オートファジーを誘導することにより、NAFLDに対するアクチョシド（Cistanche Destericicolaの有効成分）の効果に関する研究

抽象的な：

 

客観的：Cistanche Deserticolaにおける有効成分のアクチュシド（ACT）のオートファジー誘導機能と、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）に対するその効果を調査する。

方法To take echinacoside and ACT as research objects, 100μmol/L ACT and echinacoside (ECH) were combined with autophagy-lysosome inhibitor bleomycin A1 for intervention treatment.タンパク質免疫ブロッティングを使用して、オートファジーマーカータンパク質微小管関連タンパク質1軽鎖3（LC 3- II）の相対発現レベルを検出しました。 HEPG2細胞にin vitroでの異なる濃度のACTの濃度が介在し、細胞生存率がテトラゾリウム塩法を使用して検出されました。BalofloxacinA1と異なる濃度のACTのHepG2細胞のin vitro介入、およびLC 3- IIタンパク質発現レベルを使用したLC 3- IIタンパク質発現レベルを使用した検出。薬物介入でin vitroで構築されたNAFLDモデルを使用して、オイルレッドO染色法を使用して脂質滴を染色し、細胞内トリグリセリドレベルを検出しました。免疫蛍光技術を介したLC3タンパク質と脂質液滴の局在を観察します。結果ACTは、HEPG2細胞にオートファジーを大幅に誘導でき、LC 3- IIタンパク質の発現レベルは、コントロールグループと比較して大幅に増加します（1.36±0。11、0}。それぞれ）、統計的有意性（p0.05）。 50μmol/Lの作動は、HEPG2細胞でオートファジーを有意に誘導し、LC 3- IIタンパク質の発現レベルが有意に増加しました（それぞれ1.83±0.53、0.35±0.18）。 ACT介入グループ（19.11±1.68）のHepG2細胞のTgレベルは、in vitro細胞モデルグループ（34.15±1.90）のNAFLDよりも有意に低く、違いは統計的に有意でした。<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

キーワード：非アルコール性脂肪肝疾患;Cistanche Deserticola;アクセオシド;オートファジー

 

非アルコール性脂肪肝疾患の治療のためのTCMハーブシスンチェ（NAFLD）

写真をクリックして詳細を確認してください

 

過去数十年で、非アルコール脂肪肝臓病（NAFLD）が最も一般的になりました慢性肝疾患、成人人口の約25％の世界的な有病率があり、メタボリックシンドロームと密接に関連していると考えられています[1]。 NAFLD患者の肝関連合併症の確率は10％未満ですが、NAFLDは肝硬変や原発性肝臓癌などの肝関連疾患の危険因子であり、患者に大きな経済的負担を課します[{2-5]。 NAFLDに注意が払われているにもかかわらず、NAFLDは重要な慢性疾患として十分な注意を払っていません。したがって、NAFLDの病因と効果的な治療戦略の検索のさらに詳細な理解は、解決すべき緊急の問題になりました[{6-7]。

最近の研究では、細胞のオートファジーが肝臓の生理学と病理において重要な役割を果たすことが示されています[8]。オートファジーの機能障害または機能不全は、ようなさまざまな肝疾患に関連していますアルコール関連肝疾患[9]、NAFLD [10]、非アルコール脂肪性肝炎[11]、および肝細胞癌[12]。 NAFLDの病理学的特徴は、非アルコール刺激下の肝細胞におけるトリグリセリド（TG）およびその他の中性脂質滴（LD）の過度の堆積です。肝臓の場合、これらのLDの異化を調節する2つの主要な経路は、脂肪分解とオートファジーです。
脂肪分解経路は、ホルモン感受性リパーゼや脂肪TGリパーゼなどの細胞質中性リパーゼによって調節されています。対応するリポオートファジー経路では、オートファゴソームを形成するオートファジー関連のタンパク質を直接リクルートすることによりLDSが選択的に取り上げられ、オートファゴソームによってカプセル化されたLDSはさらにリソソームに送達され、リソソームの酸リパーゼによって分解されます。したがって、肝細胞におけるリポオートファジーを活性化することは、NAFLDの予防と治療のための効果的な戦略となっています。
Cistanche Destericolaは、伝統的な漢方薬の臨床診療で広く使用されている貴重な中国の漢方薬です。同時に、それは長い間健康食品サプリメントとして使用されてきました。 Cistanche Deserticolaには、さまざまな生物活性成分が含まれており、その中で最も重要なのはCistanche Destericolaフェニルエタノールグリコシドです。フェニルエタノイドグリコシドの代表として、エキナコシド（ECH）およびヴェルバスコシド（ACT）は、抗酸化、神経保護、免疫調節、肝臓の保護など、多くの重要な生物学的活性を持っていると報告されています[13]。肝臓の保護の観点から、研究は、ECHが炎症性メディエーターを減らし、成長因子の形質転換を阻害し、肝線維症関連遺伝子の発現レベルを低下させることにより、肝臓を保護できることを発見しました。 ACTは、アルコール、四塩化炭素、リポ多糖などの化学的および薬物誘発性肝臓損傷に大きな保護効果があります。 ACTは、毒性化学物質によって引き起こされる酸化ストレスを減らし、肝臓に蓄積した活性酸素を除去し、マロンジアルデヒド濃度を減少させます。同時に、肝臓のスーパーオキシドジスムターゼ活性を大幅に増加させ、グルタチオン含有量を減らし、肝臓の組織病理学的損傷とアポトーシスを大幅に改善します。ただし、Cistanche Deserticolaのフェニルエタノイドグリコシドが肝臓の保護を行使する際にオートファジーのプロセスに関与しているかどうかについての関連する文献の報告はありません。これに基づいて、この研究では、従来の細胞生物学法とin vitro細胞モデルを使用して、シスタンチ砂漠産物のフェニルエタノイドグリコシドのオートファジー誘導効果を事前に探求し、将来の医薬品開発のための科学的基盤を提供することを目的とした薬理学的機能を調査しました。

 

1つの材料と方法

1.1材料

1.1.1研究被験者は、ECHおよびACTを研究対象として使用しました。

1.1.2材料HEPG2細胞は、Wuhan Punosai Life Science Co.、Ltd.、ECH（Batch Number：B21209）およびACT（B20715、HPLC Purity以上98％以上）から購入しました。トリプシンは米国のHyclone Companyから購入しました、胎児のウシ血清（バッチ番号：04-002-1 a）は、BIカンパニー、イスラエル、ペニシリン/ストレプトマイシン（バッチ番号：SV30010.01）から購入しました。 （バッチ番号：BC0625）検出キットは、中国の北京、ソレバオカンパニー、オイルレッドO（ロット番号：O 0625-100 g）、ジメチルスルホキシド（ロット番号：BCBZ1685）から購入しました。オートファジーリソソーム阻害剤BafiloMycin A1（BAFA1、ロット番号：TLRL-BAF1）は、米国Invitrogenから購入しました。オートファジー活性化因子ラパマイシン（ロット番号：S17098）は、中国のShanghai Yuanye Biotechnology Co.から購入しました。微小管関連タンパク質1軽鎖3（LC3、ロット番号：L7543、種：ウサギ、希釈率：1：1 000）および - アクチン（ロット番号：ZRB1312、種：ウサギ、希釈比：1：{33}}）アンチボディーは米国から購入しました;ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（ロット番号：4010-05、種：ヤギ抗ウサギ、希釈比：1：1 000）は、サザンバイオテクノロジー、米国会社から購入しました。 Sigma-Aldrich Company、米国、およびBodipy 493/501（ロット番号：D3922）は、米国Invitrogen Companyから購入しました。

 

1.2メソッド

1.2.1細胞培養

HEPG2細胞は、10％胎児ウシ血清、100 U/mLペニシリン、および37度、5％二酸化炭素インキュベーターで100 U/mLペニシリンおよび100 ug/mLストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル高グルコース培地で培養しました。セルコンフルエンスが85％に達すると、サブカルチャー、メッキ、介入、その他の操作が行われました。

 

1.2.2タンパク質免疫ブロット検出

1.2.2.1 ACTおよびECH治療

lc 3- hepG2細胞BAFA1のタンパク質発現レベルは、プロトンポンプ阻害剤として、Lc 3-}タンパク質が細胞内で大量に凝集し、それによってオートファジー誘導能力を増幅する可能性があります。したがって、BAFA1の複合使用は、オートファジー誘導能力を評価するためのオートファジー監視システムとして使用できます。対数成長期のHepG2細胞は、一晩培養のために3.5 cmの細胞培養皿に移しました。 100μmol/L Act、ECHおよびBAFA1を12時間介入に使用しました。細胞を、事前に冷却されたリン酸緩衝液（PBS）で洗浄し、すぐにRIPAタンパク質溶解緩衝液で10分間溶解した。上清を遠心分離し、総タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質濃度アッセイキットを使用して決定しました。ドデシル硫酸ナトリウムで定量化した後、サンプルを95度で10分間加熱してタンパク質を変性させました。次に、30μLのサンプルをマイクロピペットで採取し、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動しました。
電気泳動後、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移し、1 0％ミルクで一晩ブロックし、室温で特定の一次抗体と1時間インキュベートし、0.5％トリトンを含むリン酸緩衝液で洗浄し、室温で特定の2次抗体でインキュベートしました。 ECLメソッドは、カラー開発に使用されました。それらは、ブランクコントロールグループ、ラパマイシングループ、ECHグループ、ACTグループ、ラパマイシン+BAFA1グループ、ECH+BAFA1グループ、ACT+BAFA1グループとして設定されました。

 

1.2.2.2 hepg2細胞のLc 3-}タンパク質の発現レベルに介在するACTの異なる濃度が介入しました

対数成長位相HEPG2細胞を3.5 cmの細胞培養皿に一晩培養用に移し、BAFA1と組み合わせた25、50、および100μmol/L ACTを12時間の介入治療に使用し、LC 3-タンパク質の発現レベルをタンパク質イムノブロッティングによって検出されました。対照群（CONグループ、ブランクコントロール）、飢starグループ（STAグループ、飢starting治療HEPG2細胞）、25、50、および100μmol/L ACTグループ、およびBAFA1と25、50、および100μmol/L ACTグループを組み合わせたBAFA1がセットアップされました。

1.2.3 MTTメソッド異なる濃度のACTで24時間処理したHEPG2細胞の生存率を検出する方法
対数成長段階のHEPG2細胞は、96-井戸プレートに中程度の接種密度を備えた井戸プレートに接種し、インキュベーターで12時間培養しました。 2 0、40、60、80、および100μmol/LのACTを24時間および48時間追加しました。 0.5 mg/ml MTT溶液を暗い環境で添加し、インキュベーターでインキュベートしました。 4時間後、上清を破棄し、各ウェルに100μlのジメチルスルホキシドを加え、細胞を37度の一定温度シェーカーで10分間揺らしました。 490 nmの波長での光学密度（OD）値が酵素マーカーによって検出され、細胞生存率が計算されました。

 

1.2.4 NAFLDセルモデルのin vitro構造

一定の重量のパルミチン酸（PA）を計量し、特定の量のイソプロパノールに完全に溶解して、100 mmol/L PAストック溶液を調製しました。これは、後で使用するために-20程度冷蔵庫で分割および保存されました。 PAストック溶液を完全な培地を使用して100μmol/Lに希釈し、1％脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを加えました。細胞を37度3時間インキュベートして、誘導溶液を調製しました。対数成長期のHepG2細胞は、一晩培養のために適切な密度で3.5 cmの細胞培養皿に移し、その後、介入に調製された誘導溶液を使用しました。

 

1.2.5 ACT介入NAFLD in vitroセルモデルTG検出とオイルレッドO染色

 

1.2.5.1 TG検出

対数成長段階のHepG2細胞は、空白のコントロールグループ、モデルグループ、およびACT介入グループによると、培養用に3.5 cmの細胞培養皿に移しました。モデルグループは100μmol/L PA誘導溶液で誘導され、ACT介入群は100μmol/L PA誘導溶液で誘導され、同時に50μmol/L ACTを追加しました。介入時間は24時間でした。古い培地を静かに除去し、事前に冷却されたPBSで細胞表面をゆっくり洗浄し、100μl/皿の事前冷却リパ溶解溶液を加え、氷上で15分間完全に溶解し、4度で遠心分離し、{12}} r/minを10分間{12}}}}を10分間集め、上清を集めて10μLを摂取して、TGレベルの酵素検出を摂取して、TGμLを検出します。 TGキットの指示、そして最後にタンパク質のmgあたりのTGレベルを修正します。

1.2.5.2オイルレッドO染色

対数成長期のHepG2細胞は、一晩培養のために滅菌カバースリップで覆われた3.5 cmの培養皿に移しました。 100μmol/l Paは、細胞に脂質液滴を形成するように誘導しました。同時に、24時間介入のために50μmol/L ACTを追加しました。
細胞スライドを収集し、事前に冷却したPBSで3回洗浄し、室温で4％ホルムアルデヒドで10分間固定し、細胞表面をPBSで洗浄し、調製した赤いO染色溶液を加え、暗所で15分間室温で染色し、オイルレッドO染色溶液を吸引し、60％蒸留溶液を洗浄して洗浄しました。顕微鏡で撮影されました。

 

1.2.6 ACT治療後のオートファゴソームと脂質液滴の免疫蛍光観察

対数成長期のHepG2細胞は、一晩培養のために滅菌カバースリップで覆われた3.5 cmの培養皿に移しました。 1 00μmol/l Paを使用して、細胞内の脂質液滴の形成を誘導しました。同時に、24時間介入治療のためにACTが追加されました。細胞スライドを収集し、事前に冷却したPBSで3回洗浄し、室温で4％ホルムアルデヒドで固定し、室温で15分間浸透し、0.1％サポニンを含む透過緩衝液で浸透し、室温で1時間ブロックしてヤギ血清で1時間、室温で室温で1時間をインキュベートします{14〜15枚の時間を塗ります。室温でインキュベートし、1時間光から離れてインキュベートした特定の蛍光標識二次抗体で添加しました。抗体インキュベーション後、スライドをPBSで3回洗浄し、脂質液滴特異的プローブボディ493/503で室温で10分間洗浄し、PBSで洗浄し、暗闇で風乾し、レーザー共焦点顕微鏡で観察され、記録されました。空白のコントロールグループ、ラパマイシン治療グループ、およびACT介入グループが設定されました。

 

1.3統計分析

SPSS25。0統計ソフトウェアがデータ分析に使用されました。定量的データはx±sとして表されました。一元配置分散分析とLSD-Tテストが使用されました。 p<0.05 was considered statistically significant.