スパイクと Nsp6 は SARS-CoV-2 オミクロン BA.1 弱毒化の重要な決定因子である

SARS-CoV-2 オミクロン変異株は、これまでに認識されている他の主要なウイルス変異株よりも免疫回避性が高く、毒性が低い1-12。 異常に多くの突然変異を持つオミクロン スパイク (S) タンパク質が、これらの表現型の主な要因であると考えられています。 ここで我々は、祖先SARS-CoV-2分離株のバックボーンにあるオミクロン（BA.1系統）のS遺伝子をコードするキメラ組換えSARS-CoV-2を生成し、このウイルスを自然に循環しているオミクロンと比較した。変異体。 オミクロン S 保有ウイルスは、主に受容体結合モチーフの変異により、ワクチン誘発性の体液性免疫を強力に回避しました。 ただし、天然に存在する Omicron とは異なり、細胞株および初代様遠位肺細胞内で効率的に複製されました。 同様に、K18-hACE2 マウスでは、ウイルスを保有するオミクロン S は祖先ウイルスよりも重症度が低い疾患を引き起こしましたが、その毒性はオミクロンのレベルまで減弱していませんでした。 さらなる調査により、S タンパク質に加えて非構造タンパク質 6 (nsp6) を変異させることで、オミクロンの弱毒化した表現型を再現するのに十分であることが示されました。 これは、オミクロンのワクチン回避はSタンパク質の変異によって引き起こされるが、オミクロンの病原性はSタンパク質の内外の両方の変異によって決定されることを示している。

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2022 年 12 月の時点で、新型コロナウイルス-19のパンデミックの相次ぐ波は、懸念される変異種（VOC）として知られる5つの主要なSARS-CoV-2変異種によって引き起こされています：アルファ（B.1.1.7） 、ベータ（B.1.351）、ガンマ（P.1）、デルタ（B.1.617.2およびAY系統）およびオミクロン（BA系統）13。 オミクロンは最も最近認識された VOC であり、南アフリカ、ボツワナで初めて記録され、2021 年 11 月に香港で南アフリカからの旅行者によって記録されました (GISAID ID: EPI_ISL_7605742)14。 15. これはすぐに世界中に広がり、数週間以内にそれまで優勢だったデルタ変異種に取って代わり、2022年1月までに新たなSARS-CoV-2感染のほとんどを占めました（参考文献16～18）。 これまでに少なくとも 5 つの Omicron 系統、BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5 が特定されています。 BA.1 (以下、Omicron と呼びます) は、感染およびワクチン誘発性の体液性免疫から顕著な回避を示します 3,19。 さらに、ヒトや生体内感染モデルでは他の VOC より毒性が低い4、5、7、11、12、20。 オミクロンはプロトタイプのSARS-CoV-2分離株である武漢湖-1とは59個のアミノ酸が異なっている。 これらの変化のうち 37 は S タンパク質にあり、S がオミクロンの病原性および抗原性挙動の中心である可能性が高まっています。

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S 変異は細胞培養における Omicron の複製に影響を与える

武漢-湖-1と比較して、Omicron Sタンパク質には、長さで3つの0アミノ酸置換、6つの欠失、および3アミノ酸の挿入が1つ含まれています（拡張データ図1）。 これらの変化のうち 25 は他の VOC と比較して Omicron に特有のものですが、その一部は廃水や軽度の SARS-CoV-2 変異体で報告されています 21,22。 オミクロンの表現型における S タンパク質の役割をテストするために、私たちはオミクロンの S 遺伝子 (USA-lh01/2021) と祖先型 SARS-CoV-2 の他のすべての遺伝子を含むキメラ組換えウイルスを生成しました (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (拡張データ図 2a)。 Omi-S と名付けられたこのキメラ ウイルスは、修飾型の環状ポリメラーゼ伸長反応 (CPER)24 (拡張データ図 2b) を使用して作成され、0.5 × 106 ～5 × 106 個のプラーク形成を含む高濃度のウイルス ストックが得られました。トランスフェクション後 2 日以内のトランスフェクト細胞からの 1 ml あたりの単位 (PFU) であり (拡張データ図 2c、d)、さらなるウイルス増幅の必要性を回避します。

図1|Omicron の in vitro 増殖速度に対する S の影響。 ウイルスの概略図。 S、スパイク。 N、ヌクレオカプシド。 b〜e、ACE2/TMPRSS2/Caco-2細胞（b、d）およびVero E6細胞（c、e）は、0.01のMOIで感染しました。 N陽性細胞の割合（n=6回の複製）（b、c）および感染性粒子の放出（n=3回の複製）（d、e）は、フローサイトメトリーおよびプラークアッセイによって決定されました。それぞれ。 f、ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞を 1:1 の比率でウイルス混合物で感染させ、各ウイルスの最終 MOI 0.005 を得ました。 。 細胞を指定の時間に固定し、フローサイトメトリーに供しました。 左、代表的なドット プロット。 右は、未感染細胞、Omi-S/mCherry感染細胞、Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG)感染細胞、および二重感染細胞の割合。 単独で感染した細胞を補償に使用しました。 エラーバー、平均値 ± SD (n {{20}} 反復)。 g、プラークのサイズ。 左、ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞上のプラークの代表的な画像。 右は、プラークの直径を、ウイルスあたり 20 個のプラークの平均 ± SD としてプロットしています。 h、ヒト iAT2 上皮細胞を MOI 2.5 で 48 時間または 96 時間感染させました。 細胞の頂端側を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、感染性ウイルス粒子のレベルをプラークアッセイにより測定した。 エラーバー、平均値 ± SD (n=4 反復)。 実験は 2 回繰り返され、各実験の繰り返しには 3 (b-g) または 4 (h) の反復が含まれます。 P 値は、ウェルチ補正を備えた両側対応のない t 検定によって計算されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 NS、重要ではありません。 フローサイトメトリーのゲーティング戦略を補足図1に示します。

まず、Omi-S の感染効率を祖先 D614G 含有ウイルス (GISAID EPI_ISL_2732373; CPER によって生成; 以下、野生型 (WT) と呼びます) と Omicron 分離株と比較しました。細胞培養における（USA-lh01/2021）（図1a）。 このために、ACE2- と TMPRSS2-Caco を発現する TMPRSS-2 (以下、ACE2/TMPRSS2/Caco-2) および Vero E6 細胞を Omi-S、WT、およびOmicron は感染多重度 (MOI) 0.01 で、フローサイトメトリーおよびプラーク形成アッセイによってウイルスの増殖をモニタリングしました。 WTウイルスとOmi-SはACE2/TMPRSS2/Caco-2細胞内で急速に広がり、感染後24時間（HPI）でそれぞれ89％と80％の感染細胞を生成しました（図1b）。 対照的に、Omicron はよりゆっくりと複製し、24 hpi で 48% の細胞が感染しました。 同様のパターンがVero E6細胞でも見られ、48 hpiで細胞の60％と41％がそれぞれWTとOmi-Sに対して陽性であったのに対し、Omicronでは10％でした（図1c）。 プラークアッセイでは、Omi-S と Omicron の両方が WT と比較して感染性ウイルス粒子の生成レベルが低いにもかかわらず、Omi-S のウイルス力価が Omicron よりも有意に高いことが示されました。 ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞では、Omi-S は 5.1- 倍 (P=0.0006) と 5.5- 倍 (P {{49} }.0312) それぞれ 12 hpi および 24 hpi で Omicron よりも感染性の高い粒子でした (図 1d)。 同様に、Vero E6 細胞では、Omi-S の感染ウイルス力価は 17- 倍 (P=0.0080) および 11- 倍 (P=0.0078) 高かったそれぞれ24 hpiおよび48 hpiでのOmicronのそれよりも優れています（図1e）。 Omi-Sによって引き起こされる細胞毒性がOmicronと比較してより高いため、ウイルス間の違いは後の時点ではあまり明らかではなくなりました（拡張データ図3a）。 Omi-S の Omicron と比較した複製効率の増加は、さまざまな MOI でテストした場合でも維持されました (拡張データ図 3b)。 さらに、直接競合アッセイによって、Omi-S が Omicron よりも優れていることを確認しました。 このために、我々はまず組換えオミクロン（ミクロン）を生成しました。これは、細胞培養アッセイにおいて天然のオミクロンの複製速度論を模倣しました（拡張データ図4）。 次に、mCherry を含む Omi-S と mNeonGreen を含む Omicron を作成し、これらのウイルスを 1:1 の比率で混合した ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞に接種しました。 感染のさまざまな時点での感染細胞のフローサイトメトリー分析は、複製の点でOmi-S / mCherryがOmicron / mNeonGreenより明らかに優れていることを示しました（図1f）。 最後に、Omi-S のより高い感染効率はプラーク サイズにも反映されました。 WTウイルスは最大のプラーク（約4.1mm）を生成しましたが、Omi-Sプラークのサイズ（約2.2mm）はOmicronプラーク（約1.1mm）の2倍（P < 0.0001）でした（図1g）。 これらの結果は、S タンパク質の変異が Omicron の感染効率に影響を与えるものの、Omicron の表現型を完全には説明できないことを示しています。

いくつかの証拠は、Omi-S に組み込まれた S タンパク質が天然の Omicron と同じように動作することを示しました。 たとえば、以前に記載されているように 20,25、Omicron S は WT S と比較してあまり切断されませんでした。 WT ビリオンの S の 71% は切断型でしたが、Omi-S と Omicron ではそれぞれ 45% と 47% のみが切断されました (拡張データ図 5a)。 S 切断の同じパターンがウイルス感染細胞でも明らかでした (WT、63% 切断; Omi-S、33% 切断; Omicron、42% 切断) (拡張データ図 5b)。 これらの実験は、WT Sと比較して、Omicron Sがウイルス粒子に非効率的に取り込まれていることも明らかにしました（Sとヌクレオカプシド（N）の比：WTウイルスでは3.40、Omi-Sでは1.91、Omicronでは2.04）（拡張データ図5a）。 同様に、Omi-S と Omicron は両方とも、WT ウイルスと比較してより小さな合胞体を生成しました。これは、Omicron について以前に報告されている観察です 20,26 (拡張データ図 5c)。 最後に、公開された文献 25 と一致して、Omi-S と Omicron は、カテプシン阻害剤 E64d に対するより高い感受性によって反映されるように、カテプシン媒介侵入を優先することを示しました (拡張データ図 6)。 次に、COVID患者の主要なウイルス複製部位を形成する肺上皮細胞におけるWT、Omi-S、およびOmicronの複製動態を比較しました-19（参考文献27、28）。 そこで、ヒト人工多能性幹（iPS）細胞由来肺肺胞2型上皮（iAT2）細胞を使用しました。 AT2 細胞は、肺遠位部の必須細胞集団を代表し、SARS-CoV-2 感染の主な標的の 1 つを構成します 28,29。 気液界面（ALI）培養物として増殖させた iAT2 細胞を MOI 2.5 で感染させ、細胞の頂端側でのウイルス子孫の分泌を 48 hpi および 96 hpi でモニタリングしました。 細胞株から得られた結果と一致して、WT ウイルスは最高レベルの感染性ウイルス粒子を生成しました (図 1h)。 Omi-S と Omicron の中で、前者は 48 hp で約 5 倍 (P=0.0008) 高い感染力価を示しました。 WT および Omi-S のウイルス力価は、感染の細胞変性効果 (CPE) により、48 hp と比較して 96 dpi で減少しました。 しかし、Omicron では CPE は見られず、感染性ビリオンの持続的な産生につながりました。 全体として、これらの結果は、S の突然変異が細胞培養における Omicron の複製能力の減弱を完全には説明していないという結論を裏付けるものです。

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マウスのオミクロン病原性におけるSの最小限の役割

Omi-SがOmicronと比較してより高いin vivo適応性を示すかどうかを調べるために、K18-hACE2マウスにおけるWT SARS-CoV-2およびOmicronと比較したOmi-Sの感染結果を調査しました。 公表された文献4,5と一致して、マウス（12～20週齢）にオミクロン（マウス1匹当たり104PFU）を鼻腔内接種しても、有意な体重減少は生じなかったが、WTウイルスを接種すると、すべてのマウスで急速な体重減少が引き起こされた。感染後 8 日 (dpi) までに初期体重の 20% 以上が減少しました (図 2a)。 注目すべきことに、Omi-Sに感染したマウスの80％も9dpiまでに体重の20％以上減少した（図2aおよび拡張データ図7a）。 臨床スコア（体重減少、異常な呼吸、異常な外観、反応性の低下、および行動の変化の累積的な尺度）の評価でも、同様のパターンが明らかになりました。 オミクロンに感染したマウスは臨床疾患の兆候をほとんど示さなかったが、WT および Omi-S に感染したマウスの健康状態は急速に悪化し、WT ウイルスはより重篤な疾患を引き起こした (P= 0.0102) (図 1)。 2bおよび拡張データ図7b)。 SARS-CoV-2 は K18-hACE2 マウスに致死的な感染を引き起こすため4、ウイルス感染後のマウスの生存を比較しました。 体重減少と臨床スコアの結果と一致して、WT と Omi-S の死亡率はそれぞれ 100% (6/6) と 80% (8/10) でした。 対照的に、Omicron に感染したマウスはすべて生存しました (図 2c)。 これらの所見は、最近の論文 30 と一致しており、S タンパク質が K18- hACE2 マウスにおける Omicron の病原性の唯一の決定因子ではないことを示しています。

次に、K18- hACE2 マウスの肺と鼻甲介における Omi-S の伝播を、Omicron および WT SARS-CoV-2 と比較しました。 マウス (12 ～ 20 週齢) に 104 PFU (ウイルスあたり 7 匹のマウス) を鼻腔内に投与し、マウス肺のウイルス力価を 2 dpi および 4 dpi で測定しました。 インビトロの所見と一致して、WT感染マウスの肺における感染ウイルス力価は、他の2つのウイルスに感染したマウスで検出されたウイルス力価よりも高かった（図2d）。 しかし、注目すべきことに、Omi-S感染マウスは、2 dpiでOmicron感染マウスと比較して30-倍(P=0.0286)多くの感染性ウイルス粒子を産生した。 WT および Omi-S 感染マウスでは力価は 4 dpi で減少しましたが、Omicron 感染マウスでは増加傾向を示し、K18- hACE2 マウスにおける Omicron による軽度だが持続的な感染の可能性を示しました。 マウスの肺から回収された 3 つの変異体はすべて、元の接種材料と同じプラーク サイズの表現型を維持しており、マウスでの複製がこれらのウイルスの遺伝子型に検出可能な影響を及ぼさないことが示されました (データは示さず)。

K18-hACE2 マウスの肺と鼻甲介におけるウイルス病原性を評価するために、これらの組織の組織病理学的分析を 2 dpi で実施しました。 以前に報告されたように4,31、SARS-CoV-2 Nタンパク質の広範なほぼ拡散した免疫反応性が、WTウイルスに感染したマウスの肺胞で検出されました（図2e）。 対照的に、Omi-S および Omicron 感染では、肺胞染色の局所的な病巣が生成され、Omi-S と比較して Omicron の病巣は少なくなりました。 最も顕著な表現型は細気管支上皮で見られ、Omi-S が顕著な日常的な周囲感染を引き起こし、細気管支の約 10 ～ 15% が 2 dpi でウイルス N タンパク質陽性であるのに対し、細気管支の 3 ～ 5% のみが N でした。 -Omicron に対して陽性 (図 2f)。 WT ウイルスは細気管支の約 1% に感染し、すべての場合において、細気管支あたり 1 つの単離された上皮細胞のみが含まれていました。 さらに、細気管支感染は、連続ヘマトキシリン・エオシン（H&E）切片分析によって決定されたように、Omi-S感染マウスの上皮壊死と関連していた一方、Omicron感染マウスまたはWT感染マウスでは気道損傷の組織学的証拠は観察されなかった（拡張データ）図8a、b)。 WTウイルスとOmi-Sウイルスを接種したマウスの鼻甲介には、両方ともSARS-CoV-2-陽性細胞が豊富に含まれており、これは明白な細胞変性効果と関連していましたが、Omicronはまれで散発的な陽性細胞を生成し、上皮性ウイルスの明らかな兆候はありませんでした。損傷 (拡張データ図 8c)。 全体として、これらの発見は、マウスの気道におけるオミクロンの複製がOmi-Sと比較して実質的に減弱されていることを示唆しており、Sの変異はオミクロンの病原性の弱毒化に部分的にのみ関与しているという我々の結論を裏付けている。

S および nsp6 の変異はオミクロンの減衰を定義する

WT ウイルスと比較すると、S タンパク質に加えて、Omicron では非構造タンパク質 3 (nsp3)、nsp4、nsp5、nsp6、nsp14、エンベロープ (E)、膜 (M)、および N タンパク質のアミノ酸が変化しています。 (拡張データ図 9a)。 Omicron の弱毒化に関与する非スパイクタンパク質を同定するために、蛍光標識キメラ ウイルスの大きなパネルを生成しました。各パネルには Omicron S と Omicron の 1 つの非スパイクタンパク質の組み合わせが含まれ、残りのタンパク質は WT ウイルス由来です (拡張データ)図9b)。 Omicron SとOmicron nsp6（Omi-S/nsp6）を組み合わせると、ウイルス複製の大幅な減少が観察され、細胞培養におけるOmicronの感染動態が模倣されました（図3a〜d）。 他のキメラウイルスではそのような減少は見られませんでした。 Omi-S/nsp6 の複製効率が低いことは、Omi-S/nsp6 と Omicron の両方が CPER による回復にほぼ 5 ～ 6 日かかったのに対し、他のすべての変異体は 2 日で回復したという我々の発見によっても裏付けられました (データは示さず)。 最後に、Omicron と同様に、Omi-S/nsp6 は直接競合アッセイにおいて Omi-S に明らかに競い合いました（図 3e）。

図2|オミクロンの病原性における S の役割。 a〜c、雄と雌のK18-hACE2マウス（12〜20週齢）に1×104 PFUのWTを鼻腔内接種しました（n=6マウス）、Omi-S（n=10 マウス）、または Omicron（n {{1{{40}}}} マウス）ウイルス。 この実験では、2 つの独立して生成されたウイルス ストックを使用しました。 体重 (a)、臨床スコア (b)、および生存 (c) を 14 日間毎日モニタリングしました。 初期体重の 20% が減少したマウスは安楽死させられました。 d、e、K18-hACE2マウスに、1×104PFUのWT（n=14マウス）、Omi-S（n=14マウス）およびOmicron（n {{ 20}} マウス）。 感染マウスの肺サンプルを 2 または 4 dpi で収集し、ウイルス力価を決定するため (= 4 匹のマウス) (d)、または N タンパク質の免疫組織化学 (IHC) 検出のために (= 3 匹のマウス) (e)。 eでは、マウス肺の肺胞（矢印）および細気管支（矢頭）におけるSARS-CoV-2 N（茶色）を2dpiで示す代表的なIHC画像が示されている。 スケールバー、100 μm。 f、2dpiでの感染マウス(n=3マウス)の肺におけるN陽性細気管支の割合。 各ドットは感染したマウスを表します。 統計的有意性は、ウェルチ補正 (a、b、d、f) およびログランク (マンテル-コックス) 検定 (c) を備えた両側対応のない t 検定を使用して決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 NS、重要ではありません。

K18- hACE2 マウスの肺では、Omi-S が広範な細気管支感染と損傷を引き起こしたのに対し、Omicron と Omi-S/nsp6 は両方とも感染の減少を示し、上皮損傷の証拠はありませんでした（図 3f）。 これらの所見と一致して、Omi-S/nsp6-感染マウスの肺は、rOmicronおよびOmicron分離株で見られるウイルス力価と同等のウイルス力価を生成した（図3g）。 最後に、Omi-S/nsp6に感染したマウスの71％が生存しました（図3h）。これとは対照的に、Omi-Sに感染したマウスではわずか20％の生存率が観察されました（図2c）。 全体として、これらの結果は、S および nsp6 の変異がオミクロンの弱毒化毒性を定義するのに十分であることを示しています。 これらの観察は、nsp6 が存在する 5'-UTR-nsp12 領域の変異が K18- hACE2 マウスにおける Omicron の減弱に寄与することを示した以前の研究の結果を裏付け、さらに拡張するものである 30。

図3|S および nsp6 の変異は Omicron の病原性を促進します。a-d、フローによって決定された ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞における示された mNeonGreen レポーター ウイルスの複製動態 (MOI=0.01)サイトメトリー（n=3 回反復）（a、c）およびプラークアッセイ（n=3 回反復）（b、d）。 実験は２回繰り返された。 e、ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞を 1:1 の比率でウイルス混合物で感染させ、最終 MOI 0 を得ました。00各ウイルスに対して 5 。 細胞を指定の時間に固定し、フローサイトメトリーで分析しました。 未感染細胞、単一感染細胞、および二重感染細胞のパーセンテージが表示されます。 単独で感染した細胞を補償に使用しました。 個々のデータ点は平均値 ± sd (n=3 回の反復) とともにプロットされます。 実験は２回繰り返された。 f〜h、K18-hACE2マウスに1×104 PFUのウイルスを鼻腔内接種した。 Nタンパク質のIHC検出（n=3マウス）（f）またはウイルス力価の決定（n=4マウス）（g）のために、感染マウスの肺サンプルを2 dpiで収集しました。 fでは、N陽性細気管支のH&E染色の代表的な画像が挿入図に示されています。 気管支上皮壊死は矢印で示されています。 Omicron または Omi-S/nsp6 に感染したマウスの細気管支には壊死の証拠は見られませんでした。 スケールバー、100 μm。 fの右のグラフは、感染マウスの肺におけるN陽性細気管支の割合を示しています。 各ドットは感染したマウスを表します。 ｈ、感染マウスの生存を１４日間毎日監視した。 初期体重の 20% が減少したマウスは安楽死させられました。 統計的有意性は、ウェルチ補正 (a-g) およびログランク (マンテル-コックス) 検定 (h) を備えた両側対応のない t 検定を使用して決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 NS、重要ではありません。

Sタンパク質RBMがオミクロンのワクチン逃避を推進

膨大な量の文献は、オミクロンがワクチン誘発性の体液性免疫から広範囲に逃れていることの証拠を提供している 14,19。 オミクロンの免疫逃避表現型に関連する S 領域を定義するために、まずワクチン接種を受けた個人からの血清の in vitro 中和活性を WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20) と比較しました。 20)、Omi-S、および Omicron。 mRNA-1273 (Moderna mRNA ワクチン; n=12) または BNT162b2 (Pfizer-BioNTech mRNA ワクチン; n=12) ワクチンの 2 回目の投与から 2 か月以内に採取された血清が含まれていました (拡張データ)表1）。 ウイルスと中和血清が常に存在する環境で、血清陽性者の状況を模倣してマルチサイクル中和アッセイを実行しました。 すべての血清は Omicron の中和が不十分であり、最大中和濃度の半分以下の希釈率 (ND50) が 11.1- 倍 (範囲: 4.4- 倍から 81.2- 倍; P < 0.0001) でした。 WA1と比較したOmicronの場合（図4a、b）。 実際、サンプルの約 80% は、テストした最高濃度でも Omicron を完全には中和しませんでした (拡張データ図 10)。 注目すべきことに、Omi-SはOmicronと同一のND50値を示しました（WA1の値より11.5-倍低い; P < 0.0001）（図4a、b）。これは、WTに組み込まれた場合、Omicron Sタンパク質がウイルスは、Omicron と同じように動作します。

図4|オミクロンの免疫抵抗性における S の役割。 モデルナ (ドナー 1 ～ 12) またはファイザー (ドナー 13 ～ 24) ワクチンを 2 回接種した個人からの血清中の WA1、Omi-S、およびオミクロンの ND50 値 (血清の詳細については、拡張版を参照)データ表 1; 個々の曲線は拡張データ図 10) に示されています。 b、WA1、Omi-S、およびOmicronに対するND50値の軌跡（aからのデータがプロットされている）。 ND50 値の変化倍率が示されています (n=24 血清サンプル)。 c〜f、キメラウイルス（左、c、d）および変異ウイルス（左、e、f）の概略図。 e の WA1 変異体のアミノ酸番号付けは WA1 S 配列に基づいており、f の Omicron 変異体のアミノ酸番号付けは Omicron S 配列に基づいています。 24 血清のうち 6 つ (モデルナ社からの 3 つとファイザーからの 3 つ) が検査されました。 各血清サンプルは、特定の色のドットで表されます。 データは親ウイルスの倍率変化としてプロットされています。 統計的有意性は、ウェルチ補正を備えた両側対応のない t 検定を使用して決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 NS、重要ではありません。

SARS-CoV-2 S タンパク質は、ACE2 受容体と相互作用する S1 ドメインと膜融合を担う S2 ドメインの 2 つのドメインで構成されています32。 S1 ドメイン内には、N 末端ドメイン (NTD) と受容体結合ドメイン (RBD) があり、ACE2 受容体と直接接触する受容体結合モチーフ (RBM) が含まれています 33。 Omicron S の NTD には、6 つの欠失と 1 つの 3- アミノ酸長挿入を含む 11 のアミノ酸変化がありますが、RBD には 15 の変異が含まれており、そのうちの 10 は RBM (拡張)データ図1）。 NTD と RBD はどちらも中和エピトープを宿主とします 34-37 が、RBD は免疫優勢であり、SARS-CoV-2 免疫血清に存在する中和活性の主な標的となっています 37,38。 オミクロンの中和耐性表現型が S タンパク質の特定のドメインの変異によって引き起こされるかどうかを判断するために、我々は 2 つのグループのキメラ ウイルスを生成しました。 最初のグループは、Omicron の NTD、RBD、または RBM を持つ WA1 ウイルスで構成され (図 4c)、2 番目のグループは、WA1 の NTD、RBD、または RBM を持つ Omi-S ウイルスで構成されます (図 4d)。 中和アッセイにより、RBM の変異がワクチン誘発性体液性免疫に対するオミクロンの耐性の主な原因であることが示されました。WA1 の RBM をオミクロンの RBM に置き換えると、ND50 が 5.4- 倍減少しました (P < 0.0001)。逆に、Omi-SのRBMをWA1のRBMに置き換えると、ND50は5.6-倍増加しました（P=0.0003）（図4c、d）。 RBM スワップ ウイルスのどれも、WA1 と Omi-S の間で見られた約 11- 倍の差を達成していないという事実は、S の他の部分の変異もワクチン耐性に寄与していることを示唆しています。

オミクロンRBMの特定の変異がワクチンエスケープを引き起こすかどうかを調査するために、我々はさらに2つの組換えウイルスパネルを生成しました。1つは単独または組み合わせでオミクロンRBM変異を保有するWA1 Sであり（図4e）、もう1つは同じものを欠くオミクロンSです。突然変異のセット（図4f）。 2 つの WA1 変異体、変異体 3 (E484A 置換を持つ) と変異体 4 (5 つの置換 Q493R、G496S、Q498R、N501Y、および Y505H のクラスターを持つ) は、中程度ではあるが統計的に有意な 1.4- 倍の減少を示しました。 WA1と比較して、ND50値はそれぞれP=0.0002）および1.8-倍（P=0.0003）でした（図4e）。 これらの変異を Omicron S から除去すると、その逆が観察されました。 Omicron 変異体 3 (E484A 置換を欠く) と変異体 4 (Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H を欠く) は 1.9- 倍 (P=0.0082) と 3.{{38} 倍でした。 Omicron と比較して }} 倍（P=0.0025）高い ND50 値（図 4f）。 どの変異体もオミクロンの全体的な表現型を捉えていなかったため、ワクチン回避はSタンパク質の長さに沿って分布する変異の累積的な影響であると考えられます。 突然変異により、免疫優勢な中和エピトープのほとんどが破壊され、中和に利用できなくなるような形で Omicron S の立体構造が変化する可能性があります。

カンクサ-免疫システムを改善する

議論

この研究は、SARS-CoV-2の病原性に寄与するウイルスタンパク質に関する重要な洞察を提供します。 我々は、Omicron で最も変異したタンパク質である S が、Omicron の減衰において不完全な役割を果たしていることを示します。 細胞ベースの感染アッセイでは、Omi-S ウイルスは祖先ウイルスと Omicron の中間の複製効率を示します。 同様に、K18- hACE2 マウスでは、Omi-S は致死性のない Omicron とは対照的に、80% の死亡率をもたらします。 祖先ウイルスはこれらのマウスの死亡率を 100% に高めます。 特に、S変異とnsp6の変異を組み合わせると、ウイルスはOmicronの表現型にほぼ似た弱毒表現型を示し、これら2つのタンパク質がOmicronの病原性の主要な決定因子であることが示された。 今後の研究では、nsp6 変異がウイルス複製に影響を与えるメカニズムが解明されるでしょう。

私たちの研究の潜在的な制限の 1 つは、ヒトとの類似性がより高い霊長類モデルの代わりに K18-hACE2 マウスを病因研究に使用していることです39。 しかし、K18-hACE2 マウスは、SARS-CoV-24 の致死表現型を研究するための十分に確立されたモデルであることに留意すべきである31。 これらのマウスは SARS-CoV-2 感染後に肺の病変を発症しますが、死亡率はウイルスの神経侵入と播種による中枢神経系の関与と関連しています 31,40。 K18-hACE2 マウスに Omi-S を感染させると、Omi-S では神経学的徴候（たとえば、猫背や反応性の欠如）が誘発されるが、Omi-S には感染しないという事実は、神経浸潤特性が Omi-S に保存されていることを示唆しています。おそらく、そのより高い複製効率の結果であり、この特性の決定因子は S タンパク質の外側にあると考えられます。 これらの発見は、Omi-Sに感染したハムスターがOmicronに感染したハムスターよりも有意に多くのウイルスを排出し、より多くの体重を減少させることを示した以前の研究と一致しており、S以外の変異がOmicronの病原性の減弱に寄与していることを示唆している41。

K18-hACE2 マウスでは、祖先ウイルスは主に肺胞で複製し、細気管支への感染はまれにしか引き起こさないが、Omi-S と Omicron の両方が細気管支上皮で複製する傾向が増加していることを発見しました。タンパク質は指向性の変化の原因となります。 このスイッチの背後にあるメカニズムは不明ですが、細気管支やその他の気道で活性なウイルス侵入経路を形成するカテプシン B またはカテプシン L (参考文献 25、42、43) を使用する際に、Omicron S が WT S よりも効率的である可能性があります。細胞41． 対照的に、肺胞上皮細胞への SARS-CoV-2 の侵入は主に TMPRSS2 (参考文献 28,44) によって引き起こされますが (参考文献 28,44)、オミクロン S はその利用が欠如しており 25,45、これらの細胞への感染が不十分になります 4,5 、25、43。 これらの所見は、オミクロンによって引き起こされる肺の病状の軽減を説明できる可能性があります。

カンクサの利点 - 免疫システムの強化

Omicron nsp6 には、プロトタイプの SARS CoV-2 武漢-湖-1 分離株と比較して 2 つの変更部位があります: 3 アミノ酸欠失 (LSG、105 ～ 107 位) と I189V 置換 (拡張データ図) .9）。 コロナウイルス複製におけるnsp6のいくつかの機能が説明されている。 その中で主なものは、ウイルスの RNA 合成部位を表す二重膜小胞 (DMV) の生合成です。 以前の研究では、SARS-CoV-2 DMV は主に 3 つのウイルスタンパク質、nsp3、nsp4、および nsp6 の協調作用によって生成されることが示されました。 DMV の形成には nsp3 と nsp4 で十分ですが、nsp6 はこれらの DMV を小胞体に接続し、これらの構造間の必須の伝達をチャネル化します 46。 Omicron nsp6 の一連の変異が DMV の形成または機能に影響を与えるかどうかについては、さらなる調査が必要です。 Nsp6 はまた、新型コロナウイルス感染症患者の肺における NLR3- 依存性のサイトカイン産生とパイロトーシスも活性化します-19。これは重要な病原性因子として機能します 47。 注目すべきことに、無症候性の新型コロナウイルス-19に関連するnsp6変異体は、ピロトーシスを誘発する能力の低下を示し47、オミクロンnsp6の変異もパイロトーシスに影響を与える可能性があるという推測を促している。 nsp6 の機能に対する Omicron 変異の影響を詳しく調べるには、詳細な機構研究が必要となります。

S と nsp6 の変異が互いに連携してオミクロンの減衰を促進するかどうかは、現時点では不明です。 オミクロン S が細気管支に対してより高い傾向を示したことを考えると、S がウイルス指向性の変化に関与している可能性がありますが、nsp6- の変異を含む非スパイク変異は、変化した組織環境への単なる適応にすぎません。 nsp6 が Omicron の弱毒化の背後にある主要な非スパイクタンパク質であると思われるが、他のウイルスタンパク質の寄与を完全に排除することはできないことは言及する価値があります。 非スパイク変異の役割を調べるインビトロ実験はすべて、ACE2/TMPRSS2/Caco-2 細胞で行われました。 他の、より免疫担当細胞タイプを使用すると、他の非スパイク変異の影響も明らかになる可能性があります。 さらに、我々のキメラ ウイルスには、一度に 1 つの非スパイクタンパク質のみとペアになった Omicron S が含まれており、これにより、複数のウイルス タンパク質の変異間の長距離エピスタティック相互作用が制限されました。

男性の免疫システムを強化するシスタンシュの利点

私たちの研究は、オミクロン S の RBM の変異が、オミクロンの中和抗体からの回避の主な決定要因であることを示していますが、S の他の領域の変異も寄与しています。 RBM内で、Omicron Sに中和に抵抗する能力を与える2つの変異ホットスポットを特定した。1つはE484A置換を持ち、もう1つは5つの置換（Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H）のクラスターを含む。 E484A 置換は、回復期血清による中和を回避することが示されています 51。 さらに、構造モデリングは、一部の治療用モノクローナル抗体が E484 残基と非常に安定な塩橋を確立し、この残基が A に変更されるか、Q493K および Y505H が変更されると結合を完全に失うことを示唆しています 52。 同様に、49 の既知の中和抗体と直接相互作用する RBM 残基のマッピングにより、低頻度相互作用物質として N440、G446、S477、および T478、中頻度相互作用物質として N501、Y505、および Q498、高頻度相互作用物質として E484 および Q493 が明らかになりました53。 、中和アッセイの結果と一致しています。 特に、Omicron S の抗体結合能は損なわれていますが 54、その受容体結合能力は損なわれていません。 実際、オミクロン RBD は、武漢湖 -1 およびデルタ RBD と比較して、ACE2 に対する親和性が高くなります25。 これは、Omicron S の変異が、抗体結合を妨げながら受容体の結合を維持するような形で進化したことを示しています。 これにより、新型コロナウイルス-19のパンデミックを制御するための広域ワクチンの設計において、ACE2認識に関与するSの保存され構造的に制約された領域を標的とする可能性が開かれる。

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