Wen-Lan Li、Jing-Xin Ding、Jing Bai、Yang Hu、Hui Song、Xiang-Ming Sun、Yu-Bin Ji

連絡先：ジョアンナ。jia@wecistanche.com

概要

LCテクノロジーは、伝統的な漢方薬（TCM）の品質を評価するために世界中で使用されている認識された方法です。 TCMの品質は、その有効性に直接影響します。 したがって、TCMがどのように有効性を発揮するかを徹底的に明らかにするには、まず、その有効性の物質的根拠を理解し、次に活性化合物の品質を管理する必要があります。 スペクトル効果関係法の適用は、薬理学的材料の基礎を決定するために重要です。 この論文の目的は、化学プロファイルとエストロゲン活性との間の根本的な相関関係を調査することでした。Cistanche、活性化合物を明らかにする。 の化学的プロファイルCistancheはHPLC/Q-TOF-MS / MSを使用して記録され、エストロゲン活性は子宮成長試験とMTTアッセイによって決定されました。 次に、二変量解析、主成分分析、および灰色相関分析法の結果を組み合わせて、15の活性化合物を同定しました。 それらは8-エピロガン酸、サリドロシド、シリンガリドA 3'- - l-ラムノピラノシド、シスタノシドA、エキナコシド、シスタノシドF、シスタノシドB、シスタノシドC、オスマンツシドB、アクテオシド、イソアクテオシド、ツブロシドB、2'-アセチルアクテオシド、および2つの未知の化合物。 この研究は、Cistanche、およびその臨床応用の開発のため。

Cistancheはエストロゲンを高めることができます。詳細についてはここをクリックしてください

キーワード：Cistancheニクジュヨウ; LC / Q-TOF-MS; エストロゲン活性; 主成分分析（PCA）; 子宮の成長テスト。

略語

TCM：漢方薬

HPLC / Q-TOF-MS：高速液体クロマトグラフィー/四重極飛行時間型質量分析

BA：二変量解析

PCA：主成分分析

GCAM：グレー相関分析法

MTT：トリプシン、3-（4、5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

DMSO：ジメチルスルホキシド

RPMI1640ロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640

1はじめに

最近、TCMは、その安定した治療効果と診療所での低毒性により、アジアおよび西欧諸国でますます人気が高まっています。 その結果、新しいタイプのTCMを開発し、それらの臨床応用中に使用される効果的な組成物を理解する必要があります[1-6]。

まず、スペクトルと効果の関係を調べて、クロマトグラフィーのフィンガープリントと薬力学の有効性との相関関係を識別します。 次に、この関係を使用して、TCMで効果的なコンポーネントを探し、それらの内部品質を反映するように管理基準を策定します。 スペクトル効果の関係は、単一および複合TCMの材料基盤、コンポーネントの互換性、処理メカニズム、薬理効果の予測、技術の最適化など、TCM研究の多くの分野に適用されています[7-12]。 スペクトル効果の関係は、有効成分の探索、処方の最適化、調製プロセスの改善、標的成分の追跡と分離、および新しいTCM薬の開発のための新しいアイデアと方法を提案するために使用されます[13-17]。

Cistanche性機能障害、便秘、前立腺炎、および腎臓欠乏症の治療に広く使用されています。 エストロゲン作用、老化防止、酸化防止、免疫作用など、幅広い生物活性があります[18-19]。 一般に、フェニルエタノイド配糖体（シスタノシドA、ツブロシドAなど）、リグナン、およびイリドイド配糖体は、Cistancheおよびその製品の品質管理のための薬理学的成分および化学的マーカーと見なされていました[20-21]。 の化学スペクトルCistancheさまざまな地域からの高速液体クロマトグラフィー（HPLC）[22-23]を使用して記録されました。 この研究では、子宮成長試験とMCF7細胞増殖アッセイを選択して、それらのエストロゲン活性を評価します。 主成分分析、二変量解析、および灰色相関分析法を使用して、エストロゲン活性を個々の成分と相関させました。 この研究は、invivoでのエストロゲン作用の原因となるCistancheの生物活性化合物を特定することを目的としています。 この研究は、Cistanche.

すべての実験手順は、ハルビン商工大学の動物倫理委員会によってレビューされ、承認されました。

Cistancheニクジュヨウ（cd -20120227-005）は麻薬市場から購入され、Zhang Delian教授（ハルビン商工大学）によって特定されました。 ジエチルスチルベストロールは合肥ジュリアン製薬株式会社から購入しました。 フェノールレッドを含まないRPMI1640およびRPMI1640は、HyClone Company（USA）から購入しました。 MTTとDMSOはすべてSigma-AldrichCo.LLC（セントルイス、米国）から購入しました。 ヒト乳がんMCF7細胞株は、生命科学および環境科学研究センター（ハービン商工大学）から提供されました。 使用した標準は次のとおりです。アクテオシド（111530- 200505）、エキナコシド（111670-200503）、およびサリドロシド（110736-200628）は、国立医薬品生物製品管理研究所（北京）から入手しました。 、 中国）。 アセトニトリル、メタノール、ギ酸はMSグレードでしたが、水は超高純度でした。 他の試薬は分析グレードであり、市販されていました。

エキナコシドのCistancheカンカニクジュヨウには多くの効果があります

2実験手順

2.1材料

分析化学実験とデータ処理には、Agilent 1290 HPLCシステム、Agilent6530シリーズ四重極飛行時間型LC/ MS（Q-TOF）システム、および化学HPLC-3Dワークステーションを使用しました。 サンプルと標準の調製には、Milli-Q超純水を使用しました。 追加の機器には、電子分析天びんAR1140（Ohaus International Ltd）、680マイクロプレートリーダー（Bio-Rad Corporation）、および64R高速遠心分離機（Beckman Coulter Allegra）が含まれていました。

体重（12±2）gの未成熟雌昆明マウス（出生約21日、離乳）は、長春国立生物産業基地実験動物センター（中国、長春）から購入しました。 マウスは、食物と水への無制限のアクセスを備えた温度調節された部屋（22±2度）に収容された。 動物実験は、5日間の順化後に開始されました。 試験溶液を投与する前に、水を自由に摂取できる状態でマウスを一晩絶食させた。 この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施されました。

2.2サンプル溶液の調製

ホンオニクのサンプルは、内モンゴル、新疆ウイグル自治区、寧夏回族自治区、貴州省、チャイダム、チベット、アラシャン、青海、四川、湖北省の10の多様な生息地から収集されました。

Cistancheサンプルの溶液（1. 0 g / mL）は、経口投与用に蒸留水で調製しました。 ジエチルスチルベストロールの濃度は20ug / mLであり、陽性対照溶液として使用されました。 Cistancheサンプルの溶液（1。0 g / mL）は、50パーセントのアセトニトリルで調製しました。 アクテオシド、エキナコシド、サリドロシド（それぞれ2.0 mg）を10 mLの50％アセトニトリル溶液に溶解しました。 分析前に、サンプル溶液と標準溶液の両方を0。45-μmフィルターを使用してろ過しました。

2.3LC-MS条件

Waters Symmetry Shield RP18（3.9mm×150 mm、5μm; Waters Corporation、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を使用してサンプルを分析しました。 移動相は、アセトニトリル（A）と0。2パーセント（v / v）ギ酸水溶液（B）で構成され、0.5 mL/minの流速で送液されました。 各サンプルの注入量は10μLでした。 グラジエント溶出プログラムは次のとおりです。移動相Aは5％で開始され、35分で23％まで直線的に増加しました。 その後、ソリューションAを25％に増やしました（35〜65分）。 その後、移動相Aは、分析の最後の5分間（65〜70分）で5％に減少しました。 カラム温度は30度に維持されました。 クロマトグラムは254nmでモニターしました。 噴霧ガス圧は30psi、キャピラリー電圧は3.5kVでした。 乾燥ガスの流量は、30度の温度で8L/分に設定されました。 質量スペクトルは、100- 3、000 Daのスキャン範囲内で記録され、負イオンスキャンモードでした。

2.4指紋評価

10の異なるバッチから収集されたサンプルのLCフィンガープリントが確立され、TCMのクロマトグラフィーフィンガープリントの類似性評価システム（バージョン2012;中国薬局方委員会、北京、中国）を使用して自動的に照合されました。 さらに、参照クロマトグラムマップは中央値法を使用して生成されました。 さらに、クラスター分析を適用して、10の多様な生息地からのサンプルの品質を評価しました。

2.5主成分分析（PCA）

PCAは、多変量統計手法です。 データ取得からの十分な情報を保持できます。 本研究では、LCクロマトグラムの特徴的なピークをPCAでさらにスクリーニングし、スペクトルと効果の関係に基づいて活性化合物を特定することを目的としました。

2.6子宮成長試験

マウスを12のグループに分けた（グループあたり1 0）。 Cistancheから調製されたサンプル溶液は、10の多様な生息地から収集され、1日2回（朝と夕方）、30 g/kg体重の用量で4日間強制経口投与されました。 ブランクおよび陽性対照群は、等量の蒸留水およびジエチルスチルベストロール溶液を含み、1日2回4日間投与された。 ５日目に、薬物を含む血液サンプルを麻酔したマウスから採取した。 サンプルを遠心分離し（5、000 rpm、10分）、上清（薬物含有血清サンプル）を分離しました。 薬物含有血清サンプルは、水浴中で56度で30分間加熱することにより不活化され、MTTアッセイの前に0。22-μmフィルターでろ過されました。 付随して、マウスの子宮を直ちに切除し、体重を測定して、子宮重量指数を計算した。 動物実験は、5日間の順化後に開始されました。 試験溶液を投与する前に、マウスを一晩絶食させ、水を自由に摂取させた。 本研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施されました。 すべての実験手順は、ハルビン商工大学の動物倫理委員会によってレビューされ、承認されました。 すべての潜在的にストレスの多い手順は、ペントバルビタールナトリウム麻酔下で実施されました。

2.7MTTアッセイ

MCF7細胞をフェノールレッドを含まないRPMI1640（5％CDT-FBSを含む）と4日間共培養しました。 細胞を96-ウェルプレートに2、000細胞/ウェルの密度で播種しました。 付着培養が達成され、72時間の培養後、細胞は、Cistancheで処理されたマウスからの血清サンプルを含むRPMI1640培地で共培養された。 実験は6回繰り返して行った。 続いて、20μLのMTT溶液（PBS中5 mg / mL）を各ウェルに添加し、細胞を4時間インキュベートしました。 培地を除去した後、150 µLのDMSOを添加してホルマザン生成物を生成し、プレートを暗所で振とうして完全に溶解させました。 マイクロプレートリーダーを使用して、570nmで吸光度を測定しました。 増殖速度は、薬物含有血清群の平均吸光度値をブランク対照群（血清なしでRPMI 1640で共培養された細胞）の平均吸光度値で割ったものとして計算された。

2.8統計分析

対応のあるサンプルのt検定（両側検定）を使用して、ブランクコントロールグループと実験グループの値の間の統計的に有意な差を特定しました。 差は95％の信頼水準で有意であると見なされました（p <>

PCAを使用して、10の多様な生息地からのサンプルのクロマトグラムの特徴的なピーク面積を評価しました。 二変量解析とグレイ相関分析を使用して、ピーク面積とそれらのエストロゲン活性の相関を評価しました。 相関は、SPSS Statisticsソフトウェア統計（SPSS for Windows 21. 0、SPSS Inc.、米国）によって計算されました。 差は、95％の信頼水準（両側）で有意であると見なされました。

倫理的承認：実施された研究は、人間または動物の使用とは関係ありません。

cistancheacteosideには多くの機能があります

3。結果と考察

3.1クラスター分析と類似性評価

特徴的なピークのリテンションタイムとピーク面積の相対標準偏差は、精度が{{0}}。58および0。34パーセント、0。52および{{8}でした。再現性については}.31パーセント、安定性についてはそれぞれ{{10}}。19および0。13パーセント。 これらの調査結果は、指紋認証のLCメソッドが合理的で信頼できることを示しています。 10個のサンプルのクロマトグラムの類似性は0.9より大きかった。 すべてのサンプルに共通するピークは、ピークが失われた可能性があるため、Cistancheの特徴的な構成要素を完全に表すことはできませんでした。 したがって、より正確なクロマトグラムマップを取得するために、サンプルマッチング数を26から20に調整しました。 合計26のピークが得られ、それらの面積の合計は、サンプルの全体的なピーク面積のピークと比較して0.8を超えていました。 したがって、これらのクロマトグラフィーのピークは、Cistancheの主要な化学成分を効果的に反映している可能性があると結論付けました。 クラスター分析の結果を図1に示します。合計10の多様な生息地が、次の3つのカテゴリーに分類されました。 3、青海; 4、チャイダム; 10、Neimeng; 7、新疆ウイグル自治区と6、四川省。 （B）1、Xizang; 8、寧夏回族自治区と5、アラシャン。 （C）9、湖北。 クラスター分析の傾向は、薬草の生息地がしきい値の下限にあるときに類似していることを示しました。 しかし、しきい値の増加に伴い、生息地の気候と成長条件は近くなっています。 これは、クラスター分析が多様な生息地をうまく区別できるだけでなく、それらの間の親和性も反映できることを示しています。

3.2化学成分の特定

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0。8）。 固有負荷の絶対値が高いほど、エストロゲン指数に対する化合物の影響が大きくなります。

Cistancheと標準サンプルのクロマトグラムを比較して、同じLC-MS条件下で個々の成分を特定しました。 表1に示すように、リテンションタイムとMSデータ[24-26]に基づいて、合計26の成分が同定されました。 伝統的な漢方薬は治療的役割を果たすために混合物の形であるため、有効成分はモノマーではなく混合物の形で経口投与されます。 個別に分離された後の単一の化合物は、役割を果たすことがわかりませんでした。 私たちの目標は、Cistanche [23-30]の既知の成分にエストロゲン活性を有する化合物を明らかにすることであり、したがって、それらの同一性を検証するためにNMRおよびその他の技術的手段を選択しませんでした。 ピーク1は、m / z比が373（C16H22O10）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、ゲニポシド酸の元素組成と同じです。 これは、m / z比が211のフラグメントイオンを生成するグルコース部分の損失によってサポートされました。ピーク2は、m / z比が461（C20H30O12）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは元素組成と同じです。デカフェオイルアクテオシドの8-エピロガン酸の元素組成。 ２１３のｍ ／ ｚ比で断片化を形成したグルコース部分の喪失は、推論をさらに支持した。 ピーク6は、m / z比が607（C29H36O14）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、シリンガリドA3'- -l-ラムノピラノシドの元素組成と同じです。

カフ部分の喪失は、445のm / z比でフラグメントイオンを形成し、推論をさらに支持しました。 ピーク8は、m / z比が799の主要な脱プロトン化イオン（C36H48O20）を示しました。これは、シスタノシドAの元素組成と同じです。カフ部分が失われると、m/z比が637のフラグメントイオンが形成されます。さらに推論をサポートしました。 ピーク11は、m / z比が487（C21H28O13）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、シスタノシドFの元素組成と同じです。これは、m/zのフラグメントイオンを生成するラムノシル部分の損失によってサポートされました。比341、および別のカフ部分の喪失により、m / z比179のフラグメントイオンが形成され、推論がさらに裏付けられました。 ピーク12は、m / z比が813（C37H50O20）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、シスタノシドBの元素組成と同じです。グルコース部分が失われると、m/z比が651のフラグメントイオンが形成されます。さらに推論をサポートしました。 ピーク13は、m / z比が827（C37H48O21）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、チューブロシドAの元素組成と同じです。ラムノシル部分が失われると、m/z比が681のフラグメンテーションが形成されます。推論をサポートしました。 ピーク14は、m / z比が637（C30H38O15）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、シスタノシドCの元素組成と同じです。ラムノシル部分が失われると、m/z比が491のフラグメントイオンが形成されます。さらに推論をサポートしました。

ピーク15は、m / z比が591（C29H36O13）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、オスマンツシドBの元素組成と同じです。ラムノシル部分が失われると、m/z比が445のフラグメントイオンが形成されます。さらに推論をサポートしました。 ピーク16は、m / z比が623（C29H36O15）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、アクテオシドの元素組成と同じです。 カフ部分が失われると、m/z比が461のフラグメントイオンが形成されます。さらに推論をサポートしました。 ピーク18は、m / z比が623（C29H36O15）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、イソアクテオシドの元素組成と同じです。 カフ部分の喪失、最前線15は、オスマンツシドBの元素組成と同一の591（C29H36O13）のm / z比を持つ主要な脱プロトン化イオンを示しました。ラムノシル部分の喪失により、m/z比が445のフラグメントイオンが形成されました。推論をサポートしました。 ピーク16は、m / z比が623（C29H36O15）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、アクテオシドの元素組成と同じです。 カフ部分の喪失は、461のm / z比でフラグメントイオンを形成し、推論をさらに支持しました。 ピーク17は、m / z比が623（C29H36O15）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、cis-アクテオシドの元素組成と同じです。 カフ部分の喪失は、フラグメントioを形成しましたm / z比が461のdaフラグメントイオンは、推論をさらにサポートしました。 ピーク21は、m / z比が653（C30H38O16）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、カンプネオシドⅠの元素組成と同じです。

カフ部分の喪失は、491のm / z比のフラグメントイオンを形成し、別のラムノシル部分の喪失は、345のm / z比のフラグメントイオンを形成し、推論をさらに支持しました。 ピーク22は、m / z比が665（C31H38O16）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、チューブロシドBの元素組成と同じです。CH3CO部分が失われると、m/z比が623のフラグメントイオンが形成されます。また、別のカフ部分が失われると、m / z比が461のフラグメントイオンが形成され、推論がさらにサポートされます。 ピーク23は、m / z比が639（C29H36O16）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、カンプネオシドの元素組成と同じです。 ラムノシル部分の喪失は、m / z比が493のフラグメントイオンを形成し、推論をさらに裏付けました。 ピーク24は、m / z比が665（C31H38O16）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、2'-アセチルアクテオシドの元素組成と同じです。 Ac部分が失われると、m / z比が623のフラグメントイオンが形成され、別のカフ部分が失われると、m / z比が461のフラグメントイオンが形成され、推論がさらに裏付けられます。 ピーク25は、m / z比が445（C20H30O11）の主要な脱プロトン化イオンを示しました。これは、シスタノシドGの元素組成と同じです。ラムノシル部分が失われると、m/z比が299のフラグメントイオンが形成されます。さらに推論をサポートしました。 化合物の構造を図2に示します。

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0。9）。 これらのピークは次のとおりです。9、12、14、および15。したがって、エストロゲン活性の代表的な変数として、合計4つのピークに対応するエキナコシド、シスタノシドB、オスマンツシドB、およびアクテオシドが選択されました（図3）。

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3.4エストロゲン活性の測定

各マウスの体重に対する子宮湿重量の比率を計算しました（図4）。 9つの生息地からCistancheに曝露された動物は、ブランク対照群のマウスと比較して子宮重量を増加させることにより、有意なエストロゲン活性を示しました。 図4は、Cistancheで処理したマウスの血清で処理したMCF7細胞の増殖率をさらに示しています。 10の生息地からCistancheを投与されたマウスの血清で処理された細胞は、処理されていない細胞と比較して有意に高い成長を示しました。

3.5二変量解析

本研究では、未熟な雌のKunmingマウスの子宮重量が増加し、MCF7ヒト乳がん細胞の増殖が促進されることを観察しました。 これらの発見は、Cistancheのエストロゲン活性を確認しました。 図5は、これらの成分の子宮指数とMCF7細胞増殖率を示しています。 ピアソンの相関係数を使用して、サンプルのエストロゲン活性に対応する相対ピーク面積を計算しました。 0 .3より高い相関係数は有意であると見なされ（p<0。05）、0。5より高い相関係数は非常に有意であると見なされました（p><0.01）。>

合計9つの化合物が子宮重量の増加と有意に相関し（p <{{0}}。05）、10の化合物がmcf7細胞増殖と有意に相関しました（p><0.05）。 子宮重量および細胞増殖と有意に相関する化合物は、8-エピロガン酸、サリドロシド、シリンガリドa3'-="" -="" l-ラムノピラノシド、シスタノシドa、シスタノシドb、シスタノシドc、オスマンツシドb、アクテオシド、イソアクテオシド、ツブロシドでした。="" b、2'-アセチルアクテオシド、および2つの未知の化合物（図5）。="">

3.6灰色相関分析法

図6は、26の化合物の特徴的なピークと子宮指数との相対的な相関関係を示し、図7は、26の化合物の特徴的なピークとそれらの細胞増殖率との相対的な相関関係を示しています。 合計3つの化合物、すなわち8-エピロガン酸、シスタノシドF、およびアクテオシド（図6、降順）は、子宮指数と最も高い相関を示しました。 一方、MCF7細胞増殖と最も高い相関を示した6つの化合物は、エキナコシド、シスタノシドF、シスタノシドB、オスマンツシドB、イソアクテオシド、およびツブロシドBでした（図7、降順）。 エキナコシド、オスマンツシドB、アクテオシド、およびイソアクテオシドの相対的な相関は、0。5よりも高かった。

3.7LC-MS条件の最適化

より良いクロマトグラムマップを取得するために、メタノールとアセトニトリルを比較しました。 最後に、ギ酸水溶液（0 .2パーセント、v / v）-アセトニトリルの組み合わせが分離に最適な移動相でした。 200-400 nmの全波長スキャンの範囲で、254nmが最適なものとして選択されました。 さらに、MSパラメータも改善されました。 ネガティブイオンスキャンモードが選択されたのは、Cistancheのほとんどの成分の応答値が改善されたためです。

4結論

LC-Q-TOF-MSテクノロジーを使用して、Cistancheのエストロゲン様有効成分を特定しました。 本研究は、8-エピロガン酸、サリドロシド、シリンガリドA3'- - l-ラムノピラノシド、シスタノシドA、エキナコシド、シスタノシドF、シスタノシドB、シスタノシドC、オスマンツシドB、アクテオシド、イソアクテオシド、ツブロシドB、 2'-アセチルアクテオシド、および2つの未知の化合物がCistancheの主要な有効成分でした。 ただし、これらの調査結果は、構成要素のinvivo効果と作用機序を調査するためのさらなる研究を必要とします。

cistancheアクテオシドには、免疫システムを高めるなど、多くの機能があります

謝辞：

このプロジェクトは、中国国家自然科学基金（No. 81073015）、黒竜江省自然科学基金（ZD2017014）、および黒竜江省の大学の若くて革新的な人材育成計画（UNPYSCT -2017209）によってサポートされました。 。 著者は、この論文の出版に関して利害の対立がないことを宣言します。

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