Stx2は差次的遺伝子発現を誘導し、近位尿細管Ⅱの概日リズム遺伝子を乱す

3. ディスカッション

3.1. STEC 患者および動物モデルにおける近位尿細管の病理

乏尿は次の兆候です急性尿細管壊死症(ATN)。 ATN により、脱落した上皮細胞が尿細管の内腔を閉塞し、体液の流れが減少し、乏尿として現れます。 STEC 患者では、乏尿と無尿が ATN を示唆する所見であることがよくあります。 STEC 感染症の初期段階における近位尿細管機能の低下は、尿中 2MG および NAG の増加として示されています [3,33]。 B2MG は 12 kDa の小さなタンパク質で、糸球体を通って自由に濾過され、健康な状態では近位尿細管に完全に吸収されます。 しかし、近位尿細管が損傷すると、尿中の 2MG の量が増加するため、近位尿細管機能のバイオマーカーとして機能します。 NAG は 130 kDa の大きなリソソーム酵素であり、近位尿細管の主要なグルコシダーゼです。 サイズが大きいため、糸球体は NAG を濾過できませんが、損傷した近位尿細管は尿中に NAG を分泌します。 したがって、尿中 NAG の増加は、近位尿細管損傷のもう 1 つのバイオマーカーです。 フィブリン閉塞毛細血管などの糸球体の組織病理は、STEC 患者によく見られる所見です。 ただし、上記の尿データは、初期の疾患における近位尿細管の損傷を示唆しています。 また、STEC 患者の尿には、損傷した近位尿細管細胞の脱落の結果である尿細管上皮からなる円柱が含まれています [1]。 動物モデルでは、近位尿細管細胞の脱落は、STEC 感染モデルと Stx 注射モデルの両方でよく見られます [25-27、34]。 現在の研究では、Stx2-を注射したマウス腎臓で近位尿細管細胞の脱落を発見し、Stx2-が近位尿細管の変化を誘発したことを示唆しています（図1）。 また、マウスとマウスの両方で Stx2 受容体 Gb3 を検出しました。ヒト腎臓近位尿細管管腔側の発現は、Stx2 と近位尿細管との直接相互作用を示しています (図 2 および 3)。 PDK4 はピルビン酸デヒドロゲナーゼをリン酸化してその活性を阻害し、その結果、長期間の絶食や飢餓に応じてグルコース利用が減少し、脂肪代謝が増加します。 剥離した上皮細胞を剥離誘発性細胞死 (アノイキス) から保護します [35]。 PDK4 には最初に 4 時間でピークがあり、次に 8 時間で別のピークがありました (図 5A)。 12 時間で減少しましたが、そこから 72 時間まで log2- 倍の変化で徐々に増加し、最終的には 3 (12- 倍の変化) になりました (図 5A)。 Stx2-を注入したマウス近位尿細管細胞では上皮細胞の剥離（脱落）が発生し、形態は比較的無傷でした（図1）。これはPDK4の上方制御を反映している可能性があります。

腎臓用カンカエキス粉末

NHERF1 (SLC9A3R1) は、細胞外マトリックスへの正常な細胞の接着 [36]、アクチン細胞骨格の組織化、細胞形態の維持に寄与しているため、この遺伝子の発現低下は細胞の脱落などの影響を与える可能性があります (図 5K)。

Stx2 の近位尿細管への影響は、STEC 感染症にとって非常に重要な要素であると思われます。 しかし、生体内近位尿細管細胞に焦点を当てた遺伝子発現の変化はこれまで利用できませんでした。 キーパーズら。 [37] は、Stx2+LPS を注射したマウスの腎臓における差次的発現遺伝子 (DEG) を示し、初期に大きく変化した遺伝子のほとんどは LPS の影響によるものであり、非常に遅く変化した遺伝子は Stx2 効果によるものであることを示しました。 。 彼らのデータは、腎臓の異なる遺伝子発現についての貴重な洞察を示しましたが、その変化の原因となっている細胞の種類を分離することはできませんでした。 現在の研究では、マウスのマイクロアレイデータを比較することにより、近位尿細管細胞に関連するDEGを探索しようとしました。腎臓およびヒトの原発近位尿細管Stx2で処理した細胞。

3.2. Gb3 発現細胞における既知の Stx2 活性に関連した Stx2- 誘発病理に関与する近位尿細管因子

3.2.1. 活性 (I)、Gb3 への Stxs の結合によって誘導されるシグナル伝達

Stxs の B サブユニットは、非受容体 src チロシンキナーゼ Yes リン酸化を誘導します [4]。 リン酸化された Yes は、そのキナーゼ活性によって下流のシグナル伝達分子を活性化し、細胞骨格のリモデリングを引き起こします [5]。 Yes による Y357 の Yes 関連タンパク質 (YAP) リン酸化は、YAP の核移行を誘導することが知られており、転写活性化活性化因子として働き、CTGF などの標的遺伝子を誘導します [38]。 マトリセルラータンパク質 CYR61 (CCN1) および CTGF (CCN2) は細胞外マトリックス (ECM) に分泌され、受容体インテグリンおよび細胞表面結合ヘパラン硫酸プロテオグリカン (HSPG) に結合することで細胞と ECM の接着の維持に寄与します [39,40]。 CCN1 および 2 転写の鍵となる分子は YAP であり、通常の状態では Hippo シグナル伝達経路の下で不活性に保たれます (セリン残基 127 がリン酸化されています)。 細胞間接着の低下が検出されると、YAP (S127) はリン酸化されなくなり、核に侵入できるようになり、CCN1 および 2 の転写が増加します [41-43]。 CCN1 および 2 は、細胞を失った組織を修復する創傷治癒分子として機能します [38,44]。 私たちのデータセットでは、CCN1 と 2 は早い時点 (6 時間) に小さなピークを持っていました。 これは、Stx2 結合による Yes 活性化を反映している可能性があります。 その後、脱落が Hippo シグナル伝達経路のスイッチをオフにすることでさらなる YAP 活性化を引き起こし、12 時間以降に CCN1 および 2 のより多くの発現を誘導した可能性があります (図 5C)。

3.2.2. アクティビティ (II)、ER ストレス/UPR の誘導

Stx は ER に到達し、そこで切断された A1 フラグメントと B サブユニットが折り畳まれていないタンパク質を模倣します [9、10、45、46]。 グルコース調節タンパク質 78 kDa (Grp78、結合免疫グロブリンタンパク質 (Bip)) は、3 つの UPR 主要タンパク質、イノシトール要求性酵素-1 (Ire-1)、プロテインキナーゼ R 様小胞体キナーゼ (PERK) を固定しています。 ）、正常状態ではER膜の転写因子6（ATF6）を活性化します。 しかし、折り畳まれていないタンパク質に対する Grp78 の親和性が高いため、それらのアンカーされたタンパク質が放出されます。 ATF6 は放出後に活性化され、CHOP (DDIT3) と X-box 結合タンパク質 1 (XBP-1) mRNA を増加させますが、Ire-1 は XBP-1 mRNA をスプライスして XBP{{ CHOP (DDIT3) 転写に寄与する 22}} タンパク質。 PERK の活性化は ATF4 の活性化を引き起こし、CHOP (DDIT3) mRNA も増加します。 したがって、CHOP (DDIT3) mRNA の増加は UPR の特徴です [47,48]。 Stx は UPR と CHOP (DDIT3) を誘導すると報告されており、データセットでは上方制御されています (図 5D–G)。

GDF15 はトランスフォーミング成長因子ベータ (TGF) ファミリーに属します。 最近、GDF15 が糖尿病薬メトホルミン誘発性の体重減少を媒介することが示されました [49]。 メトホルミンを経口投与されたマウスでは、腸および腎臓の GDF15 mRNA が増加し、その結果、血清 GDF15 が上昇しました。 循環する GDF15 は脳幹限定受容体を介して作用し、食物摂取を抑制し、体重を減少させます [50]。 メトホルミンを投与されたマウスでは、腎臓の GDF15 の増加は少なくとも部分的に CHOP (DDIT3) の制御下にあります。 Stx2- を注射したマウスの腎臓のデータセットでは、CHOP (DDIT3) は最初 4 時間で非常に小さなピークで増加し、その後 48 時間に向けて増加傾向を示し始め、log2- のレベルを維持しました。 }}約 1.3 倍の変化 (図 5E)。 STRING クラスター分析によると、GDF15 は転写因子 CHOP (DDIT3) および ATF3 から活性入力を受け取ります (図 5E) [51,52]。 Stx2-を注射されたマウスの体重は、24時間後に減少するか、または生理食塩水対照から逸脱し始めました（図S3B）。 12時間後の腎臓におけるGDF15 mRNAの増加は、脳幹に影響を与えて食物摂取量を減らした可能性があり、その結果、体重減少として現れた(図5EおよびS3B)。 GDF15 発現レベルは 24 時間後も高いままであるため、マウスの体重は減少し続けました (図 5E および S3B)。

ER ストレスを受けると、PERK は Grp78 (Bip) から放出され、オリゴマー化して eIF2 をリン酸化して阻害し、ATF4、CHOP、Grp78 などの少数の UPR 応答性タンパク質を除いて全体的な翻訳抑制につながります。 GADD34 (タンパク質ホスファターゼ 1 制御サブユニット 15A (PPP1R15A)) は、リン酸化 eIF2 (eIF2 (P)) 関連阻害下で増加するタンパク質の 1 つであり、データセットで上方制御されます (図 5D、G)。 GADD34 は、eIF2 (P) を脱リン酸化して UPR 誘導性のタンパク質合成阻害を負に制御するタンパク質ホスファターゼ -1 です [53]。 GADD34 (PPP1R15A) の発現は、データセットの Stx2 の 12 時間後に対数2-倍変化が 1 より大きくなり、24 時間まで増加し続け、その後プラトーに達し (対数2-}倍変化が 2.1 に等しい)、これを維持します。最後までレベルを維持します (図 5D、G)。 これは、Stx2- 誘発 UPR が 12 時間後に負のフィードバックを持ったことを示唆しています。 CHOP (DDIT3、GADD153) の転写と翻訳の増加は ER ストレスの特徴であり、差次的発現パターンは 24 時間後に 1 より大きい log2 が発生し、その後徐々にプラトーになる点を除いて GADD34 に似ています (log2 は 1.3 に等しい) (図 5D、G)。 また、CHOP の主な二量体化パートナーである CEBPB は、データセットで上方制御されています (図 5D、G)。 これらの結果は、Stx2-誘発性の小胞体ストレスは時間経過の非常に早い段階から始まるが、効果は24時間まで増加し、最後までこのレベルの小胞体ストレスを維持する一方、負のフィードバックアームも同時にバランスをとることを示唆している。

3.2.3. 活性 (III)、リボソーム不活化タンパク質 (RIP) 活性

Stx は rRNA からアデニンを切断することにより、新たなタンパク質合成を阻害します。 脱プリン化された rRNA はリボソーム形態の変化に影響を及ぼし、リボ毒性ストレス応答 (RSR) として知られるシグナル伝達 [11] を活性化し、特徴的な遺伝子活性化を引き起こします (次の段落を参照)。

3.2.4. 活性 (IV)、リボ毒性ストレス応答 (RSR) 活性

ZAK (MAPKKK) は RSR の既知のキナーゼであり、下流の JUN N 末端キナーゼ (JNK) および p38 MAPK 経路を活性化します [12、15]。 Stx1 はヒト腸上皮細胞において JUN および FOS mRNA 発現を誘導し、この現象には RSR 制御下にあると考えられる RIP 活性陽性 Stx1 が必要でした [15]。 別の RSR 下流分子である p38 MAPK は、JUN、FOS、EGR1、MAFF、DDIT3、ATF3 などの早期応答遺伝子を誘導することが知られており [54]、これらはすべて我々のデータセットでは差次的に発現されていた。 JNK および p38 MAPK 経路は、UPR の下で Ire-1 の下流イベントが活性化されることも知られています (図 4B、D および 5B、E、F) [47]。 このため、Stxs は RSR および/または UPR を介してこれら 2 つの経路を活性化する可能性があります。 細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) 1/2 経路も RSR の下流にあることが示されており [55]、DUSP1 (MKP1) 遺伝子は ERK1/2 経路によって誘導されることが知られています [56]。 Stx1 とアニソマイシン (別のタンパク質合成阻害剤) は、Caco-2 細胞で DUSP1 発現を誘導することができます [57]。 私たちのデータセットでは、DUSP1 発現が誘導されており、これは ERK1/2 の活性化を示している可能性があります (図 4B、D)。

3.2.5. アクティビティ (V)、サイトカインにつながる特定の遺伝子転写

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >それぞれ 24 時間後と 48 時間後の 1 (図 5F)。 これは、両方の NF-κB 経路、IκB (古典的) と RelB (代替) の下の hat 遺伝子が誘導されることを示唆しています。 24時間後にCHOP (DDIT3) の差次的発現が1を超えるlog2を超えると、マウス腎臓がUPRを受け、活性化されたPERKが真核生物の翻訳開始因子2サブユニットα(eIF2)をリン酸化してNFKBIAの翻訳を阻害する[60]。 このため、NFKBIA mRNA の増加は NF-κB 経路の多くを阻害しない可能性があり、したがって炎症因子の転写は許容されます (図 5L)。

ソッベら。 [61]は、古典的 (RelA-p50) NF-κB 経路と代替 (RelB-p52) NF-κB 経路の両方が Stx 注射マウスで活性化し、RelA 標的サイトカイン CCL20、CXCL1、および CXCL10 の上方制御を検出することを示しました。データセット (図 5L)。

3.2.6. アクティビティ (VI)、Stxs 誘導性アポトーシス

切断されたカスパーゼ 3 は、Stxs 関連の細胞死で発見されています [13、15、62]。 Stxs によるカスパーゼ-3の活性化またはアポトーシスの誘導は、RSR および UPR の状況で発生することが示されています。 Stxs 誘発 RSR では、p38 MAPK 経路と JNK 経路の両方が関与しており [15]、ERK 活性化も報告されています [55]。 一方、UPR は、NF-κB、JNK、および p38 MAPK 経路を誘導することが知られています。 UPR 下の CHOP (DDIT3) はアポトーシスに関与することが示されており [63]、Stxs 関連アポトーシスにも示されています [13]。 UPR 誘発アポトーシスへの JNK の関与も報告されています [64]。 私たちのデータセットでは、CHOP (DDIT3)、NFKBIA、FOS、JUN、JUNB などのいくつかの DEG が RSR と UPR に関与しています (図 5B、F)。

3.3. Stx2による概日調節障害

STEC-HUS 患者では、血清エンドセリン-1 (ET-1、EDN1) の増加が発生します [65]。 また、実験的に、Stx2 は MAPK が関与するシグナル伝達カスケードを活性化することによって EDN1 発現を誘導します [66]。一方、UPR は EDN1 転写を誘導することが知られています [67]。 私たちのデータセットでは、Stx2 処理によりマウス腎臓とヒト近位尿細管細胞の両方で EDN1 発現が誘導されました (図 5G)。 EDN1 遺伝子発現はマウス腎臓とヒト近位尿細管上皮細胞の共通の特徴であるため、EDN1 発現が in vivo で内皮細胞に加えて近位尿細管上皮細胞でも少なくとも部分的に起こることが示されています。 また、分泌された ET-1 は、MAPK 活性化を介して EGR1 発現を誘導します [68]。 私たちのデータは、EDN1 が上方制御されるタイミングで EGR1 の上方制御が確認されています (図 5H)。 EGR1 は概日リズムの主要因子 PER1 の発現を誘導し [69]、他の概日リズム因子の振幅を調整します (図 5H)。

概日調節では、CLOCK-BAML1 のヘテロ二量体 (ARNTL) が PER1 と CRY1 を上方制御します。 その代わりに、PER1-CRY1 ヘテロ二量体は CLOCK-BAML1 (ARNTL) に結合して、自身のさらなる転写を抑制し、概日リズムの負のループを形成します。 したがって、正の制御遺伝子 (CLOCK および BAML1 (ARNTL)) と負の制御遺伝子 (PER1 および CRY1) の発現ピークは 1 時間おきに起こり、CLOCK および BAML1 (ARNTL) の発現が増加すると、PER1 および CRY1 は減少します。パターンは次の時間に切り替わります。 CLOCK と BAML1 (ARNTL) の log2- 倍変化値をグラフ (図 5J) に追加すると、初期の時点では、PER1 と BAML1 (ARNTL) は鋭い/狭いピークを持つ反対のリズミカル パターンを示しました。しかし、24 時間後、ピークは鈍くなり始め、リズムなく増加し続けます。 これは、Stx2 が近位尿細管内を含む腎臓の概日リズムに影響を与えたことを意味します。 さらなる確認実験が必要であるが、我々のデータは、刺激に対する腎臓の概日調節に対するPER1の影響を説明する公表文献[70,71]と組み合わせると、Stx2が概日リズムの乱れに関与している可能性や、腎時計遺伝子の減少による近位尿細管機能への影響を示唆している。 SGLT1 (SLC5A1) などの調節因子 (図 5K)。 実際、我々は Stx2- を注射したマウスで血糖を観察しましたが、これは Stx1- を注射したマウスを用いた別の研究で繁殖し [21]、近位尿細管における SGLT1 (SLC5A1) の機能不全を示しています (表 3)。 我々の知る限り、これは腎臓の概日リズム障害におけるStx2の関与を示す最初の報告である。

4. 結論

Stx2によって変化する近位尿細管関連発現に関わる重要な遺伝子を特定した。 これらの遺伝子の差次的発現は、UPR 誘導、rRNA 脱プリン関連 RSR、細胞膜受容体 Gb3 結合によって誘導されるシグナル伝達などの Stx2 活性の結果であると考えられています。 最も高発現している遺伝子である GDF15 は、食物摂取量を減らすことにより、脳幹限定受容体を介して Stx2 によって引き起こされる体重減少に影響を与える可能性があります。 細胞外マトリックスと細胞接着は、Stx2- 特異的な組織病理や脱落を引き起こす PDK4、NHERF1 (SLC9A3R1)、CYR61、CTGF の影響を受ける可能性があります。 さらに、Stx2 による腎臓の概日リズムの乱れは、グルコース再吸収などの近位尿細管の機能欠陥を引き起こす可能性があります。

5. 材料と方法

5.1. 動物 ネズミ

（C57BL/6、雄、19～22 g、特定の病原体を含まない）は、チャールズ リバー ラボラトリーズ ジャパン株式会社（横浜、日本）から購入しました。 食物と水は自由に与えた。 マウスは標準的な 12 時間:12 時間の明暗サイクルで維持され、午前 7 時に点灯し、午後 7 時に消灯されました。動物の室温は約 24 °C に維持されました。 すべての手順は大学動物管理委員会によって承認されました。

5.2. ヒト腎臓組織

この研究では個人識別情報のない死体組織が使用されましたが、大学の人体調査ガイドラインでは除外されていると考えられています。

5.3. 細胞培養

ヒト腎近位尿細管上皮細胞 (RPTEC) 初代培養物は Clonetics (米国メリーランド州ウォーカーズビル) から購入し、37 °C、5% CO2 雰囲気で維持しました。 細胞は、ヒト上皮成長因子、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、インスリン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、GA-1000、および FBS を添加した腎上皮細胞増殖培地で培養されました。

5.4. LPS フリー Stx2 の精製 Stx2 からの LPS 除去は、以前に記載されているように実行されました [72]。 簡単に説明すると、抗 Stx2 11E10 抗体結合カラムを使用して Stx2 画分を取得し、その後その画分を Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific、ロックフォード、イリノイ州、米国) に通しました。 LPSを削除します。 Stx2画分を0.2μmフィルターで濾過し、LPSレベルをカブトガニ変形細胞ライセートアッセイ（Pyrotell、Associates of Cape Cod Incorporated、East Falmouth、MA、USA）でテストしました。 Stx2 画分は、0.03 エンドトキシン単位 (EU)/mL 未満であると測定されました。 Stx2 バリアント タイプは Stx2a でした。

5.5. マウスへの Stx2 投与 4 日以内にマウスを死亡させる 2LD50 用量 (5 ng Stx2/体重 20 g) (図 S3A) を、LPS を含まない生理食塩水中の 0.1 mL の量でマウスに腹腔内注射しました。 （大塚製薬、日本）。 毒素注射は午前7時から9時の間に行われ、より長い時間コースのマウスには午前7時にStx2を投与し、その後午前7時に24時間、48時間、および72時間サンプリングを行った。

5.6. 採尿と尿糖測定 Stx2 注射 2、6、8、12、24、36、48、60、84 時間後に尿を採取し、Fuji dry chem slide GLU- に 10 µL を滴下しました。 P III (富士フイルム、神奈川県、日本) が管理する施設で、富士ドライケム 7000 V (富士フイルム) を使用して尿糖を測定しました。 Stx2 注射前の尿を 0 時間のサンプルとして使用しました。 2匹のマウスを用いて採尿を行った

5.7. 組織処理 Stx2 注射の 2、4、6、8、12、24、48、および 72 時間後、各時点で 3 匹のマウスを CO2 で安楽死させ、腎臓を採取しました。 1 つの腎臓の半分を 4% パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水で 4 °C で 7 日間固定し、パラフィン切片用に処理しました。 腎臓のもう半分を使用して、マイクロアレイ分析用の RNA を抽出しました。 何の処置も施さない３匹のマウスを正常（ナイーブまたは｛｛１６｝｝時間）対照として使用した。 ３匹のマウスにＰＢＳ（ビヒクル）を注射し、７２時間で屠殺し、ビヒクル対照として使用して、正常対照と比較して遺伝子発現の変化が無視できることを示した。

5.8. 過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色 パラフィン切片を水和し、0.5% 過ヨウ素酸溶液で染色し、その後蒸留水ですすぎました。 切片をシフ試薬に移した。 切片を0.6%重亜硫酸ナトリウム溶液で十分に洗浄した後、ヘマトキシリンで対比染色した。

5.9. ヒト RPTEC での Stx2 処理 RPTEC 細胞を 10 ng/mL の Stx2 で 6、13、および 19 時間、37 °C、5% CO2 下で処理しました。 Stx2処理を行わないRPTECを対照として使用した。 時点ごとに 2 つの生物学的レプリカを実行しました。 PBSで洗浄した後、細胞をRNA抽出に使用した。

5.10. 自由浮遊免疫蛍光染色 自由浮遊切片の処理のために、Omata et al. に記載されているように正常なマウスを灌流固定しました。 [69]。 次に、マウスの腎臓を解剖し、穏やかに撹拌しながら 4% PFA/PBS に 4 °C で 3 時間浸漬しました。 組織を PBS で洗浄し、30% スクロース/PBS で 4 °C で一晩または底に沈むまで凍結保護しました。 厚い凍結切片 (50 μm) を凍結設定のスライド式ミクロトームで切断しました。 切片を PBS 中の 1:50 ヤギ抗ラット IgM 抗体 (F104UN、American Qualex International, Inc.、サンクレメンテ、カリフォルニア州、米国) で 1 時間ブロックし、ブロッキング溶液中で 1:100 の抗 Gb3/CD77 抗体とインキュベートしました。溶液またはアイソタイプ コントロール (ラット IgM) を一次抗体として一致した濃度で 4 °C で一晩静置します。 洗浄後、切片を二次抗体（抗ラット IgM Alexa Fluor 488、PBS で 1:2000 希釈）とともに 4 °C で 2 時間インキュベートしました。 二次抗体抗ウサギ IgG Alexa を使用して、他のプローブ AQP1 (1:1000 希釈、シグマ アルドリッチ ジャパン、東京、日本) および CD31 (550274、1:50 希釈、BD Biosciences、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国) について切片を染色しました。それぞれ、Fluor 546 (PBS で 1:2000 希釈) および抗マウス IgG Alexa Fluor 647 (PBS で 1:2000 希釈)。 PBS で洗浄した後、40、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、D21490、Thermo Fisher) 染色を 4 °C で 15 分間行いました。 切片は、溶液が交換されるたびに小さなペイントブラシを備えた 96- ウェルプレート (U 字型) のウェル内の液体に浸されました。 洗浄ステップは、12- または 6- ウェルプレートなどの大きなウェルで行われました。 カバースリッピングには水性封入剤を使用しました。 ヒト組織の調製では、死後腎臓を 20% ホルマリンで 2 週間固定し、抗ヒト CD31 抗体 (CBL468、1:20 希釈、Merck KGaA、ダルムシュタット) を除き、マウス組織の場合と同様に浮遊調製用に処理しました。 、ドイツ）が使用されました。

5.11。 マイクロアレイ解析

腎臓の半分を 2 mL の RNALater (Ambion、オースティン、テキサス州、米国) に 4 °C で浸し、Rneasy Midi キット (Qiagen、カリフォルニア州サンタクラリタ、米国) で全 RNA を抽出しました。 マウスゲノム 430A 2.{6}} アレイ (Affymetrix、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用しました。 CEL ファイルは取得され、堅牢なマルチチップ平均化 (RMA) で正規化され、RNA コピー数の計算、および 0 時間に対する倍数変化は、パッケージを備えた R (v.3.6.0) で実行されました。 affy [73] および RankProd 2.0 [74]。 データは対数倍変化値で表示されます。2- データセットは Gene Expression Omnibus (GEO) に寄託されています (アクセッション番号 GSE172465)。 RPTEC 細胞から、RNAgents Total RNA Isolation System (Promega、東京、日本) を使用して全 RNA を抽出しました。 全ヒトゲノムオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(44KオリゴヌクレオチドDNAマイクロアレイ、アジレントテクノロジーズ、東京、日本)をマイクロアレイ実験に使用した。 全 RNA サンプルは、Cy5- および Cy3- 標識 cDNA プローブの調製に使用されました。 蛍光標識されたサンプルは各スライドガラス上でハイブリダイズされ、洗浄され、その後 DNA マイクロアレイ スキャナー (モデル G2505A; Agilent Technologies) でスキャンされました。 特徴抽出および画像分析ソフトウェア (Agilent Technologies) を使用して、アレイ内のすべてのスポットの位置を特定して描写し、強度を統合した後、局所加重散布図平滑化法を使用してフィルター処理および正規化しました。 マイクロアレイ解析の再現性は、各実験で色素交換を 2 回繰り返すことによって評価されました。 コントロールと、6、10、または 19 時間で採取した Stx2- 処理 RPTEC 間の mRNA 発現の差異を比較しました。 GeneSpring ソフトウェアからの TXT 形式データを使用して、プローブ ID から遺伝子名を決定し、倍率変化を log2- 倍率変化に変換しました。 データセットは GEO に寄託されています (受託番号 GSE172466)。

5.12. マイクロアレイ データのバイオインフォマティクス分析と視覚化マウス腎臓と RPTEC マイクロアレイ データの両方で、両方に共通し、発現の変化が 2- 倍を超える遺伝子の減少または増加 (または対数 2- 倍の変化)は、-1 より小さいか、1 より大きいかのいずれかです) は、任意の時点で R によって選択されました。さらに、マウス腎臓マイクロアレイ データにおいて。 三次曲線に適合する遺伝子変化は、R パッケージ maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (最終アクセス日 2022 年 1 月 4 日)] [75] を使用して選択されました。 三次曲線は、時間経過中のこれらの遺伝子の増加または減少に対応するのに適しています。 3 次曲線などのより高い多項式の次数を使用すると、2 次曲線よりも優れた時間経過中に複数の変化を持つ遺伝子を選択できます。 同様の軌跡で挙動する遺伝子がクラスター化され、その減少/増加パターンが R パッケージ gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (最終アクセス日 1 月 4 日) を使用したヒート マップによって視覚化されました。 2022年）] [76]。 遺伝子オントロジー (GO) が割り当てられ、Metascape [http://metascape.org (最終アクセス日 2022 年 1 月 4 日)] [77] を使用して、一般的な遺伝子の中の GO の機能が強化されました。 共通遺伝子の接続/関係は、STRING [https://string-db.org/ (最終アクセス日 2022 年 1 月 4 日)] [78] を使用して分析されました。 共通遺伝子間の関連性は、STRING のテキストマイニング機能を使用するだけでなく、手動でも検索されました。

参考文献

1. ジャナントニオ、C. ヴィタッコ、M. メンディラハルズ、F. ルッティ、A. Mendilaharzu、J. 溶血性尿毒症症候群。J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [クロスリファレンス] 

2.ヴィツキー、BH; 鈴木裕也； ストラウス、L. Churg, J. 溶血性尿毒症症候群: 腎臓の病理学的変化の研究。午前。 Ｊ．パソール。1969, 57, 627–647. 

武田 哲也、３． 土肥、S. 五十嵐哲也 山中 哲也; 吉谷和也； 小林 N. ベロ毒素による尿細管機能の障害は、溶血性尿毒症症候群に見られる腎障害の一因となります。J.感染する。1993, 27, 339–341. [クロスリファレンス] 

片桐優、４． 森 哲; 中島博司; 片桐C. 田口哲也; 武田 哲也; 清川直也； Fujimoto, J. 低密度の界面活性剤不溶性マイクロドメインにおけるグロボトリアオシル セラミド (Gb3/CD77) への志賀毒素の結合によって誘導される Src ファミリー キナーゼ Yes の活性化。Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。1999, 274, 35278–35282. [クロスリファレンス] 

5. 竹之内博史； 清川直也； 田口哲也; 松井、J. 片桐裕； 沖田博司; 奥田和也 Fujimoto, J. グロボトリアオシル セラミドに結合する志賀毒素は、ヒト腎癌由来細胞の細胞骨格リモデリングを媒介する細胞内シグナルを誘導します。J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [クロスリファレンス] [パブメッド] 

6. ガーレッド、O. ヴァン・ドゥールス、B. Sandvig, K. フューリンによる志賀毒素の切断と活性化。Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。1995, 270, 10817–10821. [クロスリファレンス] 

7. マジョール、I。 フェラーリ、D. Söling, HD 酸化環境におけるタンパク質のジスルフィド結合の還元。 コレラ毒素 A サブユニットのジスルフィド橋は小胞体で還元されます。FEBSレター。1997, 401, 104–108. [クロスリファレンス] 

8. スプーナー、RA; ワトソンPD。 マースデン、CJ; スミス、ワシントンDC。 ムーア、カー。 クック、日本; 主よ、JM。 Roberts, LM タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、小胞体内でリシンをその A 鎖と B 鎖に還元します。生化学。 J.2004, 383, 285–293. [クロスリファレンス] 

9. ユウ、M. Haslam, DB 志賀毒素は、管腔シャペロン HEDJ/ERdj3 との相互作用後に小胞体から輸送される。感染する。 免疫。2005, 73, 2524–2532. [クロスリファレンス] 

10. ファルギエール、T. Johannes, L. 志賀毒素 B サブユニットは、シャペロン BiP および核小体タンパク質 B23 に結合します。バイオル。 細胞2006, 98, 125–134. [クロスリファレンス]