ミツバチの社会的免疫：巣の仲間間で細菌性病原体の断片を伝達する媒体としてのローヤルゼリー
May 05, 2023
概要
社会的免疫は、コロニーのメンバーが病原体からお互いを守ることを可能にする一連の行動的および生理学的特性であり、巣の仲間間での免疫学的化合物の経口伝達が含まれます。 ミツバチにおいて、ローヤルゼリーは働きバチの一部によって産生される腺分泌物であり、女王蜂と若い幼虫に与えられ、多くの抗菌化合物が含まれています。 関連する社会免疫の形態である世代間免疫プライミング（TGIP）により、女王バチは病原体の断片を発育中の卵に移すことができ、そこで胚の免疫系によって認識され、新しい子孫に高い病原体耐性を誘導します。 これらの病原体の断片は、看護師がローヤル ゼリーを合成するためにも使用する卵黄前駆体タンパク質であるビテロゲニン (Vg) によって輸送されます。
したがって、ローヤルゼリーは、病原体の破片を働きバチから他の巣の仲間に運ぶ手段として機能する可能性があります。 これを調査するために、私たちは最近、摂取した細菌が看護師のゼリー生成腺に輸送されることを示しましたが、今回は病原体の断片がローヤルゼリーに取り込まれることを示します。 さらに、病原体細胞を摂取すると、ローヤルゼリーに含まれる抗菌ペプチドであるディフェンシン-1のレベルが高くなることが示されました。
免疫化合物の経口投与は、ヒトの免疫機能に重大な影響を与える可能性があります。 これらの化合物は、体の免疫システムを強化または調節することで免疫力を向上させることができます。 免疫とは、免疫細胞や抗体などの防御機構を含む、病気に対する体の抵抗力です。 経口免疫化合物は、免疫細胞の活動を活性化し、体内の抗体の産生を増加させ、病原性細菌やウイルスの増殖を阻害することで、免疫力を向上させ、感染のリスクを軽減します。 さらに、免疫化合物の経口投与は、炎症を軽減し、疾患に伴う痛みや不快感を軽減し、それによって生活の質を向上させることができます。 したがって、免疫化合物の経口投与と免疫の間には強い関係があります。 このことから、免疫力の向上に注意を払う必要があることがわかります。 カンクサは免疫力を高める効果があります。 肉中の多糖類は人間の免疫系の免疫反応を調節し、免疫細胞のストレス能力を改善し、免疫細胞の殺菌効果を高めることができます。
キーワード:
ミツバチ、社会的免疫、ローヤルゼリー、アメリカ悪臭。
序章
ローヤルゼリーは、ミツバチのカースト発達において重要な役割を果たしているため、生物学者を長い間魅了してきました。 この腺分泌物は、看護師として知られる労働者カーストの一部によって生成され、女王蜂の発育から成体生涯を通じて供給されます。一方、労働者となる予定の幼虫は、より多くのローヤルゼリーに切り替える前に、生後最初の3日間ローヤルゼリーを与えられます。花粉ベースの食事 (Johansson、1955; Haydak、1970; Townsend および Lucas、1940)。 分析化学手法が進歩するにつれ、科学者たちはローヤルゼリーの栄養成分を研究し始め、ローヤルゼリーには女王蜂や幼虫を病気から守る多くの病原体を殺す化合物が含まれていることが判明した（Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004;Fujiwara）ら、1990; オカモトら、2003; ロマネリら、2011; 杉山ら、2012; Vucevic ら、2007）。 巣の仲間の間での抗病原性化合物の伝達は社会的免疫の一形態であり、コロニーのメンバーが病原体からお互いを守るのに役立つ一連の行動的および生理学的特性である(Cremer et al., 2007)。
社会免疫の関連形態である世代間免疫プライミング（TGIP）も、近年多くの注目を集めている（Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López et al.、2014; Knorr et al.、2015; Salmela et al.、2015)。 ここでは、病原体の攻撃から生き残ったメスの昆虫が病原体の断片を卵に移し、より病気に強い子孫を生み出すことができます。 これらの病原体の断片には、微生物細胞の細胞壁に見られる構造成分である病原体関連分子パターンが含まれており、これが発育中の子孫の免疫反応を引き起こします。 TGIPはミツバチで実証されているが、研究は女王蜂への接種に依存しており、これには問題があった。女王蜂がローヤルゼリーのみを食べており、潜在的にローヤルゼリーを摂取する機会がないことを考えると、自然条件下でどのようにして病原体を女王蜂に接種するのかという問題が生じた。彼女の採集者が集めた汚染された花蜜や花粉でしょうか？ 私たちのグループによる大きな発見は、新たな経路の可能性を示唆しました。 女王バチは、看護師がローヤルゼリーを合成するためにも使用する卵黄前駆体タンパク質であるビテロゲニン（Vg）（Salmela et al., 2015）を使用して、病原体の断片を卵に移入します（Amdam et al., 2003）。
したがって、ミツバチは、ローヤルゼリーを看護師と女王蜂の間で病原体の断片を伝達する媒体として、また幼虫をコロニーレベルの免疫経路の一部として使用する可能性があります。 この経路を解明するための最初のステップとして、我々は、細菌を摂取した看護師が細菌を中腸からゼリー生成腺に移動させることができ、vg発現をノックダウンすることでこのプロセスが妨げられることを示した（Harwood et al., 2019）。 現在、私たちは、細菌性病原体を摂取した看護師がそれらをローヤルゼリーに組み込むことができるかどうか、また病原体を摂取することによってローヤルゼリー中の他の抗菌成分の濃度も増加するかどうかを判断しようとしています。
ミツバチの免疫経路を理解することは、生物生物学の分野だけでなく、人間の食糧安全保障にとっても重要です。 ミツバチは農業における主要な花粉媒介者であり、米国だけでも作物の価値を年間少なくとも 150 億ドル増加させています (USDA プレスリリース、2020 年 4 月 6 日)。
しかし、農薬への曝露や栄養不良などの複数のストレス要因により、年間のコロニー損失の多さが米国の養蜂家を悩ませ続けています（米国農務省、2019年）。 しかし、ハチの害虫や病原体も主な原因であり、滅んだコロニーから検出されることがよくあります（米国農務省、2019年）。 これらの病原体には多数の細菌、真菌、ウイルスが含まれますが、その多くには薬理学的治療法がありません。 社会的免疫が病原体感染をどのように媒介するかを理解できれば、より包括的な治療計画が可能になり、コロニー損失の一因となる病気の負担を軽減できる可能性があります。
社会的免疫のメカニズムを理解することが重要です。 2021 年 2 月 17 日に承認され、個々のミツバチに存在する免疫学的防御を補完します。
ミツバチには、病原体の侵入をブロックする防水クチクラのような構造的障壁から始まる、いくつかの防御層があります (Moret and Moreau、2012)。 摂取された病原体は、消化と吸収を担う器官である中腸に到達し、ここで別の物理的障壁である周縁栄養基質に直面します（Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009）。 これは中腸上皮細胞から分泌されるキチン質の物質で、病原体細胞のような大きな粒子が吸収されるのを防ぐふるいの役割を果たします。
病原体がこれらの物理的障壁を突破すると、いくつかの細胞性および体液性免疫反応を活性化する病原体パターン認識受容体によって検出されます。 細胞防御には、血球による食作用が含まれる場合がありますが (Evans and Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine and Strand, 2002)、体液性反応には、外来粒子をカプセル化するためのメラニンの生成が含まれる場合があります (González-Santoyo および Córdaba-Aguilar、 ２０１２）および病原体を直接殺す抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の生成（ＢｕｌｅｔおよびＳｔｏｃｋｌｉｎ、２００５；Ｂｕｌｅｔら、１９９９；Ｅｖａｎｓら、２００６）。 メラニン化反応は、ミツバチ毒セリンプロテアーゼ（Bi-VSP）がメラニンの生成につながるフェノールオキシダーゼカスケードを活性化するときに誘発されます（Choo et al.、2010）。 リゾチームやディフェンシン-1などのAMPは、Tollまたは免疫不全（IMD）経路の活性化後に誘導されます（De Gregorio et al., 2002）。
強力な抗病原体兵器にもかかわらず、ミツバチは、主に社会免疫の進化のおかげで、単独のミツバチ種よりも免疫関連遺伝子が少ない（Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006）。 ローヤルゼリーには、Bi-VSP、リゾチーム、ディフェンシン-1など、今議論した酵素やペプチドの多くが含まれています。また、病原体を殺す過酸化水素を生成するグルコースオキシダーゼも含まれています(Fontana et al., 2004;Fujiwara)ら、1990;Romanelli ら、2011;古沢ら、2008;Han ら、2011;Fujita ら、2012）。 この強化食品は、コロニーの最も脆弱なメンバー、つまり免疫防御がまだ発達中の若い幼虫にとって特に重要です。 例えば、若い幼虫は、プロフェノールオキシダーゼ（Chan and Foster、2008; Chan et al.、2009）（メラニン化カスケードにおいて重要）およびAMP（Chan and Foster、2008）のレベルが低く、まだ成熟している中腸および周栄養性マトリックスにより、中腸上皮が破壊されやすくなります（Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez and Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016）。
その結果、幼虫は、成体にとってはまったく無害ないくつかの病気にかかりやすくなります。 これには、胞子を形成するグラム陽性細菌であるパエニバチルス幼虫によって引き起こされるアメリカの悪臭が含まれます（Genersch、2010; Hansen and Brødsgaard、1999）。 アメリカの腐葉土感染は、コロニーにとって致命的であるだけでなく、養蜂家にとってもコストがかかる。胞子は回復力があり、何年も生存し続けるため、養蜂家は感染した巣を破壊せざるを得なくなる。 したがって、幼虫は、病原体を殺す化合物、または免疫プライミングを誘発できる病原体粒子を補充した餌から恩恵を受ける立場にあります。
この研究では、私たちの目的は 2 つありました。1 つは、アメリカの腐葉土栄養細胞を摂取する看護師がローヤル ゼリーに病原体の断片を取り込むことができるかどうかを判断すること、そして 2 つ目は、これによりローヤル ゼリーに含まれる免疫タンパク質のレベルが高くなるかどうかを確認することです。 この目的を達成するために、私たちは看護師に蛍光標識して熱で死滅させたP.幼虫細胞を与え、その後彼らが産生するローヤルゼリーを検査しました。 蛍光顕微鏡を使用してローヤルゼリー中の細菌細胞断片の存在を確認し、質量分析法を使用して攻撃コロニーと対照コロニーからのローヤルゼリーのプロテオミクスプロファイルを比較しました。 特に、攻撃を受けたコロニーからのローヤルゼリーには、免疫タンパク質であるグルコースオキシダーゼ、Bi-VSP、リゾチーム、ディフェンシンが多く含まれるという仮説を検証しました-1。
材料および方法
病原菌の培養
P. 幼虫の栄養細胞はヨーテブルク大学の培養コレクションから入手し、通常の細菌の増殖条件下で培養しました。 簡単に説明すると、細胞をMYPGブロスに懸濁し、振盪インキュベーター内で37℃で一晩保持した後、MYPG寒天上に播種し、37℃で1週間インキュベートした。 その後、栄養細胞を採取し、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁し、その後オートクレーブで加熱死滅させた。 次いで、製造業者の指示に従って、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ａ１００２６）を使用して、得られた死菌細胞を蛍光色素に結合させた。 染色後、P.幼虫細胞を1×PBSに10mg ml-1の濃度まで懸濁し、使用するまで4℃で保存した。
ミツバチと給餌実験
自然交配したヨーロッパミツバチ、Apis mellifera Linnaeus 1758 は、フィンランドのヴィッキキャンパスにあるヘルシンキ大学の標準的なラングストロス巣箱で飼育されました。 これらの標準的なラングストロス巣箱は、ミニ交配巣箱に収容された女王のいない小さなコロニーへのドナーとして機能しました。 これらの小さな女王のいないコロニーを確立するために、12cm×12cmの大きさの1-日齢の幼虫を含む雛巣の一部をドナー巣箱から切り出し、ミニ交配Nucボックスに移しました。 およそ 100 ～ 200 人の看護師も同じドナー巣から移送され、ミニ嵌合 Nuc ボックスに配置されました。 看護師は、ドナー巣箱の雛房に入り、幼虫に餌を与えているのが見られた人物であると特定された。
合計で N{{0} 個の小さな女王のいないコロニーが確立され、それぞれが別のドナー巣から採取されました。 看護師が新しい女王を作るためにより多くのローヤルゼリーを生産するよう刺激するために、コロニーを女王なしとした(Sahinler and Kaftanoglu、1997)。 看護師と若い幼虫は、ミニ交配Nucボックスに3日間密閉され、天井から吊り下げられたシリンジフィーダー内の30パーセントのスクロース溶液が与えられました。 N=3 コロニーには対照食が与えられましたが、N=3 には蛍光標識された P. 幼虫がスクロースに加えられ、最終病原体濃度が 0.6 mg ml-1 になりました。 対照食および病原体を含む食餌には、毎日新鮮な食物を補給した。 3 日後、新たに堆積したローヤル ゼリーが各コロニーの働きバチから採取され、蛍光顕微鏡法またはプロテオミクス分析という 2 つのワークフローのいずれかに分割されました。
蛍光顕微鏡検査
各コームからのローヤルゼリーを 200 μl 反応チューブに移しました。 各巣から得られるゼリーの量を推定するために、30 本の反応チューブに 1 ～ 30 μl の範囲で徐々に量を増やしながらあらかじめ充填し、2 人の観察者にどの水量がローヤル ゼリーの量と一致するかを独立して盲目的に評価してもらいました。 6 つのケースすべてで、各ローヤル ゼリー サンプルは 2 人の観察者から同じ量の推定値を受け取りました。 次に、各ローヤル ゼリー サンプルを 1× PBS (pH 7.4) で最終濃度 10 体積パーセントまで希釈し、ボルテックスしました。 次に、サンプルを血球計に適用し、Leica DM6000 蛍光顕微鏡で検査しました。 血球計数器では視野が9等分されており、隅の4つの部分と中央の部分の計5つの部分を観察しました。 これにより、次の式を使用して、ローヤル ゼリー (C) 1 マイクロリットルあたりの蛍光粒子の濃度を計算することができました。
ここで、P は各サンプルで観察された陽性蛍光粒子の総数、S は血球計数器で観察された正方形の総数 (N{{0}})、V は血球計数器で観察された各正方形の体積です。 (0.1 μl)、D はローヤル ゼリーの希釈率 (10 倍希釈) です。 すべてのサンプルは同一の顕微鏡設定で観察されました。
カメラは {{0}} ビット解像度 (Waters、2009) に設定されており、0 ～ 65,535 の範囲の輝度強度値が得られます。 病原体と食餌サンプル中の陽性の蛍光シグナルを特定するには、まずバックグラウンド ノイズのベースライン レベルを確立する必要がありました。このレベルを超えると、シグナルが本物の蛍光なのか、それとも単なるアーチファクトなのかを判断できます。 これを行うために、対照食サンプルの各画像の強度値を調べ、それぞれの画像で最大強度値から最小強度値を減算して、バックグラウンドノイズの範囲を取得しました (Waters、2009)。 次に、すべての対照食サンプル画像を比較して、バックグラウンドノイズの範囲の平均値と標準偏差を取得しました。 その後、病原体食サンプルで観察されたシグナルは、平均バックグラウンド強度範囲より少なくとも 3 標準偏差 (P 0.01 以下) 大きい場合、バックグラウンド ノイズを上回る陽性の蛍光シグナルであるとみなしました。 平均 (SD) バックグラウンド強度範囲は 329±27 でした。
追加のポジティブコントロールとネガティブコントロール
標識細菌がローヤル ゼリー内で蛍光を発することを確認するために、ヨーロッパおよび北米の複数の地域 (オーストリア、ノルウェー、アリゾナ、米国イリノイ) からローヤル ゼリーのサンプルを収集し、PBS バッファーで 10 パーセントに希釈しました。標識された細菌 (1 体積パーセント) をサンプルに直接追加しました。 標準 pH 7.4 (上で使用したもの)、またはローヤル ゼリーの酸性度に一致する低下した pH 4 の PBS 緩衝液を使用しました。0ラベルキットのメーカー。 さらに、蛍光の観察が顕微鏡アーチファクトや材料成分の自己蛍光によるものではないことを確認するために、追加のネガティブコントロール (pH 4.0 PBS、標識細菌なし) も実行しました。 使用した緩衝液のpHに関係なく、標識細菌を添加すると、すべての地理的地域のローヤルゼリーサンプルが蛍光を示すことがわかりました（図S1）。 この顕微鏡検査作業は、Axiocam HRm モノクロ カメラを使用して Zeiss AxioZoom V16 で実行されました。
プロテオミクス解析のためのサンプル調製
ローヤルゼリーサンプルは、150 μl 8 mol l-1 尿素を加えて希釈し、水浴中で超音波処理しました。 タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを使用して最終容量 100 μl で 2.1 mg ml-1 に調整されました。 システイン結合は、45 mmol l-1 ジチオスレイトール (#D0632、Sigma-Aldrich) を用いて 37 ℃で 20 分間還元され、0.1 mol l-1 ヨードアセトアミド (#57670 Fluka、Sigma-Aldrich) を用いて室温でアルキル化されました。 0.75 μg トリプシン (シーケンシング グレード修飾トリプシン、V5111、Promega) を加えてサンプルを 37 度で一晩消化しました。 消化後、製造業者のプロトコールに従って、C18マイクロスピンカラム(Harvard Apparatus)を用いてペプチドを精製した。 乾燥ペプチドを緩衝液Ａ（１パーセントアセトニトリル中の０．１パーセントトリフルオロ酢酸３０μｌ）中で再構成した。
タンデム質量分析計と組み合わせた液体クロマトグラフィー (LC-MS/MS)
分析は、ナノエレクトロスプレー イオン源 (サーモフィッシャーサイエンティフィック)。 LC-MS/MS サンプルは、2 cm C18- Pepmap トラップ カラム (Thermo Fisher Scientific) とそれに続く 15 cm C18- Pepmap 分析カラム (サーモフィッシャーサイエンティフィック)。 直線分離勾配は、5 パーセントのバッファー B (98 パーセントのアセトニトリル中の 0.1 パーセントのトリフルオロ酢酸) で 5 分間、35 パーセントのバッファー B で 60 分間、80 パーセントのバッファー B で 5 分間、そして 100 パーセントのバッファー B で 10 分間で構成されました。速度は 0.3 µl min−1 です。 LC-MS/MS の実行ごとに、6 μl のサンプルを注入して分析しました。 フル MS スキャンは、オービトラップ アナライザーの通常の質量範囲で分解能 60、000 で取得され、続いてイオン トラップ内の CID-MS2 上位 20 個の最も強力な前駆体イオン (エネルギー 35) が取得されました。 データは、LTQ Tune ソフトウェアを使用して取得されました。
タンパク質の同定
ショットガン プロテオミクス アプローチでは、タンパク質が酵素によって小さなペプチドに消化され、これらのペプチドが注釈付きのゲノム内のタンパク質と照合されます。 これらのペプチド配列の一部は複数のタンパク質に共有される場合がありますが、一部はプロテオーム内の単一のタンパク質に固有です。 私たちの分析により、少なくとも 1 つのペプチド スペクトル一致 (PSM) と 1 つの固有のペプチドを含む合計 496 のタンパク質ヒットが得られました。
偽陽性をさらに除外するために、他のローヤルゼリープロテオミクス研究で行われているように、少なくとも 2 つの固有のペプチドを持つタンパク質のみを信頼できるタンパク質ヒットとみなしました (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014)。その理由の一部は、サンプル調製ステップの実験的変動が、質量分析サンプル中の最も存在量の少ないタンパク質に最も大きな影響を与えるためです (Zhang et al., 2010)。 タンパク質にはAmel_4.5ミツバチゲノムのアノテーションが付けられており、UniProtとGenBankを使用してその正体と機能を確認しました。 次に、対照食と病原体食のローヤルゼリーに含まれる 4 つの免疫関連タンパク質、グルコースオキシダーゼ、BiVSP、リゾチーム、ディフェンシンの存在量を比較しました-1。
統計分析
対照食と病原体食ローヤルゼリー間の免疫関連タンパク質の量を評価するために、選択したタンパク質の PSM 値を比較しました。 限られたサンプルサイズ（治療ごとにN=3）に対処するために、ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を使用しました。 私たちが計画した仮説では、これらの選択された免疫タンパク質が病原体を与えられたコロニーからのローヤルゼリー中で上方制御されるだろうと予測したため、片側比較を使用しました。 タンパク質存在量の変化倍数は、(PSM病原体 - PSMcontrol)/PSMcontrolとして計算されました。 すべての分析は R (バージョン 3.5.2) で実行されました。
結果
ローヤルゼリー中の病原体断片
すべての病原体と食餌のコロニーから採取したローヤル ゼリー サンプルには、確立したバックグラウンド蛍光閾値 (「材料と方法」を参照) よりも大幅に高い強度で蛍光を発する粒子が含まれていることがわかり、細菌の断片がローヤル ゼリーに取り込まれたことが示唆されました。 対照食ローヤルゼリーサンプルには、この閾値を超える粒子は含まれていませんでした (図 1)。 平均して、病原体食のコロニーにはローヤル ゼリー 1 マイクロリットルあたり 66.67 ± 28.87 (平均±標準偏差) の蛍光粒子 (N=3) が含まれていましたが、対照給餌コロニーにはローヤル ゼリー 1 マイクロリットルあたり 0 個の蛍光粒子がありました ( N=3) (図 1)。
プロテオミクス
合計 496 個のタンパク質ヒットが見つかり、そのうち 44 個には少なくとも 2 つの固有のペプチドが割り当てられていました (表 1)。 すべてのサンプルで最も豊富なタンパク質は、予想どおり主要なローヤル ゼリータンパク質でした。 一般に、サンプルで観察されたタンパク質は、ローヤルゼリーの他の最近のプロテオミクス研究と非常に一致していました（Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014)、ただし、この研究では他では報告されていないタンパク質がいくつか同定されています。 これらには、ミツバチ毒腺組織にも見出される鉄輸送分子であるトランスフェリン (Kucharski and Maleszka、2003) (Peiren et al.、2008) が含まれます。 セルピン-5、他の昆虫においてプロフェノールオキシダーゼの活性化を調節することが知られているセリンプロテアーゼ阻害剤（Li et al., 2016）。 アーティチョーク、キイロショウジョウバエの幼虫の移動機能を持つ化学感覚タンパク質（Andrés et al., 2014）。 そしてNPC2-のような、ミツバチにおける同種親機能を暗黙的に持つコレステロール輸送体である(Thompson et al., 2006)。 また、病原菌食ローヤル ゼリー サンプルから、グルタチオン ペルオキシダーゼ、ペプチジル プロリル シス トランス イソメラーゼ、および特徴づけられていないタンパク質 (LOC725202) という 3 つの追加タンパク質も見つかりました。 これらのタンパク質は対照食サンプルからも検出されましたが、2 つの固有のペプチドを持つという基準を満たしていませんでした (表 1)。
対照食サンプルと病原体食サンプルを比較すると、ローヤルゼリー内の相対的なタンパク質量の変化はほとんど観察されませんでした (表 1)。 我々の焦点免疫タンパク質のうち、グルコースオキシダーゼ（U=7、P=0.9）、Bi-VSP（U=1.5、 P=0.134)、またはリゾチーム (U=2、P=0.184)。 しかし、対照食サンプルよりも病原体食サンプルの方がかなり多くのAMPディフェンシン-1を検出しました(U=0、P=0.05)(図2）。 倍率変化はプラス 0.68 でした。
議論
この研究は、病原体であるP.幼虫の細胞を摂取した看護師が、生産するローヤルゼリーに細胞の断片を取り込んでいるように見えることを示しています（図1）。 私たちは最近、労働者が摂取した細菌がローヤルゼリーの合成部位である下咽頭腺に輸送されることを示しました（Harwood et al., 2019）。そしてここでは、それらがローヤルゼリーに取り込まれることを示します。 この発見は、巣の仲間が免疫学的記憶を共有できるようにする、見落とされている社会的免疫経路を表している。 我々の結果はまた、ローヤルゼリー組成物が体リンパ内を全身的に循環する異物に敏感である可能性があることを示唆しています。 同様の最近の研究で、研究者らは、二本鎖RNA（dsRNA）を与えられた看護師がこれらの分子をローヤルゼリーに組み込んで幼虫に移すことができ、そこでdsRNAは生物学的に活性を保ったままであることを発見した（Maori et al., 2019）。 dsRNA は、配列特異的な遺伝子サイレンシングを引き起こす抗ウイルス RNA 干渉 (RNAi) 経路を活性化し、合成 dsRNA は標的遺伝子ノックダウン研究に頻繁に使用されます (Fire et al., 1998)。 さらに、別の研究では、殺虫剤を摂取している看護師も、微量のこれらの農薬をローヤルゼリーに取り込む可能性があることを示しました(Böhme et al., 2018)。ただし、ここで強調されているのは、下咽頭腺が全身性殺虫剤のローヤルゼリーへの侵入をどの程度防ぐかという点でした。 。
それにもかかわらず、これらの結果は、ローヤルゼリーの組成が看護ミツバチの状態に敏感である可能性があることを示しています。 これらの発見は、ローヤル ゼリーが AB の導管として機能する可能性があることを示唆しています。 すべてのサンプル（A、対照食餌処理、B、病原体食餌処理）は、同一のプロトコルを使用して同時に調製され、ライカ DM6000 を使用して同一の顕微鏡設定で観察されました。 左側の列の暗い画像は、テキサスレッド波長の蛍光を識別するために TRITC レーザーで撮影されたものですが、右側の列の画像は、血球計算板上のローヤル ゼリーの沈着を示すための同じ領域の明視野画像です。 陽性の蛍光スポット (白い矢印) は、病原体食サンプル (B) でのみ観察され、対照食サンプル (A) では観察されませんでした。 すぐに質問が 4 つあります。
まず、看護師が病原体に曝露されると、どのようにしてローヤルゼリー中のディフェンシン-1の生成レベルが上昇するのでしょうか? 可能性の 1 つは、P. 幼虫のフラグメントが、Toll 経路の病原体パターン認識受容体 (グラム陽性菌の場合) に結合し、ディフェンシン -1 のより多くの遺伝子転写を誘導するということですが、これに関する証拠はいくぶん矛盾しています。 アメリカの汚物を含む細菌に曝露された成人労働者はディフェンシンの発現を増加させることが研究で示されている-1 (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994)が、最近の研究ではデフェンシンの有意な上方制御は観察できなかった。アメリカの汚臭植物に曝露された後の看護師の頭部組織におけるディフェンシン-1の発現（López-Uribe et al., 2017）。
それにもかかわらず、ディフェンシン-1のような昆虫のAMPは、病原体曝露後数週間は血リンパ中で観察されることがあり(Casteels, 1998)、たとえその間にそのようなAMP遺伝子の転写が沈静化しても(Uttenweiler-Joseph et al., 1998)、遺伝子発現を測定するだけでは、最終的なペプチド生成物の入手可能性に関する重要な情報を見逃してしまう可能性があります。 あるいは、病原体への曝露により、ディフェンシン-1 mRNAのペプチドへの翻訳が上方制御されたり、ペプチドを活性化するために使用される翻訳後修飾の速度が増加したりする可能性がありますが(Casteels-Josson et al., 1994)、これは調整する必要があります。さらに勉強しました。
これらの結果によって生じる 2 番目の疑問は、ディフェンシン -1 のプラス 0.68 の相対倍率変化が生物学的に関連があるかどうかです。 従来、多くのヒトプロテオミクス研究では、有意な上方制御に対してプラス1.2の閾値を選択しているため(Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009)、ディフェンシン-1はこの基準を満たさないことになります。 しかし、ローヤルゼリー中のディフェンシン-1濃度がわずかに増加しただけでも、アメリカ腐虫に対する幼虫の抵抗性が向上する可能性があります。 ディフェンシン-1は、アメリカの汚物を直接阻害することが示されているだけでなく（Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001）、1 µmol l という低濃度でもグラム陽性菌に対して効果的です。 1 (Fujiwara et al., 1990)。 さらに、自然免疫系のいくつかの構成要素は相乗的に機能することが知られており、それにより、2 つの構成要素が一緒に機能すると、独立して機能する各構成要素の合計よりも大きな病原体抑制効果が得られます。
例えば、細菌増殖阻害アッセイでは、AMP とリゾチームが連携して互いの有効性を大幅に高めることが示されています (Chalk et al., 1994)。 リゾチームは、昆虫の抗病原体機能を持つ脂質輸送タンパク質であるアポリポタンパク質-III (ApoLp-III) (Zdybicka-Barabas et al., 2013) と相乗的に病原体と戦うことも示されている (Whitten et al., 2004; Kim)およびJin、2015）ローヤルゼリーに含まれる（Furusawa et al.、2008; Han et al.、2011; Zhang et al.、2014; Fujita et al.、2013）。 最後に、若いミツバチの幼虫の成熟した免疫系は、アメリカの汚物に攻撃されたときにディフェンシン-1を生成するのに苦労する可能性があります。研究によると、そのような攻撃では幼虫ではディフェンシン-1の発現がほとんどまたはまったく誘導されないことが示されています(Romanelli et al., 2011 Cremer et al., 2007; Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009 ただし例外については Bachanová et al., 2002 を参照。 したがって、暴露された看護師からの追加のディフェンシン-1が、この重要なAMPの幼虫の不足を補う可能性があります。 総合すると、これらの発見は、ローヤルゼリー中のディフェンシン-1のわずかな増加であっても、コロニーの最も脆弱なメンバーを保護するのに生物学的に関連している可能性があることを示唆しています。
この研究はまた、タンパク質Vgがミツバチの免疫において重要な役割を果たすことをさらに実証した。 病原体パターン認識受容体としての役割により、幅広い動物分類群で記録されている（Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al., 2015; Du et al., 2017; al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011）、卵形成における役割と同様に、Vg は免疫誘発物質を女王の卵に輸送するキャリアタンパク質であることが確認されています（Salmela et al., 2011）。 al.、2015)。 同様に、看護師においても、摂取した病原体を下咽頭腺に輸送する際にVgが重要な役割を果たしていることが最近の研究結果で示唆されている(Harwood et al., 2019)。 Vg は看護師の下咽頭腺に取り込まれ、ローヤルゼリーの製造におけるアミノ酸供与体として使用され (Amdam et al., 2003)、Vg は細菌を下咽頭腺に輸送してゼリーに組み込まれる可能性があります。 したがって、Vgは、最初の接種およびローヤルゼリーへの組み込みから女王蜂または幼虫への送達、そして最終的に女王蜂の卵巣への輸送に至るまで、ミツバチにおけるコロニーレベルのTGIPのすべての段階で役割を果たしている可能性がある。
この研究は、ローヤル ゼリーの組成が、病原体フラグメントの取り込みと AMP ディフェンシンのレベルの増加によって、病原体攻撃によって変化する可能性があることを示しました-1。 ローヤルゼリー中の病原体の断片を移送できるということは、ミツバチにおいて世代を超えた免疫プライミングがコロニー全体のレベルで機能している可能性があることを意味します。 ミツバチは、生殖可能な雌からその子孫への免疫誘発物質の垂直伝達に加えて、成体の子孫（乳母）から生殖可能な雌、そして将来の子孫へ向かう、より複雑な経路と、成体から未熟な子孫への水平伝達を持っている可能性があります。子孫。 ここでの利点は、巣の外から資源を集める働きバチの集団的な免疫学的経験から蓄積された免疫誘発物質のより大きなレパートリーが幼虫に接種され、巣の外に出たときに遭遇する可能性が高い病原体に対する幼虫の耐性が高まることである。 。
謝辞
データ収集と分析に関するコンサルティングにご協力いただいた Siiri Fuchs 氏、Salla Lohi 氏、Mati Leponiemi 氏、Franziska Dickel 氏、Maarit Nurminen 氏、Marianne Taichmann 氏、Taina Stark 氏に感謝します。 また、顕微鏡検査に関する技術支援をしていただいた Austin Cyphersmith にも感謝いたします。
競合する利益
GH と GA は、競合関係や金銭的利害関係を持たないことを宣言します。 HS と DF は、食用ミツバチワクチンに関する特許 (WO2017017313A1) の発明者として記載されています。 この特許は、DF が最高科学責任者を務める Dalan Animal Health Inc. に譲渡されています。 この論文で紹介されている研究は、Dalan Animal Health Inc. やその他の営利企業からの資金、資料、または分析リソースの提供を受けずに、独立して実施されました。
著者の寄稿
概念化: GH、HS、GA; 方法論: GH、HS; 検証: GH; 正式な分析: GH、HS; 調査: GH、HS; リソース: HS、DF、GA。 データキュレーション: GH; 執筆 - 原案：GH; 執筆 - レビューおよび編集: GH、HS、DF、GA。 視覚化: GH; 監修：GA プロジェクト管理: DF、GA; 資金調達：GH、DF、GA
資金調達
GH は、アリゾナ州立大学大学院研究および支援プログラム (LM51097GH) によって支援されました。 DF は、Business Finland 助成金 (2348/31/2017) および Academy of Finland 助成金 (6303369) によって支援されました。 GA は、Norges Forskningsråd (262137) によってサポートされました。
For more information:1950477648nn@gmail.com
