（Gottschalk＆Kurts、2015; Kurts et al、2020）。 系統追跡および転写研究を通じて腎マクロファージを理解しようとする試み（Hochheiser et al、2013; Cao et al、2015; Munoz et al、2019; Liu et al、2020; Salei et al、2020）にもかかわらず、感染症の状況における腎TRMサブセットの機能で知られています。 腎マクロファージは、カンジダ・アルビカンスの成長と尿細管への浸潤を直接制限できることが以前に示されていますが、我々のデータは、CD169プラスとTRMサブセットがこれらの初期保護メカニズムに関与していないことを示唆しています（Marcil et al、2002; Lionakis et al、2013; Munoz et al、2019）。 代わりに、CX3CR1gfp / gfpマウスからのデータは、CD169とTRMサブセットが、C。Albicansの攻撃に対する初期の腎防御を提供するための主要なエフェクター集団であることを示唆しています。
好中球はカンジダ免疫に不可欠な先天性エフェクター細胞であり（Fulurija et al、1996; Aratani et al、1999; Netea et al、2015）、好中球減少症および好中球欠損症に苦しむ患者は侵襲性カンジダ症のリスクが高くなります（Lionakis＆Netea、 2013）。 酸化的殺傷エフェクター経路の重要性は、慢性肉芽腫症およびミエロペルオキシダーゼ欠損症であり、ROS産生が好中球で欠陥があり、患者とマウスの両方でカンジダ・アルビカンスの殺傷を損なうという発見によって強調されています（Aratani et al、1999、2002、Lehrer＆クライン、1969）。 それに対応して、ROSと好中球の有意な減少をもたらしたCD169とTRMの欠如、そして驚くべきことに単球ではないことは、腎C.アルビカンスの制御されていない成長が好中球の真菌殺傷能力の低下による可能性が高いことを示唆しています
CISTANCHEは腎臓/腎臓の痛みを改善します
全身性カンジダ症におけるIFNの重要性は、実験的マウスモデルでよく示されています。ノックアウトマウスのIFN欠損は、この感染症に対する感受性を高めます（Balish et al、1998; Cenci et al、1998; Kaposzta et al、1998）。 さらに、IFNの投与は、好中球およびマクロファージの食作用および真菌の殺傷能力を高め、それにより、侵襲性カンジダ症に対する患者の耐性が向上することが実証されています（Djeu et al、1986; Malmvall＆Follin、1993; Marodi et al、1993 ）。 私たちのTRM枯渇マウスモデルでは、CD169プラスTRMの非存在下で腎IFNのダウンレギュレーションを一貫して観察しました。これは、IFN発現の開始または維持にCD169プラスTRMが関与していることを示唆しています。 播種性カンジダ症におけるIFNの保護的役割は明らかですが、このモデルにおけるIL 17-を介した保護反応は、ほとんど議論の余地があります（Balish et al、1998; Lavigne et al、1998; MacCallum、2009; Kashem et al、2015 ; Mengesha＆Conti、2017）。 それにもかかわらず、IL 17-を介した免疫は、口腔および皮膚のカンジダ症に不可欠であることが知られています（Conti＆Gaffen、2010; Netea et al、2015; Mengesha＆Conti、2017）。 私たちのモデルでは、CD169プラスTRMの除去はIL17発現レベルに影響を与えませんでした。 実際、感染したWT腎臓ではIL17の発現はあまり観察されませんでした（データは示していません）。 私たちの観察と同様に、LeibundGut-Landmann et al（2007）は、感染したWTマウスでIL17よりも有意に多い量のIFNを報告し（LeibundGut-Landmann et al、2007）、IFNを介した免疫が全身性カンジダ症でより顕著であることを示しています。 カンジダ免疫におけるIFNの有益な役割を裏付ける別の研究は、全身性カンジダ症に対する、IL 17-産生Th17細胞ではなく、IFN産生Th1細胞の養子移入によって誘発された保護でした（Kashem et al、2015）。
CD169 plusとTRM、IFN、および好中球の間の興味深い相関関係を解明するための最初のステップとして、私たちのパイロット実験では、モデル内のIFNの細胞源を明らかにしようとしました。 初期のIFN-産生細胞であるNK細胞は、C。Albicansを認識し、IFNおよびGM-CSFの分泌を通じて好中球の真菌殺傷を増強できることが示されています（Bhatnagar et al、2010; Bar et al、2014; Voigt et al al、2014; Whitney et al、2014; Dom´ınguez-Andres et al、2017´）。 さらに、NK細胞の5〜10％がカンジダに感染した腎臓でIFNを産生することが示されています（Whitney et al、2014）。 驚いたことに、モデルにNK細胞が存在しない場合、IFNとNK細胞の併用は観察されず、IFNのダウンレギュレーションも観察されませんでした。 この観察された不一致は、異なる時点でのIFN産生細胞の評価に起因する可能性があります。 具体的には、ホイットニーのグループと比較してはるかに遅い時点である6 pi、つまり16 h piでIFN産生を評価しました。したがって、NK細胞はこの感染のIFN産生の維持に関与していない可能性があります。 興味深いことに、Murciano et alは、殺されたC. Albicans酵母がNK細胞によるIFN放出を阻害することを報告しました（Murciano et al、2006）。 不一致のもう1つの考えられる理由は、IFN分泌を調査するために使用される実験方法である可能性があります。 この記事では、タンパク質分泌阻害剤であるモネシンをマウスに直接投与し、その後、exvivoでの細胞インキュベーションなしで細胞のIFN産生を評価しました。 一方、Whitney et al（2014）による研究では、IFN以前
分析では、腎細胞を最初に調製し、タンパク質分泌阻害剤とともに培養で7時間インキュベートしました（Whitney et al、2014）。 驚くべきことに、私たちの研究で調査された他のリンパ球および骨髄組織のサブセット、特にCD169 plus plus TRMも、マクロファージによるIFNの直接分泌を報告している研究にもかかわらず、IFNを発現していないようです（Bogdan＆Schleicher、2006）。 代わりに、私たちのデータは、主要なIFNプロデューサーがB様細胞集団に制限されていることを示唆しています。 興味深いことに、IFNを産生する先天性B細胞の同様の亜集団は、細胞内細菌感染の初期の先天性免疫応答を調節および開始するのに不可欠であると報告されています（Bao et al、2014; Krocova et al、2020）。 さらに、他の以前の研究では、成熟B細胞は、T細胞によってプライミングされ、病原体またはTLRリガンドによって刺激されると、IFNを分泌できることが明らかになりました（Gray et al、2007; Lund＆Randall、2010）。 微生物感染症におけるB細胞-IFN軸は珍しいことではありませんが、この腎臓のIFNとB細胞のような集団を包括的にプロファイリングし、腎臓におけるCD169とTRMとの関係を特定するための将来の研究が緊急に必要です。 要約すると、腎TRMは、CD169の発現に基づいて2つの主要な集団に細分類できると結論付けています。 さらに重要なことに、これらの2つのサブセットは、播種性カンジダ症における非冗長な保護機能を備えており、C。アルビカンスに対する保護宿主の自然免疫の細胞基盤への洞察を提供します。 これらの啓示は、治療的介入の将来の設計に役立つはずです。
材料および方法
マウスCD 169- DTRトランスジェニックマウスは、以前に説明されているように（Purnama et al、2014）、BALB / cの遺伝的背景で私たちの研究室で生成され、その後、C57BL/6と10世代交配されました。 CX3CR1gfp/gfpマウスはジャクソン研究所から購入しました。 CD 169- DTR C57BL / 6トランスジェニックマウスは、WT C57BL / 6とともに、南洋理工大学（NTU）の動物施設で特定病原体除去条件下で飼育および維持されました。 オスのマウス（7〜10週齢）をカンジダ感染症に使用しました。 すべての実験は、ARF-SBS / NIE A-0380AZの番号で施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
カンジダ・アルビカンス感染症臨床分離株C.Albicans株SC5314を、酵母エキス-ペプトン-デキストロース（YPD）プレート上で30度で24時間培養した後、YPD培地で16〜18時間培養しました。 カンジダ・アルビカンス懸濁液を遠心分離し、洗浄し、カウントした。 感染のために、5×104cfuのC.albicansを各マウスに静脈内注射しました。 rIFN治療では、感染したマウスを毎日10、000 U組換えIFN（R＆D Systems）で治療しました。 感染の過程の間、マウスを毎日モニターし、体重を測定した。 ジフテリア毒素媒介および抗体媒介アブレーションDT（10 ng / g体重）は、1％マウス血清を添加したPBSで調製しました。 CD 169- DTRおよびWTマウスには、感染スキームに従ってDTをipで投与しました（図S1）。
NK細胞を枯渇させるために、マウスに100 ugの抗マウスNK1.1（PK136; Invivomab）抗体を毎日腹腔内投与しました。
真菌負荷分析脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、および脾臓を、示された感染時点で採取し、秤量し、細かく切り刻んだ後、消化培地中の1 mg/mlコラゲナーゼDと37度で1時間インキュベートしました。 目に見える凝集物がなくなるまで、サンプルを繰り返し再懸濁しました。 連続希釈を行い、YPDプレートにプレーティングしました。 プレートを30度で48時間インキュベートした。 CFUは、コロニーを手動でカウントすることによって決定されました。 真菌負荷は、臓器1グラムあたりのCFUとして表されました。
組織の収集、処理、および単一細胞懸濁液の分離腎臓を採取し、細かく切り刻み、消化培地中の1 mg/mlコラゲナーゼDとともに37度で1時間インキュベートしました。 細かく刻んだ腎臓を、目に見える凝集物がなくなるまで繰り返しピペットで上下させた。 330gで5分間遠心分離した後、細胞ペレットを5 mlの35％Percoll（GE Healthcare Life Science）で再懸濁し、600gで15分間遠心分離しました。 上清を廃棄し、細胞ペレットを5-mlのRBC溶解緩衝液で再懸濁しました。 溶解後、細胞懸濁液を遠心分離し、IMDM 2％で再懸濁しました。 単細胞懸濁液は、さらに使用するまで4度で保存しました。 細胞をカウントするために、トリパンブルーと事前に混合した細胞懸濁液の少量のアリコートを血球計算盤を使用してカウントしました。 細胞選別のために、腎臓単細胞懸濁液をラット抗マウスCD16 / 32（2.4G2、1 mg / ml）とインキュベートし、続いて表面抗原マウスCD45（30F11）、F4 / 80（BM8）に対するFL蛍光抗体をインキュベートしました。およびCD11b（M1 / 70）。 染色した細胞を1回洗浄し、40-μmフィルターに通してから、4-レーザーBD FACSAria IIセルソーター（BD Bioscience）で選別しました。
フローサイトメトリー分析単細胞懸濁液をラット抗マウスCD16/32（2.4G2、1 mg / ml）と4度で15分間（1：1 0 0）FACSバッファー中でインキュベートしました。 （2パーセントのFCSを補充したPBS）Fc受容体をブロックします。 表面抗原を染色するために、細胞をマウスCD45（30F11）、F4 / 80（BM8）、CD11b（M1 / 70）、Ly6G（1A8）、およびLy6C（HK1.4）に対する蛍光色素標識抗体と4℃でインキュベートしました。 20分の程度。 染色した細胞を1回洗浄し、FACSバッファーに再懸濁して、5レーザーBD LSRFortesssa X -20（BD Biosciences）で取得しました。 細胞内サイトカインIFNを検出するために、プロトコルに従ってタンパク質分泌ブロッカーモネンシンで処理したマウスから腎臓単細胞懸濁液を調製しました（Sun et al、2009）。 簡単に説明すると、各マウスに100ugのモネンシン（M5273; Sigma-Aldrich）を含む250 ulのPBSを静脈内注射し、臓器を分離して腎臓の単細胞懸濁液を調製する5時間前に注射しました。 細胞をラット抗マウスCD16/32抗体とインキュベートした後、表面抗原マウスCD45（30F11）、CD11b（M1 / 70）、F4 / 80（BM8）、Ly6G（1A8）、Ly6C（HK1 .4）、CD3ε（145-2 C11）、CD49b（HMa2）、CD19（1D3）、CD4（GK1.5）、CD8（53.6–7）、CD11c（N418）、MHCII（M5 / 114.15.2 ）、およびlgκ軽鎖（RMK -45）。 染色した細胞をFACSバッファーで1回洗浄した後、固定（2％PFA）および透過処理（0.05％サポニン）を行った後、0.05％サポニン溶液中で抗IFN抗体（1：500; BioLegend）とインキュベートしました。 染色した細胞を1回洗浄し、FACSバッファーに再懸濁して、5レーザーBD LSRFortesssa X -20（BD Bioscience）で取得しました。 細胞死とアポトーシスを検出するために、腎臓の単細胞懸濁液を最初にラット抗マウスCD16 / 32抗体とインキュベートし、続いて表面抗原マウスCD45（30F11）、CD49b（HMa2）、CD3εに対する蛍光抗体で染色しました（{{101 }} C11）、CD11b（M1 / 70）、Ly6G（1A8）、およびLy6C（HK1.4）。 染色した細胞をFACSバッファーと1xアネキシンV結合バッファー（BioLegend）で1回洗浄した後、製造元の指示（BioLegend）に従ってFITC結合アネキシンVとインキュベートしました。 染色した細胞を1回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（PI、1 ug / ml）を含む1×アネキシンVバッファーに再懸濁してから、5レーザーBD LSRFortessa X -20（BD Bioscience）で取得しました。
ROS検出アッセイ単細胞懸濁液を洗浄し、2.5 ug / ml H2DFFDAとともに、100 ug / mlザイモサンの有無にかかわらず、4度または37度で60分間インキュベートしました。 次に、細胞をＩＭＤＭ ２パーセントで２回洗浄し、蛍光色素標識抗体で４度で２０分間染色した。 染色した細胞を洗浄し、PIを含むFACSバッファーに再懸濁して、5レーザーBD LSRFortessa X -20（BD Bioscience）で取得しました。 データは、4度でインキュベートされた対応する細胞に基づいて正規化されました。
セラム・クレアチン血液血清は、10日目にマウスから収集されました。血清クレアチニンレベルは、製造元の指示に従って、マウスCr（クレアチニン）ELISAキット（Elabscience）を使用して定量化されました。
エバンスブルーアッセイ血管透過性は、Radu and Chernoff（2 0 13）に従って評価されました。 簡単に説明すると、感染していないWTおよびCD 169- DTRマウスに、2 00ulの0.5パーセントエバンスブルー/PBSを静脈内注射しました。 30分後、マウスを安楽死させ、臓器を収集し、重さを量り、マイクロフュージチューブ内の100％ホルムアミド中で48時間インキュベートしました。 エバンスブルーを注入したホルムアミド（0.5 ml）を、組織片を移さずに使い捨てのポリスチレンキュベットに移しました。 610 nmでの吸光度を記録し、これらの値を臓器の重量で正規化しました。
組織学的分析免疫蛍光染色のために、採取した腎臓を最適切断温度化合物（OCT Tissue Tek）に包埋し、-80度で保存しました。 6- µmの切片を切り取り、アセトンで10〜15分間固定しました。 切片をFc-blockで20分間インキュベートし、洗浄し、FL蛍光抗体で1時間インキュベートしました。 次に、洗浄した切片をDAKOFL蛍光封入剤で封入しました。 画像は、NikonEclipse80i顕微鏡を使用して20倍の対物レンズ倍率で取得しました。 H＆EおよびPAS染色では、カリングされたマウスを4％PFA（Sigma-Aldrich）で灌流しました。 採取した腎臓を4％PFAでRTで24時間インキュベートし、脱水し、パラフィン（Paraplast Plus; Leica）に包埋しました。 次に、パラフィン包埋ブロックを6-μmセクションに切断しました。 切片をキシレンで20分間脱パラフィンし、再水和しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色では、切片を修正メイヤー溶液ヘマトキシリン（Abcam）で染色し、エオシン（Sigma-Aldrich）で対比染色しました。 キシレンで除去した後、切片をDPX Mountant（SigmaAldrich）でマウントしました。 PAS染色では、切片を過ヨウ素酸溶液（Abcam）でインキュベートし、洗浄し、Schiff溶液（Abcam）で染色しました。 この後、切片を修正メイヤー溶液ヘマトキシリン（アブカム）で対比染色した。 キシレンで除去した後、切片をDPX封入剤（Sigma-Aldrich）で封入しました。 画像は、Eclipse 80i顕微鏡（Nikon）とDigital Sight DS-U3（Nikon）およびNIS-Elements Dソフトウェア（Nikon）を使用して、4倍、10倍、20倍、および100倍の倍率で取得しました。
定量的リアルタイムPCR採取した腎臓は、ホモジナイザー（CAT X360）を使用してTRIzol（Thermo Fisher Scientific）で直ちにホモジナイズしました。 製造元の指示に従ってRNAを抽出しました（RNAsimpleTotalRNAキット;TiangenBiotech Ltd）。 精製されたRNAからの一本鎖cDNA合成は、製造元の指示（Promega M-MLV逆転写酵素）に従って実行されました。 Primerdesign Precision FASTプロトコル（Primerdesign Ltd）を使用して、製造元の指示に従ってリアルタイムPCRを実行しました。 プライマー配列は次のとおりです。 Fwd：ACTGCACCCAAACCGAAGTC、Rev：TGGGGACACCTTTTAGCATCTT。 CXCL2; Fwd：ACAGAAGTCATAGCCACTCTC、Rev：CCTTGCCTTTGTTCAGTATC。 CCL2; Fwd：CATCCACGTGTTGGCTCA、Rev：GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT。 TNF-; Fwd：TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG、Rev：GGTCTGGGCCATAGAACTGA。 G-CSF; Fwd：GTGCTGCTGGAGCAGTTGT、Rev：TCGGGATCCCCAGAGAGT。 GM-CSF; Fwd：GCATGTAGAGGCCATCAAAGA、Rev：CGGGTCTGCACACATGTTA。 M-CSF; Fwd：GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG、Rev：TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA。 IL10; Fwd：CAGAGCCACATGCTCCTAGA、Rev：TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT。 ICAM -1; Fwd：AGTCCGCTGTGCTTTGAG、Rev：AGGTCTCAGCTCCACACT。 VCAM -1; Fwd：TCTTACCTGTGCGCTGTGAC、Rev：ACTGGATCTTCAGGGAATGAGT。 KIM -1; Fwd：AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG、Rev：TGATAGCCACGGTGCTCA。 CD169; Fwd：GCTGATACTGGCTTCTACTTCT、Rev：AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA。 IFN-; Fwd：CACGGCACAGTCATTGAAAG、Rev：CCAGTTCCTCCAGATATCCAAG。 -アクチン; Fwd：AAGGCCAACCGTGAAAAGAT、Rev：CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA。 hHB-EGF; Fwd：ATGACCACACAACCATCCTG、Rev：CCAGCAGACAGACAG ATGACA