分泌型好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンは、非分泌型Ⅱ型と比較してADPKD細胞の嚢胞拡大を阻害する強力な能力を示す

3. 結果

3.1. M-1 野生型細胞と 2L3 ADPKD 細胞間の NGAL 発現と細胞増殖の比較

2L3 細胞株は、Pkd1L3/L3 マウス由来の初代腎上皮細胞の SV40 ウイルス形質導入によって樹立されました [17]。 BCRC (台湾、新竹) から購入した M-1 細胞 (マウス野生型腎上皮細胞株) をコントロールとして使用しました。 2L3 および M-1 細胞の Pkd1 転写物の PCR 遺伝子型判定を実施し、標的対立遺伝子のイントロン 30 の最初の loxP 部位の前後にあるプライマーを使用して遺伝子型を確認しました (図 1A)。 Pkd1+/+、Pkd1L3/+、および Pkd1L3/L3 マウス組織を遺伝子型解析対照として使用しました。 M-1 細胞からの PCR 産物は単一の野生型 (WT) Pkd1+/+ バンド (473 bp) を示しましたが、2L3 細胞からの PCR 産物は単一の Pkd1L3/L3 バンド (507 bp) を示しました余分な loxP セグメント (34 bp) によるものです (図 1B)。

M-1 細胞と 2L3 細胞が由来であるかどうかを特徴付けるには似た起源の尿細管まず、2 つの細胞株間の形態を比較しました。 M-1 細胞と 2L3 細胞は非常に類似した形態を示しました (図 1C)。さらに、Lotus tetragonolobus lectin (LTL、分化した近位尿細管のマーカー、フルオレセインで標識) および Dolichos biflorus agglutinin (DBA、分化した遠位尿細管および集合管のマーカー、ローダミンで標識) を使用したレクチン染色を実行して、それらの起源を確認しました。尿細管から (図 1D)。染色結果は、M-1 細胞と 2L3 細胞が両方とも LTL 陽性 (主に DAPI と共局在) であり、DBA 陽性 (細胞質に局在) であることを示しました (図 1D)。この結果は、M-1 細胞と 2L3 細胞が由来することを示唆しました。腎尿細管似たような起源を持ち、似たような特徴を持つ可能性があります。リアルタイム PCR の結果、2L3 細胞では M-1 細胞と比較して Pkd1 mRNA 発現レベルが大幅に低下していることが示されました (図 1E)。これは、Pkd1 タンパク質発現レベルがわずか 25% であった 2L3 マウスのデータと一致していました。野生型マウスのもの[17]。 2L3 マウスは、野生型マウスよりも腎臓に NGAL および NGAL 受容体 (NGAL-R) タンパク質のレベルが高いことが実証されています [31]。リアルタイム PCR の結果は、Lcn2 mRNA 発現レベルが M-1 細胞よりも 2L3 で 15.96- 倍高いことを示しました (図 1F)。これは 2L3 マウスで報告されたデータと一致しています [31]。 2 つのグループ間で Slc22a17 mRNA 発現に有意差はありませんでした (図 1G)。ウェスタンブロットの結果は、2L3 細胞が M-1 細胞よりも NGAL の発現レベルが高いことを示しましたが、2 つのグループ間で NGAL-R の発現レベルに有意差はありませんでした (図 1H)。 M-1 および 2L3 細胞の細胞および上清は、ELISA によって細胞溶解物および上清中の NGAL (分泌された NGAL を表す) を定量するために 48 時間培養した後に収集されました。ウエスタンブロットの結果と一致して、ELISAは、2L3がM-1よりも有意に高い細胞内NGALおよび上清中のNGALの分泌を有することを示した(図1I)。

2L3 マウスは野生型マウスよりも高い細胞増殖を示すことが実証されています [17]。 2L3 細胞株も野生型細胞よりも優れた生存率と増殖を示すかどうかを調べるために、MTT および BrdU 取り込みアッセイを実施しました (図 2A ～ C)。代表的な画像は、同じ初期播種数で 48 時間培養した後、M-1 細胞よりも 2L3 細胞のコンフルエンスが高いことを明らかにしました (図 2A)。 MTT アッセイでは、2L3 細胞の生存率が、24 時間および 48 時間培養した M-1 細胞よりも有意に優れていることが示されました (図 2B)。 M-1 細胞と 2L3 細胞の増殖能力を比較するために、BrdU 取り込みアッセイ後、細胞を 24 時間培養しました。これにより、2L3 細胞が M-1 細胞よりも有意に優れた増殖を示すことが示されました (図 2C) 。

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3.2. 2L3 細胞の生存率と増殖に対する mNGAL の添加の影響

外因性 NGAL の投与は、in vitro で嚢胞の成長を減少させることが示されています [25]。我々の以前の研究では、ADPKD マウスモデル (Pkd1L3/L3; NGALTg/Tg マウス) における NGAL の過剰発現が、嚢胞の進行を抑制し、それに関与する一連の分子経路の変化を伴うことを示しました。細胞増殖, アポトーシス、 そして線維症[31]。したがって、MTT アッセイを使用して、2L3 細胞の生存率に対する組換え mNGAL の影響を調査しました (図 3)。大腸菌から精製された組換え mNGAL (シグナルペプチドを含まない) の純度は、まず SDS-PAGE とクマシーブルー染色によって決定されました。これにより、単一の 20- kD バンドと、高濃度での非常に明るい二量体バンドが明らかになりました (図3A）。さらに、細胞培養培地中の mNGAL の安定性をウエスタンブロット法で分析したところ、少なくとも 48 時間培地中での mNGAL の安定性が実証されました (図 3B)。我々は、mNGAL が 8 時間の処理後に対照群と比較して 2L3 細胞の生存率を有意に低下させることに気づきました (図 3C)。この実験では、ラパマイシンをポジティブコントロールとして使用しました。ラパマイシンは、mTOR の阻害剤として認識されており、PKD マウスモデルにおいて上皮細胞の増殖と嚢胞の成長を阻害することが知られています [32]。さらに、BrdU 取り込みアッセイは、24 時間の mNGAL 処理が 2L3 細胞の増殖を有意に阻害することも示しました (図 3D)。細胞増殖は ADPKD の重要な特徴であり、2L3 細胞増殖が mNGAL によって減少する可能性があるという発見は、mNGAL が 2L3 細胞における嚢胞形成をさらに阻害する可能性を示唆しました。

3.3. 2L3細胞へのmNGALの添加により影響を受けるシグナル伝達経路

NGAL と NGAL-R のカップリングは、細胞内の鉄を隔離し、さらにアポトーシスを誘導することが示されています [29]。さらに、NGAL が in vitro および in vivo で ADPKD モデルにおいてアポトーシスを誘導できることが研究で示されています [25、31]。 mNGALが2L3細胞のアポトーシスを誘導できるかどうかを調べるために、フローサイトメトリーによって2L3細胞のアポトーシスを分析しました。 mNGAL が 8 時間の mNGAL 処理後に 2L3 細胞の増殖を阻害したという発見 (図 3D) に基づいて、早い (4 時間) と遅い (12 時間) の両方の時点で 2L3 細胞に対する mNGAL の効果を分析しました。

フローサイトメトリー分析では、以前に実施された MTT アッセイよりもはるかに多くの細胞数と短い培養時間が必要でした。したがって、2L3 細胞を 6- ウェルプレートに播種し、高濃度の mNGAL (600 ～ 1200 μg/mL) を細胞に適用しました。結果は、1200 μg/mL mNGAL は 4 時間および 12 時間の処理後に細胞生存率を有意に阻害したが、600 μg/mL mNGAL は 4 時間の処理後にのみ細胞生存率を阻害したことを示しました (図 3E)。アポトーシスアッセイをフローサイトメトリーによって実行し、アネキシン V-FITC および PI で染色された細胞を検出しました。アネキシン V はホスファチジルセリン (PS) に対して高い親和性を持ち、PS が露出したアポトーシス細胞を識別するために使用されます [33]。染色結果に従って、細胞は正常 (AV-/PI-)、初期アポトーシス (AV+/PI-)、後期アポトーシス (AV+/PI+)、および壊死 (AV-/PI+) に分類でき、以下に示します。四分円図 (図 3F)。アポトーシス初期段階の細胞は無傷の膜を保持していますが、これは膜が崩壊したアポトーシス後期段階の細胞とは異なります[34]。結果は、2L3 細胞のアポトーシス率 (初期 AV+/PI- および後期 AV+/PI+ アポトーシスを含む) が、mNGAL (1200 μg/mL; 図 3F、G) で 12 時間処理した後の対照群と比較して有意に増加したことを示しました。 ）。

図 1. M-1 野生型細胞と 2L3 ADPKD 細胞間の NGAL 発現の比較。 (A) Pkd1 遺伝子の野生型および L3 対立遺伝子の構造。 Pkd1のイントロン30内の最初のloxPの前後のプライマーを使用してPCRジェノタイピングを実施しました。黒三角: loxP; 2 つの loxP 部位が隣接する mc1 プロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子 (mc1-neo) が、Pkd1 のイントロン 34 に挿入されました。(B) M-1 細胞の Pkd1 転写物の PCR ジェノタイピング (473 bp)および2L3細胞（507 bp）。野生型 (+/+)、ヘテロ接合 (L3/+)、およびホモ接合 (L3/L3) マウスの Pkd1 転写物を対照として使用しました。 RT-qPCR では、2L3 の Pkd1 (C) M-1 が大幅に低く、2L3 細胞が同様の形態を示したことが示されました。スケールバー: 100 μm。 (D) M-1 および 2L3 細胞を Lotus Tetragonolobus レクチン (LTL、フルオレセインで標識、緑色) および Dolichos biflorus 凝集素 (DBA、Rhoda Mine で標識、赤色) および DAPI (青色) で染色し、共焦点顕微鏡。スケールバー: 50 μm。 RT-qPCR により、2L3 の Pkd1 (E) 発現レベルが M-1 野生型細胞よりも大幅に低く、Lcn2 (NGAL) (F) 発現レベルが高いことが示されました。 (G) M-1 細胞と 2L3 細胞の間で Slc22a17 (NGAL-R) 発現レベルに有意差はありません。 RQ: 相対定量化=2 −ΔΔCt; Gapdhを各サンプルの内部対照として使用しました。値は M-1 に正規化されました。 (H) ウェスタンブロットの結果は、2L3 であることを示しました。