蛍光タンパク質抗体の研究の進歩と応用: ナノボディに焦点を当てたレビュー
Dec 15, 2023
抽象的な: 蛍光タンパク質 (FP) の発見以来、その豊富な蛍光スペクトルと光化学的特性により、生物学研究への応用が広く普及してきました。 FP は緑色蛍光タンパク質 (GFP) とその誘導体、赤色蛍光タンパク質 (RFP) とその誘導体、近赤外 FP に分類できます。 FP の継続的な開発に伴い、FP を標的とする抗体が出現しました。 免疫グロブリンの一種である抗体は、抗原を明確に認識して結合する体液性免疫の主成分です。 単一の B 細胞に由来するモノクローナル抗体は、イムノアッセイ、体外診断、および医薬品開発に広く応用されています。 ナノボディは、重鎖抗体の可変ドメイン全体で構成される新しいタイプの抗体です。 従来の抗体と比較して、これらの小さくて安定したナノボディは、生細胞内で発現して機能することができます。 さらに、ターゲット表面の溝、継ぎ目、または隠れた抗原エピトープにも簡単にアクセスできます。 このレビューでは、さまざまな FP の概要、それらの抗体、特にナノボディの研究の進歩、および FP をターゲットとしたナノボディの高度な応用について説明します。 このレビューは、FP をターゲットとしたナノボディのさらなる研究に役立ち、生物学研究における FP の価値が高まります。
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キーワード: 蛍光タンパク質。 モノクローナル抗体; ナノボディ。 研究の進捗状況。 応用
1. はじめに
蛍光タンパク質 (FP) は、生物医学研究において最も一般的に使用されるツールタンパク質です。 FP の使用増加に伴い、FP 抗体も開発されました。 従来の抗体（図 1A）と比較して、ラクダ科動物の重鎖抗体（HCAb）（図 1B）およびサメの免疫グロブリン新規抗原受容体（IgNAR）（図 1C）には、当然ながら軽鎖がありません。 単一ドメイン抗体 (sdAb) は、HCAb または IgNAR の可変ドメインのみで構成される抗体です。 その分子量は 12 ～ 15 kDa で、モノクローナル抗体の約 1/10 のサイズです。 したがって、ナノボディとも呼ばれます。 このナノボディは、サイズが小さく、酸や熱に対する安定性が高く、浸透力が強く、遺伝子操作や発現が容易で、親和性が高いため、科学研究者によってさまざまな分野で応用されています。 標的表面の溝、継ぎ目、または隠れた抗原エピトープに簡単にアクセスでき、従来の抗体が認識できない多くの抗原を認識します[1]。 したがって、ナノボディは、発生生物学における生物および細胞培養系の生体分子、安定生物学における立体構造状態の結晶シャペロン、酵素活性の調節因子または阻害剤、生化学分析のための免疫組織化学試薬、およびイムノブロッティングおよび免疫蛍光における二次抗体として使用されてきました。 -6]。 FP に特異的に結合するナノボディは、細胞内局在化、細胞内シグナル伝達経路研究、生細胞イメージング、および標的ナノマテリアルで広く使用されています [7-9]。 特に、ナノボディは、超高解像度イメージングにおいて従来の IgG 抗体に比べて独自の利点を持っています。
図 1. IgG (A)、ラクダ科動物 HCAb (B)、およびサメ IgNAR (C) の構造図。 VH、重鎖の可変領域。 VL、軽鎖の可変領域。 CH/C、重鎖の定常領域。 CL、軽鎖の定常領域。 VHH、HCAb の可変ドメイン。 VNAR、IgNAR の可変ドメイン。
2. 蛍光タンパク質の概要
2.1. 蛍光タンパク質の発見
発光は海洋無脊椎動物では一般的な現象です。 クラゲ、ヒドラ、サンゴなどの腔腸動物は紫外線 (UV) または青色光の下で緑色の蛍光を発しますが、有櫛動物は青色の蛍光を発します。 緑色蛍光タンパク質 (GFP) は、Shimomura らによって Aequorea victoria で最初に同定されました。 1962 年に [10]、その後 1985 年にクローン化および発現されました [11]。 したがって、野生型 GFP (wtGFP) の独特の特性と安定した構造は、多くの研究者を魅了して研究を続けてきました。 それ以来、Tisen らは既存の知識とその結晶構造に基づいて、突然変異により異なる蛍光特性を持つさまざまな GFP タンパク質を生成し、GFP の発光機構を精緻に解明しました [12]。 GFP 関連の研究に関しては、GFP の発見とその応用への顕著な貢献により、3 人の科学者 (下村、チャーフィー、ツィエン) が 2008 年ノーベル化学賞を受賞しました。
祖先の赤色蛍光タンパク質 (RFP)、すなわち DsRed は、1999 年に非生物発光サンゴ礁からクローン化されました [13]。 RFP を GFP と併用すると、GFP だけでは解決できない科学的問題を解決できます。 最も重要なことは、細胞内イメージングにおける RFP のバックグラウンドが低いため、バイオサイエンス研究への応用により適していることです [14,15]。 多くの科学者の努力により、FP の蛍光スペクトルは可視領域全体と近赤外領域をカバーすることが報告されており、生細胞内のタンパク質を視覚化し定量するための豊富なツールが提供されています [16]。 図 2 は FP の開発をまとめたものです。
図 2. 蛍光タンパク質の開発。 GFP、緑色蛍光タンパク質。 BFP、青色蛍光タンパク質。 EGFP、強化された緑色蛍光タンパク質。 YFP、黄色蛍光タンパク質。 RFP、赤色蛍光タンパク質。 VHH、重鎖の可変ドメイン。 VNAR、可変新規抗原受容体。 薄緑色のマーカーはGFP応用に関する研究の進捗状況を示し、黄緑色のマーカーはGFP抗体に関する研究の進捗状況を示します。
2.2. GFPの構造と機能特性
GFP は、天然に存在する球状の可溶性の酸性 FP です。 GFP の一次構造は、238 個のアミノ酸残基からなる分子量 27 ～ 30 kDa のモノマーで構成されています。 その結晶構造は、11 本の逆平行鎖によって形成された中心を示し、円筒形の密に詰まったバレル構造を形成しています。 βバレルの中心は、βヘリックスに結合した4-(p-ヒドロキシベンジリデン)-5-イミダゾリノンの発光基によって保護されており、両端は短いβヘリックスセグメントで封止されている[17,18]。 発色団の成熟には、O2 以外の補因子は必要ありません [19]。 GFP は青色光または UV 光を吸収し、主励起ピークが 395 nm、最低励起ピークが 475 nm、発光ピークが 509 nm の緑色蛍光を発します。 GFP は非常に安定であり、高温処理にも容易に耐えます。 ホルムアルデヒド固定やパラフィン包埋は蛍光特性に影響を与えません。 FPの構造と成熟プロセスの詳細な研究を通じて、ますます多くの研究者がFPの構造を再設計して、FPに新たな機能と特性を提供し、その開発と応用をさらに推進しています。
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2.3. GFP誘導体
GFP アプリケーションの制限要因は、pH、塩素イオン感受性、および光安定性の低さです。 GFP の標的修飾によりこれらの欠陥が修正され、その量子収量、輝度、モル吸光係数、光安定性が向上します。 さらに、青、群青、シアン、黄色など、発光色の範囲を広げるために、いくつかの GFP 誘導体が確立されています。
青色光励起下での wtGFP の低い蛍光強度と哺乳類細胞におけるその不安定な発現に応答して、Zhang et al. は、GFP (F64L および S65T) のアミノ酸置換、すなわち蛍光強度が 35- 倍増加する強化 GFP (EGFP) を操作しました [20]。 EGFP は、優れた光安定性と高い輝度を考慮して、依然として緑色光領域で最も一般的に使用される FP 変異体です。 さらに、GFP の折り畳み特性を最適化し、超折り畳み能力を備えたスーパーフォルダー GFP (sfGFP) を取得しました。 sfGFP には、S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V、A206V を含む 6 つの新しい変異があります。 sfGFP は、不溶性タンパク質と融合して発現された場合でも効率的に折りたたむことができ、その蛍光の輝度を確保します [21]。 GFP の別の修飾型である GFPuv は、UV 光下での蛍光に最適化されています。 UV 光の存在下で励起ピークが 395 nm、発光ピークが 509 nm である明るい緑色の蛍光を生成し、さまざまな細胞内タンパク質の位置を正確に特定するために利用できます [22、23]。 GFPuv では、F99S、M153T、および V163A を含む 3 つのアミノ酸置換が発生します。 これらの変異は、大腸菌において wtGFP よりも 18- 倍強力な GFPuv 発現を誘導します。 GFPuv 遺伝子は、GFPuv の効果的な発現を確実にするために、5 つの低頻度 Arg コドンが大腸菌に適したコドンに置き換えられた合成遺伝子です。
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Y66H の部位特異的変異により、384 nm に励起ピークと約 445 nm に発光ピークを持つ青色蛍光タンパク質 (BFP) が構築されます。 その励起スペクトルは動作中に細胞に損傷を与える紫外線に近く、発光波長が短いため細胞内で自家蛍光を誘発します。 増強型 BFP (EBFP) は発光が弱く、光退色や酸に対する耐性が低く、細胞イメージング用のバックグラウンド信号が高くなります。 Azurite [24]、EBFP2 [25]、mTagBFP [26] (1.6-、2.0-、および 3.{13}) を含む 3 つのより明るい EBFP 変異体が開発されました。 }EBFPよりもそれぞれ1倍明るい。 最も明るい BFP である mTagBFP は、赤色蛍光タンパク質 (RFP) TagRFP の変異体に由来し [27]、吸光係数 52、000 M-1 cm-1 および量子収量 {{19 }}.63 であり、光退色に対する耐性が大幅に向上します。 wtGFP における Y66F の変異により、発光波長 442 nm の群青蛍光タンパク質が生成されます [28]。 ただし、GFP-Y66F バリアントの蛍光量子収率が低いため、イメージングへの適用性が大幅に制限されます。 T65Q、Y145G、H148S、および T203V のアミノ酸置換を伴う GFP-Y66F のさらなる変異により、GFP-Y66F より 25 倍明るい群青蛍光タンパク質シリウスが生成されます [29]。
シアン蛍光タンパク質 (CFP) は、449 nm に励起ピーク、～482 nm に発光ピークを持ち、スペクトル特性は BFP と EGFP の間の範囲にあります。 BFP と同様に、Y66W の部位特異的変異を使用して CFP を構築します。 CFP は、その優れた光安定性により、多色イメージングや位置特定研究に幅広く応用されています。 例えば、ＣＦＰをコードする遺伝子は、ヒトのコドン選択に合わせて最適化されており、現在、商品名ＡｍＣｙａｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で市販されている。 さらに、セルリアン、mTFP (セルリアンの 2 倍の明るさ)、ターコイズ (ECFP の約 2 倍の明るさ) など、強化 CFP (ECFP) よりも明るい変異体がいくつかあります [21,30]。
黄色蛍光タンパク質 (YFP) の変異は、発色団 Y66 のコアモチーフに限定されるのではなく、構造的に Y66 に隣接する残基に限定されます。 YFP の励起ピークは約 518 nm、発光ピークは約 531 nm です。 GFP と比較して、YFP の蛍光は赤色スペクトルにシフトします。これは主に 203 位の Thr が Tyr に置換されているためです。 Enhanced YFP (EYFP) は最も蛍光性が高く、細胞内 pH と細胞内 pH を検出するために広く利用されている FP バイオセンサーの 1 つです。塩化物イオン濃度。 しかし、酸や塩化物イオンの影響を非常に受けやすく、多くのクラゲ由来の FP よりも光安定性が劣ります [31]。 EYFP の改良版である mCitrine と mVenus は、現在最も使用されている YFP です [32,33]。 GFP とその誘導体の光物理的特性を表 1 にまとめます。
表 1. GFP、RFP、およびそれらの誘導体の光物理的特性。
表 1. 続き
2.4. RFP デリバティブ
RFP も広く使用されている FP です。 DsRed は四量体であり、タンパク質融合を行う際に多量体を形成する傾向があり、細胞内で発現すると毒性を示す可能性があるため、単量体を得るように操作されています。 最も注目すべきRFPは、mCherry、mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、およびmStrawberryを含む「mFruit」ファミリーであり(表1)、その中でK163QおよびK83Lの変異を有するmCherryが最も好ましい。 mCherry は、明るさは劣りますが、成熟が早く、モノマー特性が良好で、光安定性が優れています [34]。 ただし、モノマー型の TagRFP は mCherry よりも約 3 ～ 4 倍明るく、現在入手可能なモノマー RFP としては比較的明るいです [27]。 mKate は、TagRFP の 4 部位変異に由来する新規の単量体遠赤色蛍光タンパク質で、励起ピークが 588 nm、発光ピークが 635 nm であり、EGFP の明るさのわずか 45% です。 その二量体化タンパク質である Katushka は、EGFP と比べて 67% 明るいです [35]。 V38A、S165A、およびK238Rのアミノ酸置換を有するmKateの変異体であるmKate2は、mKateの約2倍の輝度を有する[36]。 GFP および RFP と比較して、mKate および Katushka は、物体内蛍光イメージングにおいて優れたイメージング深度およびより豊富な光信号を示します [35]。 したがって、遠赤色蛍光タンパク質の開発は、in vivo バイオイメージングにとってより価値があります。
2.5. 近赤外線FP
近赤外 (NIR) FP は、イメージング用途におけるタンパク質タグとして非常に望まれています。 ほとんどの NIR FP は細菌のフィトクロム光受容体 (BphP) から設計されています [37]。 生きた動物のイメージングに使用される最初の NIR FP は、ビリベルジン (BV) 発色団に結合することで蛍光を発する BphP 由来の蛍光タンパク質である IFP1.4 です [38]。 DNA シャッフルとランダム突然変異誘発により、より明るい IFP2.0 が開発されます [39]。 単量体 IFP1.4 および IFP2.0 は、BphP の二量体化界面を破壊することで実現できますが、依然として高濃度では二量体化する傾向があります。 天然の単量体赤外蛍光タンパク質 (IFP)、mIFP は 2015 年に設計されました [40]。 mIFP は、ショウジョウバエの幼虫とニューロンにおいて音響イメージング効果があることが証明されています。 シェルバコワら。 は、異なるスペクトルを持つ 3 つの明るい単量体 NIR FP、すなわち miRFP670、miRFP703、および miRFP709 を設計しました [41]。 BphP 由来の NIR FP は、BV 発色団を共有結合させるために、PAS (Per-ARNT-Sim) と GAF (cGMP ホスホジエステラーゼ-アデニル酸シクラーゼ-FhlA) の 2 つのドメインを最小限必要とし、複雑な「8 の字ノット」構造も保有します。 GAF ドメインと PAS ドメインをトポロジー的にリンクし、それらの折り畳みに影響を与えます。 したがって、別のクラスの細菌光受容体であるアロフィコシアニン (APC) は、smURFP などの NIR FP を操作するために使用されます [42]。 APC ベースの NIR FP は小さいですが、BV への結合効率が低く、BphP 由来の NIR FP よりも哺乳類細胞の輝度が大幅に低くなります。 BphP および APC ベースの NIR FP の欠陥を克服するために、miRFP670nano という名前の単一ドメイン NIR FP がシアノバクテリオクロム (CBCR) から開発されました。これは、内因性 BV 発色団に効率的に結合し、明るい蛍光を発することができる初の CBCR 由来 NIR FP です。哺乳動物細胞[43]。 BphP 由来の NIR FP に対する miRFP670nano の本質的な利点は、高い光安定性です。 親 miRFP670nano と比較して 14 個の変異を持つ強化された miRFP670nano3 は、miRFP670nano と同様の光安定性を示します [44]。 表 2 は、NIR FP の光物理特性をまとめたものです。
表 2. NIR FP の光物理的特性。
FP の発見と応用は、現代生物学に強力な研究ツールを提供しました。 現在、FP は科学者が遺伝子発現制御、細胞小器官標識、シグナル伝達、薬物スクリーニング、生体分子相互作用などの多くの研究分野にその応用を拡張するために使用する一般的なツールの 1 つとなっています。 FP を発現するほとんどのクローニング ベクターは商品化されており、営利企業を通じて入手できます。
3. 蛍光タンパク質抗体の研究の進展
3.1. 蛍光タンパク質を標的とするモノクローナル抗体
抗体はBリンパ球から分泌される免疫グロブリンの一種です。 モノクローナル抗体は 2 つの重鎖と 2 つの軽鎖で構成され、重鎖は 1 つの可変領域 (VH) と 3 つの定常領域 (CH) で構成され、軽鎖は 1 つの可変領域 (VL) と 1 つの定常領域 (CL) で構成されます。 ）。 重鎖はジスルフィド結合によって共有結合しており、軽鎖のCL領域は重鎖のCH1ドメインに非共有結合して安定した抗体分子を形成しています[45]。 モノクローナル抗体は、その特異的な受容体結合能力により、古典的な遮断、中和、補体活性化、Fc 受容体を介した標的細胞の死滅、免疫活性の調節などのさまざまな生物学的活性を生み出します。 これらは、イムノアッセイ、体外診断、創薬に広く応用されている重要な生体高分子です。 ポリクローナル抗体は、複数の B 細胞の免疫応答プロセスに由来する異型抗体の混合物であり、各抗体は同じ抗原の異なるエピトープを認識します [45]。 ポリクローナル抗体と比較して、モノクローナル抗体は抗原上のエピトープを特異的に検出し、他のタンパク質と交差反応する可能性が低いため、バックグラウンド染色シグナルが低くなります。 さらに、モノクローナル抗体に関する結果の再現性は、同じ実験条件下でのポリクローナル抗体の結果の再現性よりも高くなります。
GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90%) は、mAb FMU-GFP を使用した簡単なステップ技術を使用して精製されます。2-結合したセファロース 4B 樹脂5-。 さらに、GFP エピトープのおかげで、GFP に結合したすべての機能的組換え標的タンパク質を細胞から簡単かつ直接単離できます。 これらのデータは、この方法が利用可能などの方法よりも GFP の精製に効果的であり、ほとんどの GFP 精製方法における低収率と低純度の課題を解決することを示唆しています。
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3.2. 蛍光タンパク質を標的とするナノボディ
3.2.1. ナノボディの紹介
大きな分子量、複雑な構造、限られた生物学的活性などのモノクローナル抗体の固有の特性により、さらなる用途はますます制限されています。 したがって、モノクローナル抗体に代わる抗体の開発が急務となっています。 1989 年に、ウォードら。 らは、リゾチームに対する結合能力が弱い重鎖のみの抗体の可変ドメインを調製し、sdAb 研究への関心を一気に高めた[48]。 1993 年、Hamers Casterman らは、 らは、ラクダ血清中に従来の哺乳類の抗体とはまったく異なる新しいタイプの抗体を初めて発見した[49]。 このタイプの抗体は、自然に軽鎖が欠如しているため、HCAb と名付けられています。 HCAb は CH2、CH3、ヒンジ領域、および HCAb の可変ドメイン (VHH) で構成されていますが、依然として完全な抗原結合能を持っています。 1995 年に、Greenberg らは、 IgNARとして知られる重鎖のみの抗体をナースシャークで発見した[50]。 これは分泌型と膜結合型の両方で存在し、可変新抗原受容体 (VNAR) と呼ばれる可変領域といくつかの定常領域で構成されます。 その後、IgNAR がウォッベゴンザメ、ツノザメ、ツノザメ、およびシロホシザメで発見され、sdAbs レパートリーを補完しています。 ナノボディは、小さな分子量、高い親和性、強力な安定性、良好な溶解性、強力な組織浸透、および隠れた抗原エピトープの認識という特徴を備えています。 病気の診断、免疫試薬、病原体検出、および医薬品開発において注目が高まっています[51]。 分子生物学技術の発展と遺伝子組み換え抗体調製技術の改良により、ナノボディは免疫測定法の人気の研究分野となっています。 図 3 は、これまでのナノボディの開発をまとめたものです。
図 3. ナノボディの開発。 水色のマーカーはナノボディ医薬品の研究の進歩を示します。 FDA、食品医薬品局。 EMA、欧州医薬品庁。 NMPA、国家医療製品局。 HCAb、重鎖抗体。 IgNAR、Ig新規抗原受容体; sdAb、単一ドメイン抗体。 VHH、HCAbの可変ドメイン。 VNAR、IgNAR の可変ドメイン。 PD-L1、プログラム細胞死 1 リガンド 1。
3.2.2. 蛍光タンパク質を標的とするナノボディ
蛍光タンパク質は、使いやすい遺伝子コード化蛍光タンパク質マーカーを提供することで、細胞生物学と生化学を変えてきました。 研究および薬物標的のためのいくつかの強結合剤は、並行開発中のタンパク質足場ライブラリーの合成および選択を通じて開発されている[52]。 一例は、安定性、溶解性、収率が向上し、選択が容易になったナノボディの開発です [53]。 従来の抗体とは対照的に、これらの小さくて安定したナノボディは生細胞内で機能します。 したがって、FP に対する特異的結合活性を持つナノボディは、生物学研究のさまざまな分野における FP の融合、分離、および細胞工学のための強力なツールです。
• GFPを標的とするラクダ科由来のナノボディ
優れた細胞内局在特性を持つさまざまなタンパク質が GFP に融合されており、さまざまな細胞内コンパートメント内のタンパク質を直接検出するための視覚抗原が作成されています。 2006 年に、ロスバウアーらは、 GFP でアルパカを免疫することによって、GFP 特異的抗体フラグメント (cAbGFP4) をスクリーニングしました [54]。 cAbGFP4とGFP抗原との間の相互作用の表面プラズモン共鳴アッセイ(SPR)は、高い親和性(KD= 0.23nM)を示した。 さらに、抗 GFP ナノボディは単量体 RFP と結合し、生細胞における抗 GFP ナノボディの分布を調べるために使用される目に見える GFP 結合抗体を生成しました。 ゲル濾過、イムノブロッティング、および共焦点顕微鏡アッセイにより、GFP 特異的ナノボディは、単鎖可変フラグメントでよく見られる検出可能なタンパク質の分解や凝集を起こすことなく、哺乳類細胞内に安定して分布していることが実証されました。 さらに、Kubala et al。 X 線結晶構造解析と等温滴定熱量測定 (ITC) によって GFP:cAbGFP4 複合体 (図 4A) の特徴を明らかにし [55]、タンパク質結合におけるナノボディの高い親和性と特異性の基礎を明らかにしました。 2020年に、A12、B9、D5、およびE6と呼ばれる4つの異なる抗GFPナノボディが、ファージディスプレイを使用して同定された[56]。 ネイティブ PAGE および免疫沈降アッセイにより、これらのナノボディが in vitro および in vivo で GFP に結合できることが明らかになりました。
図 4. GFP とナノボディの複合体の図。 (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO、オレンジ); (B) GBP1 (PDB: 3K1K、ライトブルー); (C) GBP4 (PDB: 3G9A、ピンク); (D) LaG16 (PDB: 6LR7、黄色); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53、マゼンタ)。 (F) 上記のナノボディと GFP 複合体との構造的重ね合わせ。 GFPは緑色で表示されます。
タンパク質の立体構造は機能と密接に関係しており、通常は調節因子によって制御されます。 アクセルら。 は、7 つの GFP 特異的結合剤、すなわち GFP 結合タンパク質 (GBP) 1 ～ 7 を同定しました [57]。 そのうち、GBP1 は GFP 蛍光を 10- 倍増加させましたが、GBP4 は GFP 蛍光の 5- 倍減少を誘導しました。 したがって、これらはそれぞれ「エンハンサー」および「ミニマイザー」と呼ばれます。 GFP ナノボディ複合体の構造解析 (図 4B、C) により、2 つのナノボディが発色団環境に適度な相反する変化を引き起こし、その吸収特性を変化させることが明らかになりました [58]。 さらに、25 個の GFP 特異的ナノボディ (LaG) が同定され、KD 値は 0.5 nM から 20 μM 以上の範囲でした [59]。 二価ナノボディ (LaG-16-LaG-2) は、36 pM の KD 値で最も高い親和性を示しました。 さらに、過剰な LaG タンパク質とインキュベートすると、GFP の最大蛍光強度は約 60% 増加しました。 張ら。 LaG16 と複合体を形成した GFPuv の結晶構造を 1.67 Å の解像度で報告しました [60]。 GFPバレル上のLaG16の結合部位は、GFPエンハンサーの反対側に位置していた。 したがって、LaG16 と GFP エンハンサーは (GS)4 リンカーで融合されました。 二価ナノボディの親和性は 0.5 nM であり、異なるエピトープと結合する 2 つのナノボディの二量体化による超高親和性標的タンパク質バインダーの設計の実現可能性を実証しました。
2014 年に、Twair らは、 sfGFPを調製し、こぶラクダの成体に免疫を与えました。 3 つのエピトープ (NbsfGFP01、02、03、04、06、07、および 08) を標的とする 7 つの抗 sfGFP ナノボディが単離されました [61]。 ELISAおよび免疫ブロッティングアッセイに基づいて、これらのナノボディは、遊離または成長ホルモンに融合したものとして標識されたsfGFPを認識した。 さらに、sfGFP と複合体を形成したナノボディ NbsfGFP02 の結晶構造 (図 4E) が 2.2 Å の分解能で確立されました。 NbsfGFP02 と sfGFP の間の親和性は、生物層干渉法 (BLI) によって 15.8 nM であると測定されました。 NbsfGFP02 の融解温度は 75.6 度でした [62]。 したがって、これは、過酷な試験条件を要求する用途における将来の GFP ナノボディ候補です。 ほとんどのナノボディは、真核細胞へのプラスミドトランスフェクションによって in vivo で機能的に発現できます。 したがって、ナノボディは、生細胞の構造的または動的特徴を特定するための優れたツールです。 2020 年に、Zhou らは は、ナノボディ-mCherry と呼ばれる、構築された GFP 結合ナノボディ (cAbGFP4) を in vitro 転写 (IVT) mRNA として発現する新しい方法を提案しました [63]。 非翻訳領域と、化学的に修飾されたヌクレオチドおよびポリ (A) テールでキャップされた逆キャップ類似体を含む mRNA を in vitro で調製し、トランスフェクションに使用しました。 プラスミド DNA を使用して発現されたナノボディとは対照的に、IVT mRNA を使用して発現された抗 GFP ナノボディは、トランスフェクションの 3 時間以内に同定され、48 時間以内に分解されました。 したがって、生細胞内でナノボディのコードされた mRNA を発現させると、ナノボディの効率的な送達が可能になります。
• GFP を標的とするサメ由来のナノボディ。
魏ら。 タケサメは、リンパ球数と抗原特異的 IgNAR の増加を特徴とする、GFP 免疫に対する効果的な免疫応答を引き起こしたことを実証しました [64]。 合計 7 種類の抗 GFP ナノボディ (BsG3、73、80、89、93、98、105 を含む) が、最大 0.3 nM の親和性を持ち、免疫化されたタケザメから単離されました。高親和性 IgNAR を製造します。 さらに、GFP (20.7 pM) に対して最も高い親和性を持つバイパラトピック VNAR が構築され、内部抗体としての抗 GFP ナノボディの特性が哺乳動物細胞で検証されました。 これらの発見は、タケザメ sdAb の研究と進歩を加速し、生物医学産業に低コストで使いやすいナノボディを提供するでしょう。
• 他の蛍光タンパク質を標的とするナノボディ。
masabi は、明るい単量体の緑色蛍光タンパク質です。 リーら。 ラクダを抗原としてmWasabiで免疫し、Nb4、Nb6、およびNb27と呼ばれる3つの高親和性mWasabi特異的ナノボディをスクリーニングすることにより、4×107形質転換体の抗体ライブラリーの構築に成功した[65]。 これらのナノボディは、ワサビを単独で、またはプログラムされた死 1 (PD-1) と組み合わせた場合に認識しました。 合計で、mCherry を高い特異性で標的とする 6 つのナノボディ (LaM) が同定され、KD 値は 0.18 nM から 63 nM の範囲でした [59]。 さらに、ナノモルの結合親和性を持つ 3 つの iRFP713- 特異的ナノボディ (BSR1、BSR3、および BSR4) が単離されました [64]。 これらのデータは、タケザメの免疫化により高親和性ナノボディが生成できることを示唆しています。 全体として、細胞タンパク質に結合し、FP 融合タンパク質を引き付けるナノボディの能力により、生細胞における細胞プロセスと構造の正確な制御が可能になります。 同一タンパク質のユニークな組み合わせにより、顕微鏡、生化学、機能解析を可能にする多機能FP-ナノトラップです。 FP を標的とするナノボディを表 3 にまとめます。
表 3. FP をターゲットとするナノボディの概要。
4. 蛍光タンパク質ナノボディの応用
4.1. タンパク質検出への応用
4.1.1. 細胞内タンパク質の検出
タンパク質の機能を理解するには、信頼性が高く定量化可能な高解像度のタンパク質の局在化が必要です。 標的タンパク質を標識するための抗体の使用は分子生物学において十分に確立されているが、この技術は従来の抗体のサイズと多価性によって制約を受ける。 ナノボディはサイズが小さいため、蛍光分子、酵素、ペプチド、受容体、ビオチン、その他の薬物と結合させた後、細胞内イメージング用のトレーサーとして使用できます。 たとえば、FP に対するナノボディは、有機色素でタグ付けされた場合、超解像度顕微鏡イメージングに使用されました [66,67]。 このアプローチを使用してチューブリン YFP を継続的に発現する Ptk2 細胞をイメージングしたところ、従来の抗体では約 450 Å であった分解能が 269 ± 37 Å に向上しました。
ナノボディ媒介標識は、洗練された単一分子局在顕微鏡 (SMLM) イメージングのために、一般にアクセス可能なほとんどすべての FP 由来の融合構造を標識するための迅速かつ多用途な方法を提供します。 具体的には、2色SMLMは、GFPおよびRFPに対するナノボディを同時に使用した場合に、機能的なGFPおよびRFP融合構築物の細胞内局在を調べることができる[68]。 したがって、2 色の SMLM イメージングを使用すると、数多くの生物学的問題に迅速に対処できます。 アリオッティら。 は、酵素ベースのタンパク質標識のためのモジュール式アプローチを提案し、細胞内タンパク質分布を EM 分解能で分析するための速度とサンプリングの向上を可能にしました [7]。 GBP4 を修飾大豆アスコルビン酸ペルオキシダーゼ (APEX) タグに直接設計することにより、APEX を任意の GFP 標識タンパク質に向けることができることが示されました。 APEX-GBP4 融合により、細胞小器官のサブドメインへの顕著な高解像度のタンパク質局在が得られ、細胞内タンパク質分布の特性評価にかかる時間が大幅に短縮されます。 さらに、内因性レベルで発現された GFP 標識タンパク質の EM 分解が可能になります。
FP 特異的ナノボディをコードするプラスミドのツールボックスが生成され、機能モジュールに融合されました。 このツールボックスは、生細胞における細胞内シグナル伝達経路の視覚化と操作を可能にし、生体内での用途を大幅に拡大します [9]。 これらには、Ca2+、H+、ATP/ADP を動的に可視化するための蛍光センサーや、タンパク質の動員や単離、細胞小器官間の膜接触部位の認識を可能にするオリゴマーまたはヘテロ二量体モジュールが含まれます。 2017 年に Herce ら。 細胞透過ペプチド（CPP）を使用して、免疫標識および抗原操作のために抗体を細胞に直接輸送しました[69]。 核小体のRNAに対する環状アルギニンリッチCPPの高い親和性を利用したシステムを構築した。 環状アルギニンに富む CPP を GFP ナノボディに結合することにより、核小体における GFP の再局在を細胞内で直接観察できます (図 5A)。 したがって、この視覚化システムを使用して、タンパク質の位置を追跡し、さまざまな CPP の効率を定量的に比較することができます。
蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) 技術は、生細胞の生理学的条件下でシグナル伝達分子を動的にリアルタイムで検出できるため、ライフサイエンス研究で広く使用されています。 時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動 (TR-FRET) ベースの分析は、その優れた感度と特異性により、生物医学研究においてますます人気が高まっています。 ナノボディベースの TR-FRET 法により、従来の蛍光強度の読み取りよりもはるかに高い感度で、ライセート中の蛍光 (融合) タンパク質を簡単に定量化できます [70]。
図 5. 蛍光タンパク質ナノボディの応用。 (A) タンパク質間の相互作用の視覚化。 細胞透過ペプチド (CPP) に結合した抗 GFP ナノボディ (Nb) は、細胞核を透過できます。 GFPタグ付きタンパク質がRFPタグ付きタンパク質と相互作用しない場合、GFPタグ付きタンパク質のみがNb-CPPを介して核小体に再局在し、緑色を示します。 しかし、2 つのタンパク質が相互作用すると、両方のタンパク質が核小体に再局在し、黄色を示します。 (B) GFP ナノボディは、新たにエキソサイトーシスされた小胞タンパク質の選択的標識を可能にします。 ステップ 1: 小胞タンパク質は GFP に結合され、非蛍光ナノボディ (NbGFP) とともにインキュベートされ、その結果、蛍光結合ナノボディ (NbGFP*) が GFP にアクセスできなくなります。 ステップ 2 および 3: 細胞エキソサイトーシスの刺激後、新しい小胞タンパク質が細胞膜に露出し、NbGFP* によって標識されます。 (C) 劣化の模式図。 タンパク質の選択的分解は、複雑な一連の酵素によって実行されるユビキチン経路を通じて行われます。 SKP1-CUL1-F-box タンパク質リガーゼ複合体 (SCF) 内の F-box タンパク質 (FBP) は、GFP 融合タンパク質を認識するために抗 GFP ナノボディ (Nb) に融合され、ユビキチン結合酵素 (E2) は、複数のユビキチン分子を標的タンパク質に共有結合させます。 続いて、ポリユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームによって分解されます。 (D) BiCAP の概略図。 HER タンパク質は、GFP の N 末端 (GFP1) または C 末端 (GFP2) フラグメントに融合されています。 2 つの融合体が二量体を形成すると、GFP は再び折り畳まれて蛍光を発します。 次に、HER 二量体とその相互作用タンパク質は、GFP フラグメントに対する結合能力を持たない GFP ナノボディを使用して濃縮されるため、二量体の単離が可能になります。 (E) GFP 依存性転写システム。 DNA結合ドメイン（DBD）および活性化ドメイン（AD）は、それぞれGFPナノボディ1（Nb1）およびGFPナノボディ2（Nb2）と融合されています。 GFP の存在下では、DBD-Nb1 および AD-Nb2 は上流活性化配列 (UAS) レポーター遺伝子を活性化し、標的遺伝子の上方制御をもたらします。 (F) DNA ナノ構造上の GFP 標識タンパク質の認識。 2 つの結合部位を持つ DNA ナノ構造は磁性樹脂上にライゲーションされ、相補的な塩基対形成によって GFP ナノボディ (Nb) と結合し、GFP 標識タンパク質とインキュベートされます。 したがって、GFP 標識タンパク質をナノ構造に正確に付着させることができます。
図 5. 続き
4.1.2. 細胞表面のタンパク質の検出
細菌表面ディスプレイは、細胞アンカー型タンパク質の生成および全細胞触媒の設計にとって有望な技術です。 表面ディスプレイにはさまざまな外膜タンパク質が使用されていますが、表面ディスプレイシステムを評価および開発するために利用できる、単純で汎用的でハイスループットの互換性のある方法はありません。 さらに、細胞内タンパク質と表面提示タンパク質を区別することは困難です。 ウェンデルら。 らは、GFP ナノボディを外膜アンカーに融合することにより、蛍光ベースの表面ディスプレイ検出システムを構築しました [71]。 一般的に使用される 2 つの外膜タンパク質、外膜タンパク質 A (OmpA) と自己輸送体 (C-IgAP) がアンカーとして選択されました。 したがって、2 つの異なるディスプレイ モジュールは、OmpA または C-IgAP を GFP 特異的ナノボディと融合することによって構築され、精製 GFP を外部から添加することによって視覚化されます。 GFP 自体は細胞表面に提示できますが、GFP が細胞表面に提示されたナノボディに結合した場合にのみ細胞が蛍光シグナルを生成できるため、この新しい方法では偽陽性の問題が回避されます。 このアッセイは、プレートでの全細胞蛍光検出、ゲル内蛍光、顕微鏡検査、フローサイトメトリーなどの多くの蛍光検出方法と互換性があります。 この安価で読みやすい表面表示法は、生細胞の表面へのタンパク質の輸送メカニズムを実証するのに役立ち、将来的には細菌の表面表示システムや堅牢な全細胞生体触媒の合理的な開発が可能になります。
神経伝達物質の放出には、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、および新しい融合小胞の形成が必要です。 エキソサイトーシス後に小胞タンパク質が原形質膜上に残された場合に何が起こるかは、ほとんどわかっていません。 これらのタンパク質は、pH 感受性 GFP 部分 (フッ素) と結合することがよくあります。 pHluorin イメージングは通常、小胞よりも数倍大きいスポットの回折によって制限されるため、抗 GFP ナノボディを使用してエキソサイトーシスされた小胞を選択的に標識することは価値があります [72]。 抗 GFP ナノボディを超解像イメージングに適した化学蛍光色素分子に結合させることにより、pHluorin 単独では不可能な方法で、さまざまな条件下での pHluorin 標識タンパク質のサイズと強度を検出できます。 エキソサイトーシスが刺激されると、新しい小胞タンパク質が細胞膜に露出し、蛍光標識されたナノボディが pHluorin と結合します (図 5B)。 したがって、ナノボディベースの pHluorin 検出は、ニューロンにおけるエキソサイトーシス後のイベントを研究するための有望なツールです。
4.2. タンパク質分子の標的分解への応用
遺伝子編集や RNA 干渉と比較して、タンパク質レベルでの生体分子の直接操作は、タンパク質機能研究にとってより効率的な方法であり、潜在的なオフターゲット効果、遺伝子の不活化、必須遺伝子表現型機能の損失などの制限を克服します。 標的タンパク質の分解は、現在、対象タンパク質の機能喪失とタンパク質分解を達成するための主要な研究戦略です。 ナノボディベースのタンパク質分解剤は、目的のタンパク質の迅速な分解と可逆的な制御の達成に役立ちます。 カウシーヌスら。 は、あらゆる真核生物系において標的 GFP 融合タンパク質を直接かつ迅速に枯渇させるためのタンパク質分解方法を開発しました [73]。 簡単に説明すると、GFP 融合タンパク質をノックダウンするには、抗 GFP ナノボディを SKP1-CUL1-F ボックス タンパク質 (SCF) E3 リガーゼ複合体の F ボックス タンパク質 (FBP) に融合させます。 GFP融合タンパク質を認識します。 ユビキチン結合酵素 (E2) は、複数のユビキチン分子を標的の GFP 融合タンパク質に共有結合します。 続いて、SCF 複合体はポリユビキチン化タンパク質を分解します。 したがって、標的タンパク質の除去を監視するのは簡単です (図 5C)。 この技術は、緑色蛍光タンパク質の分解 (deGradFP) と呼ばれ、哺乳動物細胞、ゼブラフィッシュ胚 [74]、植物 [75] における GFP の分解とその融合に使用されています。
4.3. 生体分子相補アフィニティー精製システムへの応用
2016 年に、Croucher et al. は、ヒト上皮成長因子受容体 (HER) 二量体 (同種および異種) を単量体から効果的に区別できる二分子相補アフィニティー精製システム (BiCAP) を開発しました [76]。 このシステムでは、FP 分子の 2 つの相補的フラグメントが 2 つの HER タンパク質 (HER1、HER2、または HER3) と融合されます。 これら 2 つのフラグメントは、自発的に組み立てられて活性な蛍光タンパク質を形成することはできません。 ただし、2 つの HER タンパク質が相互作用すると仮定します。 その場合、2 つのフラグメントは空間的に互いに近く、相補的となり、完全で活性な蛍光タンパク質に再構築されます (図 5D)。 HER 二量体とその相互作用タンパク質は、GFP フラグメントに対して親和性を持たない GFP ナノボディを使用して濃縮できるため、二量体の単離と濃縮が可能になります。 同定されたタンパク質を分析することにより、3 つの二量体 (HER2:HER2、HER2:HER3、HER1:HER2) が共通の相互作用タンパク質とその特異的なインタラクトームを持っていることが明らかになりました。 HER1:HER3 二量体と特異的に相互作用するタンパク質である FAM59A は、細胞外シグナル調節キナーゼ経路の活性化を媒介し、乳がん治療の新たな標的を提供しました。
カンサス植物の免疫システムを高める
4.4. 他の分野での応用
疾患の早期のインビトロ診断および治療効果のモニタリングは、疾患診断における大きな問題である。 理想的な造影剤は、正常組織への損傷を最小限に抑えながら、良好な組織浸透性、高い抗原親和性、および迅速なクリアランス能力を備えている必要があります。 ナノボディは、より優れたイメージングおよび治療用途のために、血管を通過して組織に侵入できる理想的なイメージング剤としての可能性を秘めています。
FP は細胞や生物学的プロセスを照らすだけでなく、多数の宿主タンパク質ネットワークとの結合が明らかに欠如しているため、優れた足場としても機能します。 Tangらは、生物学的に活性な複合体形成を促進するための足場としてGBPとGFPを使用することを明らかにした。 は、GFP とその誘導体の存在下で遺伝子発現を独占的に制御するハイブリッド転写因子のライブラリーを作成しました [77]。 GFP の産生は細胞特異的遺伝子の発現を制御し (図 5E)、マウスの網膜と脳の機能不全を促進します。 さらに、GFP トランスジェニック マウスとゼブラフィッシュ系統は、神経回路の光遺伝学的モニタリングのために GFP 依存性転写を達成するように改変されています。 この研究は、多用途の足場としての GFP の地位を確立し、トランスジェニック株におけるさまざまな GFP タグ付き細胞の選択的操作への扉を開きます。 これに基づいて、他の細胞内産物も多細胞生物の細胞特異的足場として開発できます。
DNA ナノ構造は、酵素活性とタンパク質の機能を研究するための不可欠かつ効果的なツールとなっています。 しかし、DNA ナノ構造上にタンパク質複合体を形成するための普遍的な戦略を開発することは困難です。 困難の 1 つは、目的のタンパク質を DNA ナノ構造に結合することです。 Sommese et al. DNA ナノ構造を標識する新しいアプローチを提案しました [78]。 GFP ナノボディでそれらを機能化することにより、タンパク質の結合能力を正確に制御できます (図 5F)。 GFP 特異的 DNA アプタマーと比較して、ナノボディは GFP に対してより高い特異性、安定性、および親和性を示します。 したがって、生物学研究におけるプログラム可能な足場としての DNA ナノ構造の応用は、DNA ナノ構造を細胞、発生生物学、およびタンパク質生化学で一般的に見られる FP と接続することによって劇的に簡素化されました。
5. 今後の展望に関する議論
従来の抗体と比較して、ナノボディは物理的および化学的特性が優れており、発現およびスクリーニングが容易です。 ナノボディは従来の抗体に比べて構造がはるかに単純です。 これらは単一の遺伝子によってコードされており、微生物によって容易に生産できるため、生産コストが大幅に削減されます。 ナノボディは抗体研究に画期的な進歩をもたらしますが、まだ解決する必要のある問題もいくつかあります。 一方で、それらは操作が不便で動物の予防接種にかかる費用が高いという欠点を持っています。 さらに、HCAb および IgNAR は末梢血単球に豊富に存在するため、FP 抗原を標的とするナノボディは通常、特定のラクダ科またはサメの免疫ライブラリーからスクリーニングされます。 ライブラリー構築およびナノボディ開発技術の成熟に伴い、合成ライブラリーからの FP 特異的ナノボディのスクリーニングは、動物の免疫化の不便さを克服し、実験期間を短縮し、コストを大幅に削減する新しい方向性です。 一方、ナノボディのスクリーニングと発現は比較的単純ですが、潜在的な応用価値を備えたFPナノボディを取得するのは非常に複雑なプロセスです。 ファージナノボディライブラリのスクリーニングでは、糸状ファージ表面と抗原の結合によって引き起こされる偽陽性を避けることはできませんが、酵母および細菌のナノボディライブラリの容量が小さいことも、ナノボディスクリーニングにおける別の困難な問題です。
FPに対するナノボディの応用は今後も増え続けるだろう。 (1) 細胞内抗体技術の発展により、生きた細胞内の細胞内分子を検出できるようになりました。 ナノボディには、この点で独特の利点があります。(i) ナノボディは小さく、細胞侵入効率は従来の抗体よりもはるかに高い。 (ii) ナノボディは生細胞内で発現し、機能することができる。 (2) 二重特異性ナノボディは、2 つの異なる抗原に同時に特異的に結合できる、人工的に修飾された抗体の一種です。 一価ナノボディから簡単に構築でき、微生物で発現させることができます。 したがって、FP に対するナノボディは、二重特異性ナノボディの開発に広範な応用の可能性をもたらします。
6. 結論
この論文では、FP の起源、構造、特性について概説します。 FP を標的とするモノクローナル抗体およびナノボディとその応用についてもまとめられています。 抗体は固定化された細胞内で生物学的成分を提示するための貴重なツールですが、生細胞での従来の抗体の使用は、可変重鎖と軽鎖の非効率的なフォールディングとアセンブリによって制約されます。 抗体の直接マイクロインジェクションは、抗体の細胞内アプリケーションで使用される主な方法ですが、技術的に難しく、細胞にストレスを与えます。 ラクダまたはサメ由来の単一ドメイン抗体は、重鎖の可変ドメインを通じて抗原を認識します。 これらの小さくて安定したナノボディは、生細胞内で発現して機能することができます。 したがって、FP をターゲットとしたナノボディを生成すると、生物学的研究におけるナノボディの価値が高まります。
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