腎臓病を単細胞レベルで研究する
Apr 04, 2023
概要
背景: 腎臓は、健康に不可欠な複数の機能を備えた非常に複雑な臓器です。 腎臓病は、腎臓が損傷し、適切に機能しない場合に発生します。 単一細胞分析は、正常および異常な腎臓細胞の種類について前例のない洞察を提供する強力な技術であり、一般的な腎臓病のメカニズムについての理解を変えるでしょう。
要約: 腎臓病の病因に関する私たちの理解は、腎機能を担う細胞型の分子的特徴付けが不完全であるために制限されています。 腎臓研究における単一細胞技術の応用により、腎疾患の発症と進行における細胞の不均一性、遺伝子発現プロファイル、分子動力学が明らかになりました。 腎臓オルガノイドおよび同種移植片組織の単細胞分析により、腎臓の器官形成、疾患のメカニズム、および治療結果について新たな洞察が得られました。 全体として、腎細胞の不均一性と腎疾患の分子動力学をより深く理解することで、診断の精度が向上し、腎臓学における新しい治療戦略を特定するのに役立ちます。
重要なメッセージ: この総説記事では、腎臓病に関する最近の単細胞研究を要約し、腎臓の基礎研究と臨床研究に対する単細胞技術の影響について議論します。
キーワード
単一セル技術。 腎臓病; 免疫細胞; 腎臓オルガノイド。 同種移植片。シスタンシュの恩恵を受ける。
序章
腎臓は、血液中の老廃物、過剰な水分、その他の不純物をろ過し、尿を生成する役割を担う 2 つの豆の形をした器官です。 腎臓はまた、pH、塩分、カリウムのレベル、血圧も調節します。 赤血球の生成を制御します。 体がカルシウムを吸収するのを助けるビタミンDの一種を活性化します。 現在までに、世界中で推定 8 億 5,000 万人が慢性腎臓病 (CKD)、急性腎損傷、腎不全、その他多くの疾患を含む腎臓病に苦しんでいます。 腎臓病は、腎臓が損傷を受けてその機能を果たせなくなると発生します。 損傷は、糖尿病、高血圧、その他のさまざまな慢性 (長期) 状態によって引き起こされる可能性があります。 腎臓病は、骨粗鬆症、神経損傷、栄養失調、心臓病などの他の健康上の問題を引き起こす可能性があります。 患者に対する現在の治療戦略は依然として腎臓移植または透析であり、これらは費用がかかる。
腎臓内のさまざまな細胞（上皮細胞、チラコイド細胞、内皮細胞、神経細胞、免疫細胞ネットワークなど）が相互作用して、正常な腎機能を維持します。 健康な腎臓の不均一性と腎疾患の根底にあるプロセスをより深く理解することで、腎臓の分子的および組織病理学的表現型の定義が洗練され、新しい疾患分類の開発がサポートされます。 単一細胞技術は、腎疾患の発症および進行中の細胞のサブタイプ、状態、頻度の変化を特定するのに潜在的に有利です。 近年、ハイスループット単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) 技術の急速な発展により、腎臓精密医療研究のために正常腎臓の包括的な細胞アトラスが構築されています。 Kidney Precision Medicine Project (KPMP) は、ヒト腎生検を取得し、腎組織アトラスを作成し、疾患部分集団を定義し、最終的に新しい治療法の主要な細胞、経路、標的を特定することを目的として世界的に開発されました。 研究者らは、腎臓関連の単一細胞転写データセットに基づいて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 の病因を理解するために重要である腎細胞サブタイプにおける ACE2、TMPRSS2、および SLC6A19 の遺伝子発現プロファイルも分析しました。このレビューでは、私たちは、(1) 単一細胞技術の開発と応用、(2) 腎疾患の発症と進行を研究するための scRNA-seq の使用、(3) 腎疾患における免疫細胞の分子マッピング、に焦点を当てます。 4) 腎臓様臓器への scRNA-seq の適用、および (5) 腎同種移植片を詳細に研究するための scRNA-seq の使用 (図 1)。
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単一細胞トランスクリプトーム技術の開発と応用
単一細胞は生命の基本単位です。 単一細胞分析技術は、細胞組成を特定し、分子動力学を追跡し、病理学的メカニズムを明らかにする私たちの能力に革命をもたらしました。 初期の包括的な単一細胞遺伝子発現解析は、マイクロアレイおよび qPCR 技術を使用して実行されました。 ティーチェンら。 たちは、単一細胞マイクロアレイを使用して、個々のニューロンおよび前駆細胞の分子発現プロファイルをモニタリングし、さまざまな発生段階でのシグナル伝達経路を定義しました。 さらに、単一細胞発現解析により、新規膵臓遺伝子を持ついくつかの発生細胞サブタイプが同定され、膵臓の発生に関する新たな洞察が得られました。 このクラスは、単一細胞 qPCR 技術を開発し、それをマウス胚盤胞の発生と造血系譜の分化における重要な調節遺伝子の研究に応用しました。
次世代シーケンス技術の出現により、scRNA-seq は、単一細胞内のさまざまなアイソフォーム、対立遺伝子発現、新規転写物を低コストで識別する上で明らかな利点を示しました。 2009 年に、Tang ら。 は、単一細胞 mRNA の全トランスクリプトーム配列決定を初めて報告し、単一のマウス卵母細胞または卵母細胞における転写変異体の複雑性を実証しました。 Smart-seq は 2012 年に単一細胞の全長転写物を検出するために開発され、研究者らはそれを希少細胞に適用することで黒色腫循環腫瘍細胞の候補バイオマーカーを同定しました。 1 年後、逆転写、リード カバレッジ、バイアス、精度が向上した Smart-seq2 が導入されました。 Smart-seq3 の最近の開発により、対立遺伝子およびアイソフォームの解像度で数千の単一細胞転写物を検出する感度が大幅に向上しました。 PCR ベースの増幅方法とは異なり、CEL-seq は多重線形増幅によって効率的な単一細胞トランスクリプトームを捕捉します。 CEL-seq を使用して初期クリプトバクテリウム ヒダラ腺腫の胚発生を研究した研究では、単一細胞解像度での再現性と感度の高い結果が明らかになりました。 scRNA-seq の最初の自動化プラットフォームは Fluidigm C1 です。これは、マイクロ流体システムを使用して 96 または 384 チャンバー内の単一細胞を捕捉し、続いて細胞溶解、逆転写、および PCR 増幅を行います。
2015 年以降、単一細胞研究は、Drop-seq、inDrop、10× Genomics、Seq-well、Microwell-seq、SPLiTseq が継続的に利用できるようになり、ハイスループット、低コスト、自動化の時代に完全に突入しました。 Drop-seq と inDrop は、個々の細胞をナノリットル サイズの液滴に分離し、それらを固有のバーコードと混合して各細胞をラベルします。 一方、Cyto-seq、Seq-well、Microwell-seq は、細胞とバーコード ビーズをマイクロウェルに捕捉することで、ハイスループットの単一細胞 mRNA シーケンスを可能にします。 私たちのグループは、Microwell-seqを使用して単一細胞レベルで最初のマウス細胞アトラスとヒト細胞ランドスケープを構築しました。 最近では、よりスループットが高く、より簡単な方法は SPLiT-seq と呼ばれ、scRNA-seq の場合は sci-RNA-seq と呼ばれています。 これらの方法では、細胞または核自体を反応チャンバーとして使用し、プールの分割を数回繰り返して標識された細胞をバーコード化します。 次に、すべての細胞に対して cDNA PCR 増幅と配列決定が行われます。 曹氏ら。 らは、sci-RNA-seq3 を使用して、約 200 万個のマウス器官形成細胞と 400 万個のヒト胎児細胞のトランスクリプトームを解析し、哺乳類の発生過程の全体像を提供しました。 ゲノム、プロテオミクス、エピゲノム解析をカバーする他の単一細胞技術も普及しています。 ただし、それらはこの文書の範囲外です。
腎臓病の発生と進行
腎臓は、急性腎障害、糸球体腎炎、上行性感染症（腎盂腎炎）、がんなど、多くの一般的かつ重篤な疾患の影響を受ける可能性があります。 全体として、腎臓病の病因に関する我々の理解は、臓器特異的な機能を担う細胞型の分子的特徴付けが不完全であることによって制限されています。 この知識のギャップを埋めるために、私たちのグループとParkらは、 scRNA-seqを使用して健康なマウス腎臓の転写アトラスを構築しました。 腎単位上皮細胞の主なサブタイプには、脚細胞、近位尿細管上皮細胞、ヘンレ環、遠位尿細管、および集合管細胞が含まれます。 この研究では、管細胞集団を収集するための新しい遊走細胞タイプが同定され、scRNA-seq研究における挿入細胞と主要細胞の間の相互変換に関する以前の知見が裏付けられた。 さらに、Ransick et al. 雄と雌の成体の腎臓を分析し、単細胞レベルでマウスの腎臓要素の解剖学的アトラスを作成しました。 私たちのグループはまた、ヒト胎児および成人腎臓組織のMicrowell-seq分析も実施しました。 組織内の上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、および免疫細胞に加えて、胎児腎臓ではこれまでに報告されていないs型体細胞タイプ、および成人腎臓では新しい遊走細胞タイプが同定されました。 腎血管系の単一細胞分子プロファイリングにより、構築ネフロンの特殊な発現プロファイルが明らかになり、腎疾患の病因が明らかになりました。 さらに、単一細胞トランスクリプトームクラスタリング分析によって、健康なマウスおよびさまざまな疾患モデルからすべての種類の糸球体細胞が同定され、腎毒性免疫後に有足細胞で活性化される Hippo 経路などの新規疾患関連遺伝子および調節経路が疾患モデルで検出されました。けが。
腎線維症は CKD の特徴であり、世界人口の 10% 以上が罹患しています。 腎線維症の不均一共存モデルにおいて、Kramann et al. らは、scRNA-seq を使用して、単球が筋線維芽細胞の一部に寄与しているが、ほとんどの筋線維芽細胞が間葉細胞に由来していることを確認しました。 その後、Kuppe et al. [37]は、近位尿細管および非近位尿細管からの約135個の000細胞のトランスクリプトームを分析し、MSCの異なるアイソフォームがヒト腎線維症の主な原因であることをさらに検証した。 さらに、健康な腎単球と線維化した腎単球の比較分析において、筋線維芽細胞特異的遺伝子である裸のケラチノサイトホモログ 2 (NKD2) が、ヒト腎線維症の潜在的な治療標的として同定されました。 402 件の腎生検に基づいて、尿中フィブリノーゲンは CKD 患者における非侵襲性バイオマーカーであると予測されています。
標準化されたシスタンシュ
糖尿病性腎症 (DN) は、糸球体と尿細管間質への同時損傷を特徴とします。 しかし、病気の発症や遺伝子発現の進行に伴って細胞の状態や頻度がどのように変化するかについてはほとんどわかっていません。 マウス DN における糸球体細胞遺伝子発現の変化を解明するために、Fu et al. らは、scRNA-seq 解析を実行し、Magi2、Robo2、Ramp3、および Fabp4 を含む、糸球体細胞のいくつかの新規の潜在的マーカーを同定しました。 糖尿病性腎症（DKD）では、血管新生経路および遊走経路の調節が内皮細胞で変化する一方、翻訳およびタンパク質安定性調節経路はチラコイド細胞で高度に富化されています。 全体として、内皮細胞およびチラコイド細胞の分子動力学の変化は、DN 進行に寄与する重要な病態生理学的要因を特定するのに役立ちます。 チョンら。 は、糖尿病のマウスモデルにおける糸球体の単一細胞トランスクリプトームを示しました。 ob/ob マウスのチラコイドおよび有足細胞では、対照と比較して遺伝子発現が変化していました。 細胞数比の変化と一致して、チラコイド細胞では増殖経路が誘導され、有足細胞では細胞死関連経路が誘導されました。 公開されている DKD scRNA-seq データセットの包括的な分析により、17 個の重要な遺伝子が特定され、DKD の病因の根底にある分子機構の理解が深まりました。 さらに、凍結保存されたヒト糖尿病腎臓サンプルの不偏単核 RNA シーケンス (snRNA-seq) により、3 つの対照サンプルと 3 つの初期 DN サンプルから 23,980 のトランスクリプトームが得られました。 結果は、ヒトDNにおけるカリウム分泌の増加を示唆する遺伝子発現における細胞型特異的な変化を示した。 成体マウスの腎臓における scRNA-seq と snRNA-seq を比較した以前の研究では、後者の方がより効率的な捕捉能力を持っていることが示されました。 たとえば、糸球体有足細胞、チラコイド細胞、および内皮細胞は、scRNA-seq ではなく snRNA-seq によって捕捉されました。 snRNA-seq の応用は、酵素消化の疑似効果を最小限に抑え、凍結サンプルでも実行できるため、さまざまな腎疾患の病理学的メカニズムの研究を加速する幅広い応用につながることが期待されます。
正確な細胞トランスクリプトームにより、腎腫瘍細胞の起源と悪性形質転換を裏付ける転写軌跡を明らかにすることができます。 ヤングら。 72,501 個の単細胞トランスクリプトームのカタログから、正常および癌性のヒト腎細胞タイプを定義しました。 この研究は、腎癌細胞（RCC）の特定の正常細胞相関を同定することにより、ウィルムス腫瘍細胞が異常な胎児細胞であり、RCCが近位尿細管細胞のほとんど知られていないサブタイプに由来する可能性があるという仮説の証拠を提供した。 したがって、scRNA-seq は、正確な定量的細胞分子分解能でヒト腎癌細胞を特徴付けるための拡張可能な実験戦略を提供します。
腎臓病における免疫細胞の分子アトラス
免疫細胞は人間の組織の基本的な構成要素であり、生理学的および病理学的な代謝において重要な役割を果たします。 実際、病原性シグナルや危険シグナル、あるいは悪性細胞を認識する免疫系の能力は非常に重要です。 腎免疫細胞の研究への単一細胞技術の応用は、健康な腎臓と疾患の病因における免疫系の役割の理解を促進し、新しい治療戦略を特定する可能性を秘めています。 これらの取り組みにより、腎臓内の複雑な免疫状況がマッピングされ、組織内に存在する免疫細胞と相互に活性化される隣接細胞との関係が明らかになり始めています。
2018年、マウス腎臓組織におけるscRNA-seqの応用により、常在マクロファージ、好中球、BおよびTリンパ球、NK細胞を含む包括的な免疫細胞の状況が提供されました。 1 年後、ヒト腎臓免疫細胞の時空間組織に関する前例のない単一細胞研究が確立されました。 組織に存在する骨髄系およびリンパ系の免疫細胞ネットワークが胎児および成人の腎臓で確認され、研究により感染防御を促進する生後に獲得された転写プログラムが確認されました。 さらに、成熟腎臓上皮細胞と免疫細胞間のクロストークにより、抗菌性マクロファージと好中球が腎臓の最も感受性の高い領域に動員されることが予測されました。 全体として、腎臓の包括的な免疫状況は、免疫疾患および感染性腎臓疾患における発病メカニズムの研究と治療標的の同定に貢献します。
ループス腎炎 (LN) は致死性の可能性がある自己免疫疾患であり、現在の治療法は効果がなく、多くの場合有毒です。 腎障害および LN の不均一性につながる分子および細胞プロセスは依然として不明である。 scRNA-seq は Arazi らによって使用されました。 LN患者における骨髄性細胞、T細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞の21の疾患特異的亜集団を特定する。 同様に、Der et al. は、LN 患者からの腎臓と皮膚の生検組織に scRNA-seq を適用しました。 尿細管上皮細胞の I 型インターフェロン反応スコアは、健康な対照よりも LN 患者の方が高いことが報告されています。 さらに、尿細管細胞の炎症性および線維化の特徴は、治療の無効性と関連していました。 DKD では、scRNA-seq 分析により、対照よりも糖尿病糸球体の免疫細胞の数が有意に多いことが示されました。 これらの研究は、尿、皮膚、腎臓における免疫細胞の遺伝子発現プロファイルが高度に相関していることを示唆しており、尿と皮膚の生検が腎臓病の診断および予後マーカーの潜在的な供給源である可能性があることを示唆しています。
最近の研究では、腎疾患モデルにおける免疫細胞の役割が単一細胞分解能で実証されています。 片側尿管閉塞モデルは、マクロファージや炎症細胞が腎間質に浸潤し、腎血行動態や代謝に顕著な変化を引き起こす腎間質線維症に広く使用されています。 scRNA-seq は、線維症の進行および退行中の骨髄細胞の状況を分析するために、可逆的な片側尿管閉塞モデルで使用されています。 コンウェイら。 部分集団の相対的割合の動的な変化を伴う骨髄細胞の不均一性、単球は損傷の初期に動員され、Ccr2とマクロファージは損傷の後期に蓄積し、Mmp12とマクロファージの新しいクラスターが修復プロセスで役割を果たすことが明らかになりました。 腎疾患および移植では、虚血再灌流障害 (IRI) が炎症および白血球の動員に関連しています。 IRI の実験モデルは、腎臓における 2 つのグループの自然リンパ様細胞の機能的役割を評価するために使用され、データはこれらの細胞が腎損傷において重複した機能を持っていることを示唆しています。 Kremannらは、scRNA-seqを腎移植IRIモデルに適用することで、 その後のCXCR5と白血球浸潤により、全身のCXCL13レベルが上昇することを発見した。 knRNA-seq は、Kirita らによって IRI マウスモデルにも適用されました。 損傷後の詳細な細胞反応を特徴付け、明確な炎症促進性および線維化促進性の近位尿細管細胞の状態を特定します。 プリン代謝の最終酸化生成物である尿酸は、いくつかの疾患モデルにおいて腎炎症と密接に関連しています。 たとえば、NLRP3 (NOD、LRR、およびピリンを含む構造ドメイン 3) は尿酸過剰のシグナルを感知し、高尿酸血症腎症では炎症小胞が活性化されます。 しかし、高尿酸血症誘発性腎障害の根底にある特定の免疫機構は不明です。 高尿酸血症誘発性腎障害モデルにおける単細胞レベルでの炎症体のランドスケープの構築は、近い将来に実現されることが期待されている。
免疫浸潤は腎腫瘍内に存在し、腫瘍微小環境の影響を受けます。 以前の研究では、腫瘍浸潤マクロファージ集団が血管内皮増殖因子 A を発現し、RCC 組織における複雑な VEGF シグナル伝達経路に関与していることが示されました。 本研究は、scRNA-seq が腫瘍形成に対処し、薬物療法の標的となり得る推定上の病態生理学的メカニズムと細胞シグナル伝達ネットワークを特定できることを実証しています。 全体として、この研究は、健康な腎臓と病気の腎臓で機能する免疫系と細胞ネットワークについての洞察を提供する scRNAseq の進歩に焦点を当てています。
ハーブカンク
scRNA-seq の腎臓オルガノイドへの応用
罹患した腎組織の研究に加えて、腎オルガノイドは器官形成と疾患メカニズムの研究のための重要なツールとなっており、代替組織の供給源として治療法の開発を加速する可能性を秘めています。 並行して、scRNA-seq の進歩により、さまざまな細胞部分集団や腎臓様器官における遺伝子発現の変化のより詳細な分析が可能になりました。
全体として、腎臓様器官の成熟を導くには、単細胞レベルでの腎臓の胚発生をより深く理解することが必要です。 ヒト胎児腎臓の単細胞トランスクリプトミクス研究により、22 種類の細胞と対応するマーカー遺伝子が同定されました。
さまざまな発生段階を比較すると、足細胞の分子動力学の連続性がわかります。 別の単一細胞分析は、ヒト胎児腎臓および胚性幹細胞由来の腎臓様器官に対して実行されました。 腎臓における単一細胞の発生軌跡の比較分析により、後期有足細胞を除いて、インビボおよびインビトロで同様の遺伝子発現プロファイルが明らかになり、有足細胞様器官の不完全な成熟プロセスが示唆されました。 移植実験はさらに、オルガノイド モデルを使用してチラコイドと血管内腔を最適化できることを示唆しています。 後腎間葉細胞および尿管芽様細胞を使用して腎オルガノイドを生成する最近の研究では、scRNA-seq が近位尿細管の成熟を改善し、オフターゲット細胞集団を減少させることが示されました。 ヒト多能性幹細胞 (PSC) 由来の腎臓オルガノイドの scRNA-seq 解析は、Subramanian らによって行われました。 およびウーら。 ヒトの胎児および成人の腎臓の単一細胞データセットと比較すると、さまざまな腎臓様器官はほぼ再現可能な細胞型を示しましたが、オフターゲット細胞の存在により細胞の割合が異なっていました。 さらに、転写因子ネットワーク解析により腎臓オルガノイド分化経路が明らかになり、オルガノイド分化の特徴付けと誘導における単一細胞技術の力が強調されました。
結論として、ヒトの腎臓様器官は、鉱山疾患モデル、潜在的な調節機構、ハイスループット薬剤スクリーニング、そして最終的には再生療法にとって有用な資源である。 これらの研究は、in vivo の生理学的および病理学的プロセスを解明するための腎モデル系における scRNA-seq の使用の可能性を強調し、腎疾患の診断と治療における将来の研究への指針を提供します。
scRNA-seq による腎臓同種移植片に関する洞察
同種腎移植は、末期腎疾患に対する最も効果的な臨床治療法の 1 つです。 単一細胞技術は、同種異系移植後のヒト生検標本を使用して腎細胞の種類と状態を正確かつ正確に特徴付ける機会を提供します。 腎移植生検標本に関する最初に発表された報告書では、8746 個の単細胞トランスクリプトームが分析され、明確な炎症反応が定義されました。 単球は非古典的 CD16 プラス グループと古典的 CD16- グループを形成しました。 内皮細胞は、休止状態と 2 つの抗体媒介拒絶状態を示しました。 これらの発見は、腎移植における免疫拒絶についての理解を深めるのに貢献します。 レシピエントおよびドナーソースからの腎単球の比較研究では、腎生検標本では大幅に異なる転写遺伝子発現が示されました。 炎症活性化マクロファージと細胞傷害的に発現した T 細胞がレシピエントで観察されました。 同様に、Liu ら。 慢性腎移植拒絶反応の細胞を分析し、健康な成人腎臓と単細胞レベルで一致させました。 教師なしクラスタリング分析により、慢性腎移植拒絶反応群における免疫細胞と筋線維芽細胞の数の増加が腎拒絶反応と線維化に寄与している可能性があることが明らかになりました。 注目すべきことに、最近の研究では、成人尿の最初の単細胞アトラスが示され、尿中のSOX9と腎幹/前駆細胞集団が特定されました。 前駆細胞は生体内で増殖および分化することに成功し、尿細管細胞の特性の一部を獲得し、将来の腎移植治療に有用な資源となる可能性があります。 全体として、scRNA-seq テクノロジーは、ヒト腎移植拒絶反応に関する斬新で洞察力に富んだ洞察を提供し、最終的には診断精度を向上させ、分子生検解釈の採用を加速します。
カンクサのサプリメント
結論
過去 10 年間で、scRNA-seq は、生理生物学を研究し、疾患における分子調節異常を特定するための、トランスクリプトーム全体の差次的遺伝子発現解析に不可欠なツールとなりました。 従来の個別の表現型とは対照的に、単細胞レベルでの分子の特徴付けは、腎疾患の表現型を特徴付けるための体系的な標準を提供できます。 健康な腎臓組織または臨床腎生検サンプルに単一細胞技術を適用すると、腎臓の包括的な分子アトラスが提供され、腎臓学の理解が広がります。 腎単細胞アトラスは、人体の包括的かつ系統的な参照地図を作成することを目的とする、ヒト細胞アトラスの国際的活動の不可欠な部分となります。 将来の研究では、単一細胞の超ハイスループット分析と空間トランスクリプトーム分析により、腎臓についての理解が広がることが期待されています。 マルチオミクスデータの統合により、腎疾患の個別診断と治療がさらに改善されます。
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ジャン・メンメンa,b; ハイデ・チェンb, c; グオジ・グオa, b, c, d, e
a: 中国、杭州の浙江大学医療センター、良渚研究室。
b: 中国杭州の浙江大学医学部幹細胞・再生医学センター。
c: 浙江省組織工学および再生医療重点研究所、Dr. Li Dak Sum および Yip Yio Chin、幹細胞および再生医療センター、杭州、中国;
d: 中国杭州の浙江大学医学部第一附属病院骨髄移植センター;
e: 中国杭州の浙江大学血液学研究所
