分泌型好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンは、非分泌型Ⅳと比較してADPKD細胞の嚢胞拡大を阻害する強力な能力を示す
Jun 25, 2024
4. ディスカッション
この研究では、分泌された mNGAL の追加および/または過剰発現が、タンパク質は2L3細胞の増殖を減少させたそしてアポトーシスを上方制御することにより、in vitro で嚢胞の成長を阻害そしてオートファジーと増殖関連シグナル伝達経路の下方制御。 2L3 細胞と同様のマウス腎尿細管の遺伝子座から樹立された M-1 細胞が 2L3 細胞の野生型対照細胞として使用できるかどうかを確認するには、LTL で M-1 細胞と 2L3 細胞をレクチン染色します。 DBA が実行されました (図 1D)。 LTL と DBA は、それぞれマウス腎臓の分化した近位尿細管と集合管を同定するために使用されました [45,46]。この発見は、M-1 細胞が 2L3 細胞と同様の形態 (図 1C) および尿細管の起源 (図 1D) を有することを示しています。したがって、M-1 細胞株が 2L3 細胞の野生型コントロールとして選択されました。
ほとんどの臨床例では、ADPKD 患者は正常な人よりも尿中の NGAL レベルが高くなります [19、47-49]。この研究で使用された ADPKD マウス モデルも、NGAL および NGAL-R の発現レベルが高くなります [31]。 RT-qPCR とウェスタンブロットの両方の結果は、2L3 細胞が M-1 野生型細胞株よりも高いレベルの NGAL を発現していることを示しました (図 1F、H)。一方で、2L3 細胞では NGAL-R 発現レベルに有意差は確認されませんでした。 2 つの細胞株 (図 1G、H)、これは in vivo の結果と一致しません [31]。この違いは、より単純な細胞系では起こらない、マウス組織内の複雑な相互作用によるものである可能性があります。
ウェスタンブロットの結果は、2L3 における mNGAL の直接投与および/または遺伝的過剰発現が ERK 経路を阻害することを示しました。図 4A および 8A に示すように、p-ERK1 (44 kDa) のシグナルは p-ERK2 (42 kDa) よりも弱かったのに対し、ERK1 (44 kDa) は ERK2 (42 kDa) よりも強かったため、顕著な増加を引き起こしました。すべての実験グループにおける p-ERK2/ERK2 を p-ERK1/ERK1 と比較しました。 ERK1 と ERK2 は、細胞増殖に対して異なる影響を与えることが示唆されている ERK の 2 つのアイソフォームです [50]。 ERK1 は細胞の生存と増殖を誘導することが確認されています。しかし、ERK2 は細胞分化を促進し、細胞増殖をブロックします [51]。私たちの研究では、すべてのグループで p-ERK2/ERK2 の比率が p-ERK1/ERK1 の比率よりも著しく高く、これは細胞が分化して増殖を低下させる傾向があることを示しています。しかし、mNGAL の添加と過剰発現の両方により、対照群と比較して p-ERK1/ERK1 および p-ERK2/ERK2 の両方の比率が劇的に低下し、p-ERK/ERK の比率が大幅に低下したため、mNGAL の効果が示されました。細胞増殖の阻害に。
2L3 細胞における嚢胞形成の特性評価と治療評価のための 3D 培養プラットフォームを確立するために、いくつかの条件が試みられました。 3D 培養用のマトリゲルの濃度が、in vitro で形成される構造嚢胞および尿細管の割合に影響を与えることが実証されています [25、52、53]。私たちの研究では、2L3 細胞の最適な嚢胞構造形成を示すには 40% マトリゲルが最適な配合であることがわかりました。 3D 培養の埋め込みパターンや上部パターンなど、いくつかの条件がありました [54]。嚢胞を分析するためのより適切かつ簡単な方法として、オントップ法 (サンドイッチ状のパターン) を選択しました (図 6)。しかし、私たちの経験では、14日目まで誘導剤を使用せずに3D培養で培養した場合、2L3細胞の嚢胞は十分に大きくならなかったことを示しました。フォルスコリンは、アデニリルシクラーゼ（AC）を活性化して環状アデノシン一リン酸（cAMP）を増加させることにより嚢胞形成を誘導するために一般的に使用されます。 [11,55]。したがって、私たちの研究では、精神的治療の前にフォルスコリン（20μM）を使用して2L3細胞の嚢胞形成を誘導しました。
我々の以前の研究では、2L3 マウスにおける腎臓特異的 NGAL の過剰発現は、2L3 マウスの嚢胞サイズではなく嚢胞数を減少させることによって ADPKD の進行を遅らせることができることを示しました [31]。本研究では、メンタルの添加により、嚢胞の直径、面積、および大きな嚢胞の割合が抑制されることにより、2L3 細胞の嚢胞拡大が有意に抑制されました（図 6F、G、I）が、総嚢胞の増加率には有意差はありませんでした。嚢胞数 (図 6H)。 3D 培養における 2L3 嚢胞の進行の結果は、in vivo の結果と一致しました。ただし、mNGAL 処理は 3D 培養における 2L3 細胞の嚢胞増殖を阻害しましたが、MTT アッセイでは以前の 2D 実験 (600 μg/mL) よりも高濃度の mNGAL (2 mg/mL) (図 6) を使用しました。細胞生存率に対する mNGAL の効果 (図 3)。我々は、大腸菌から精製された組換えmNGALには翻訳後修飾が欠けており[56,57]、その結果、組換えmNGALの生物活性が低いと推測した。 pN + LS および pN - LS 構築物のトランスフェクションによる 2L3 細胞における NGAL の過剰発現は、この疑問の解明に役立つ可能性があります。
2L3 細胞の嚢胞拡大を抑制するために 3D 培養で使用した高濃度の mNGAL (2 mg/mL) (図 6) が、mNGAL の翻訳後修飾の欠如に起因するかどうかを判断し、NGAL が分泌されて相互作用する必要があるかどうかをテストするため。アポトーシスを誘導し、嚢胞の進行をさらに阻害するNGAL-R、pN + LSおよびpN - LS構築物を2L3細胞にトランスフェクトし、分泌および非分泌NGALタンパク質を過剰発現させた(図7)。ブラストサイジン選択の 1 週間後に、プールされたトランスフェクト細胞を回収しました。pN + LS と pN - LS の両方のトランスフェクションにより、Lcn2 (内因性および外因性 NGAL の両方を含む合計) および Lcn2-c-myc (外因性 NGAL を含む合計) の mRNA 発現レベルが大幅に増加しました。 NGAL）を対照群と比較したところ（図7F、G）、pN + LS群とpN - LS群の間でLcn2およびLcn2-c-mycに有意差はありませんでした（図7F、G）。 pN + LSおよびpN - LSグループにおけるLcn{{20}}mycの発現は、2L3細胞における発現よりも約8500-倍高かった(図7G)。しかし、pN + LSおよびpN - LSにおけるLcn2の発現は、2L3細胞におけるものよりも約1.5-倍高かった(図7F)。理論的には、Lcn2-myc は 2L3 細胞には存在しないため、RT-QPCR による発現レベル（バックグラウンド）が低くなります。その結果、pN + LS細胞およびpN - LS細胞におけるLcn2-mycの相対比は、2L3対照群よりも著しく高かった(約8500倍)。その結果、Lcn2とLcn2-mycの相対比の間に大きな差が生じます。さらに、pN + LSおよびpN - LS細胞におけるLcn2の発現比（pN + LSはpN - LSの0.91-倍であった）は、Lcn2-c-mycの発現比と同様であった。 (pN + LSはpN - LSの1.01-倍でした)(図7F、G)。 pN + LS細胞およびpN - LS細胞における細胞内NGALタンパク質発現は、対照群と比較して増加し(図7I)、pN + LS群とpN - LS群の間に有意差はなかった。 pN + LS および pN - LS グループにおける総 NGAL タンパク質発現のウェスタンブロット結果 (pN + LS は pN - LS の 0.{60} 倍でした) (図 7I) は、RT-qPCR の結果と一致しました。 (pN + LSはpN - LSの0.91-倍でした)(図7F)。これらの結果によれば、ｐＮ ＋ ＬＳ細胞およびｐＮ − ＬＳ細胞におけるＮＧＡＬ（総タンパク質および外因性タンパク質の両方）のレベルは同様であり、このことは、さらなる実験において２つのグループを比較する必要があることを示した。
我々は、シグナルペプチドのないNGALの過剰発現は、細胞内NGAL発現レベルが高いにもかかわらず、NGAL分泌を増加させないと予測した。しかし、培養物からの上清を使用したELISAの結果は、pN + LS細胞とpN - LS細胞の両方が、2L3対照細胞よりも有意に高いレベルの分泌NGALを有していたことを示した(図7J)。一方、pN - LS細胞によって分泌されたNGALの量は、は、ｐＮ ＋ ＬＳ細胞のそれよりも有意に低かった（図７Ｊ）。これらの結果は、細胞内で高レベルの細胞内 NGAL mRNA およびタンパク質が同定されたものの、シグナルペプチド (pN - LS) を持たない NGAL の過剰発現が NGAL の分泌を制限したことを明らかにしました (図 7F、I)。 ＢｒｄＵ取り込みの結果は、ｐＮ ＋ ＬＳ細胞よりもｐＮ − ＬＳ細胞の有意に高い増殖を示した（図７Ｋ）。
NGAL の細胞内量と分泌量は、2L3 細胞よりも pN + LS でそれぞれ約 1.6- 倍と 2.2- 倍高かった (図 7I、J)。 2L3細胞増殖と比較したpN + LSの(図7K)。しかし、2L3 細胞における NGAL の細胞内量と分泌量は、M-1 細胞よりもそれぞれ約 4- 倍と 5.3- 倍高かった (図 1H、I)。細胞増殖は、M-1 細胞よりも 2L3 で観察されました (図 2C)。 2L3 細胞で保護的な役割を果たす NGAL の発現と分泌の増加は、Pkd1 ノックアウトに起因する細胞増殖を阻害するには不十分であると考えられますが、pN + LS での NGAL の発現と分泌の増加は、増殖抑制を達成するための補足的な NGAL を提供します。我々の以前の研究では、Pkd1L3/L3 マウスは、Pkd1+/+ マウスよりも腎臓の NGAL タンパク質および増殖細胞核抗原 (PCNA) レベルが有意に高かった[31]。それにもかかわらず、Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg マウスの腎臓の NGAL タンパク質レベルは Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ マウスの約 2- 倍であり、NGAL の過剰発現により Pkd1L3 の PCNA レベルが著しく低下しました。 /L3 × NGALTg/Tg は、Pkd1L3/L3 × NGAL+/+ マウスよりも嚢胞の成長を阻害し、生存日数を延長しました [31]。 NGAL は、ADPKD モデルにおける増殖増加の阻害において保護的な役割を果たしているようですが、内因性 NGAL 発現は不十分であり、外因性 NGAL の補充が役立ちます。
3D 培養の結果 (図 10) によると、pN + LS グループと pN - LS グループの両方が、直径 (図 10C)、面積 (図 10D)、および大きな嚢胞 (直径 > 100 μm) の割合を低下させることによって嚢胞の成長を阻害しました。 (図 10F)、数字ではありません (図 10E)。この所見は、細胞増殖阻害には２Ｌ３細胞からのｍＮＧＡＬの分泌が必要であるため、ｐＮ ＋ ＬＳのみが嚢胞拡大を阻害し、ｐＮ − ＬＳは阻害しないという我々の疑いと矛盾する。しかし、pN - LSによる嚢胞拡大の阻害は、pN + LSよりも弱く（図10B〜D）、これは、分泌型mNGALの過剰発現が、非分泌型mNGALのそれよりも3D培養における2L3細胞の嚢胞拡大を阻害する優れた能力を有することを明らかにした。 。 3D 培養では、pN - LS グループと比較して pN + LS グループで嚢胞拡大の強力な抑制が見られますが、p-AKT/AKT では pN - LS よりも pN + LS の効果が優れていることを確認するのは困難です (図 8B) ）、ｐ−ＣＲＥＢ／ＣＲＥＢ（図８Ｃ）およびｐ６２（図９Ｄ）。 NGAL と NGAL-R の共役は細胞内の鉄を隔離し、さらにアポトーシスを誘導することが実証されており [29]、これは細菌感染に対する自然免疫系の鉄枯渇戦略に関連している [30]。我々は、分泌型mNGALはNGAL-Rとの相互作用を通じて2L3細胞のアポトーシスを誘導するが、非分泌型mNGALはNGAL-Rと相互作用してアポトーシスを誘導できないと提案した（図9A、B）。 Ras/B-Raf/MEK/ERK [10,11] および AKT/mTOR [38] 経路が ADPKD 細胞で上方制御され、細胞増殖の増加と嚢胞の拡大につながることが実証されています。我々の結果は、分泌されたmNGALがERK経路(図8A)およびAKT(図8B)経路を阻害し、非分泌mNGALがERK経路を不活性化した(図8A)ことを示した。これは、NGAL-R を介した ERK 経路の精神的不活性化は必要ではない可能性があることを示唆しています。 2L3 細胞における NGAL-R のノックアウトは、この疑問を探るために実行されます。
さらに、2L3細胞におけるmNGALの過剰発現は細胞嚢胞の拡大を阻害し(図10)、高濃度のmNGAL(2mg/mL)による効果と比較して相対的に低いNGAL分泌(2.27ng/mL)で生じた(図7J)。 mL) は、以前の 3D 培養実験で適用されました (図 6)。この結果は、嚢胞の拡大を阻害するために高用量の mNGAL を必要とした以前の実験で使用された大腸菌由来の mNGAL の翻訳後修飾が欠如しているためである可能性があります (図 6)。 mNGALの翻訳後修飾が大腸菌からのより多くの組換えmNGALの要求の原因であるかどうかをさらに調べるために、マウス細胞株から分泌されたmNGALを含む馴化培地をさらなる研究で使用する予定です。
本研究では、RT-qPCR、ウェスタンブロッティング、ELISA、BrdUの取り込み、および3D培養に使用されるpN + LSおよびpN - LS細胞は、混合集団内の導入遺伝子発現レベルが異なる混合ポリクローナルプールから取得されました。クローン細胞を使用する上記の方法によるADPKD 2L3細胞におけるmNGALの機構の同定は、ADPKDの将来の臨床治療の戦略を見つけるのに役立つはずである。
5. 結論
この研究では、不死化 ADPKD 細胞株を使用して、NGAL の存在下で嚢胞の進行が減少する根本的なメカニズムを調査しました。組換え mNGAL の添加により、ADPKD 細胞の細胞増殖が阻害されました。病理学的分析により、mNGAL が ADPKD 細胞の増殖を減少させ、アポトーシスおよびオートファジー経路を誘導することが示されました。さらに、嚢胞の進行を特定するために 3D 細胞培養プラットフォームが確立され、組換え mNGAL の添加により嚢胞の拡大が抑制されることが示されました。さらに、分泌型 mNGAL (pN + LS) の過剰発現は、非分泌型 mNGAL (pN - LS) の過剰発現よりも ADPKD 細胞の嚢胞拡大の阻害に強い効果がありましたが、どちらの形態も嚢胞の直径、面積、および大きなサイズの嚢胞の割合を低下させました。増殖、アポトーシス、オートファジーへの影響も同様です。我々は、ADPKD細胞において、分泌型mNGALは非分泌型mNGALよりも嚢胞拡大を抑制する顕著かつ一貫した能力を持っていると結論づけた。私たちの研究は、ADPKD の将来の臨床治療戦略を特定するのに役立つ可能性があります。
補足資料: この記事の補足ビデオはオンラインで見つけることができます (1) ビデオ S1: 3D 培養における嚢胞の構築: https://reurl.cc/Kjy8rq (2021 年 11 月 26 日にアクセス)。 (2) ビデオ S2: 3D 培養における嚢胞の Z スタック セクション: https://reurl.cc/VXGY5y (2021 年 11 月 26 日にアクセス)。補足グラフ:図 1D のネガティブ コントロール (LTL および DBA 染色を除く) は、https://reurl.cc/LpMmje (2021 年 11 月 26 日にアクセス) でオンラインで見つけることができます。著者の寄稿: Conceptualization、W.-YJ、HMH-L。そしてY.-YC。データキュレーション、H.-YC;形式分析、H.-YC;資金調達、HMH-L。そしてY.-YC。方法論、H.-YC、W.-YJ、EW、C.-MH、HMH-L。そしてY.-YC。プロジェクト管理、H.-YC および HMH-L.。リソース、W.-YJ、S.-TJ、Y.-YC。監督、HMH-L。視覚化、H.-YC;執筆者：原案、H.-YC および HMH-L.執筆、レビュー、編集、H.-YC および HMH-L。すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。資金提供: この研究は、科学技術省 (MOST) および大学進学本部からの助成金 107-2622-B-006-005- CC2 および 108-2622-B-006-002- CC2) によって資金提供されました。台湾、台南の国立成功大学（Yuan-Yow Chiou）出身。治験審査委員会の声明: 該当なし。インフォームドコンセント声明: 該当なし。データの入手可能性に関する声明: 研究中に生成されたデータは、要求に応じて対応する著者から入手できます。謝辞：著者らは、MOSTの後援の下、国立台湾師範大学の分子イメージングコア施設の支援に感謝します。ウイルス粒子、プラスミド、および関連サービスを提供してくださった台湾の中央研究院国家 RNAi コア施設に感謝します。グラフィック編集を手伝ってくれた Shu-Wen Lo に感謝します。利益相反: 著者は利益相反がないことを宣言します。
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