カンカ チューブローサⅢ由来スクロース合成酵素の遺伝子クローニング、機能同定、構造および発現解析

4 乾燥ストレス下のカンカ尿細管各部および細胞培養系におけるCtSusの発現解析

4.1 カンカ尿細管の各部位における CtSus の発現解析

インビトロでの全細胞形質転換実験と酵素触媒反応実験により、CtSus遺伝子によってコードされるタンパク質がUDP-グルコースの合成を触媒できることが確認された。この遺伝子とカンカにおけるグリコシド化合物の生合成との相関をさらに調べるために、カンカのさまざまな部分におけるこの遺伝子の発現レベルを分析した。

10-98% エキナコシドを含む高品質のシスタンケ ハーブ

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>空中部分。中でも、ハウストリア中のエキナコシドの含有量が最も高い。

カンクイの各部位のcDNAを鋳型としてリアルタイム蛍光定量PCRを行い、その結果を2-ΔΔCT法により解析し、示差解析を行った。結果を図 4A に示します。吸口における CtSus 遺伝子の発現量は地上部の 1.5 倍と最も高く、地下部の発現量は地上部よりも有意に高かった。これはフェニルエタノイド配糖体の蓄積パターンと一致している。カンクサのさまざまな部分ではエキナコシドに代表されます。

図 4 PEG6000 で処理した C. tubulosa およ​​び浮遊細胞のさまざまな部分における CtSus の相対発現レベル。 A: C. tubulosa のさまざまな部分における CtSus の相対発現レベル。 B: 異なる時点でPEG6000で処理したC. tubulosa懸濁細胞におけるCtSusの相対発現レベル。 n=3、𝑥̅± s.*P ＜ 0.05、***P ＜ 0.001

4.2 乾燥ストレス条件下におけるCistanche desserticola懸濁細胞におけるCtSusの発現解析

このプロジェクトに関する予備研究では、PEG6000 によって引き起こされる干ばつストレスにより、Cistanche desserticola 懸濁細胞におけるフェニルエタノール配糖体の蓄積が大幅に増加する可能性があることが示されました。誘導後 3 日から 9 日にかけて、エキナセアシド含有量は大幅に増加しました。 12日目から15日目にかけてエキナコシド含有量の増加率は鈍化し、15日目に最大値に達した。その後、培養時間が増加するにつれて、エキナコシド含有量が大幅に増加しました。フルクトシドの含有量は徐々に減少しました[24]。この研究に基づいて、本論文では、未処理のカンクサ懸濁細胞および PEG6000- で誘導されたカンクサ懸濁細胞の cDNA をテンプレートとして使用し、リアルタイム蛍光定量 PCR 検出を実施して、カンクサ懸濁細胞の CtSus 遺伝子を検査しました。干ばつストレス状態。発現レベルの変化。結果を図 4B に示します。 PEG6000により誘導されたCistanche desserticola浮遊細胞では、CtSusの発現は誘導後6日目に顕著に増加し、9日目に最高値に達し、その後コントロールと同じレベルに戻った。同じレベルのグループ。上記の結果は、乾燥ストレスがキスタンケ デスティコーラ浮遊細胞株における CtSus 遺伝子の発現を大幅に増加させる可能性があることを示しており、これは乾燥ストレス下でのエキナセアシドの蓄積パターンと一致しています。ただし、CtSus 遺伝子のピーク発現は、エキナセアシド含有量のピークよりも早く現れます。これは、CtSus 触媒によって合成される活性グリコシル供与体が、その後のエキナセアシド生合成経路における多段階のグリコシル化反応に必要な重要な前駆体であるためです。 、乾燥ストレスにさらされた後、生物は一次代謝に関連する遺伝子を優先的に動員して活性ドナーの蓄積を達成し、その後代謝産物の重要な二次代謝蓄積を達成すると推測されています。

5 CtSusタンパク質の立体構造に関する研究と主要な活性部位の解析

グリコシル供与体であるUDP-グルコースの生成を触媒するCtSusの機能に基づいて、CtSus触媒活性の構造的基礎をさらに研究した。オンライン ツール SOPMA を使用して、タンパク質の二次構造を予測しました。その結果、CtSusの二次構造には55.28%のαヘリックス、25.47%のランダムコイル、12.80%の伸長鎖、および6.46%のαターンが含まれていることが示され(図5A)、αヘリックスがCtSusタンパク質の最も重要な二次構造単位であることが示されました。次にランダムコイルが続きますが、これもタンパク質の大部分を占めます。伸長したストランドとターンはタンパク質全体に分布しています。既存の研究によると、スクロース合成酵素は通常四量体の形で存在し、それがその活性型であると考えられています。そこで本論文では、さらにAlphaFold2を用いてCtSusタンパク質の構造を予測し、タンパク質四量体の三次元構造を取得した。 PDB (Protein Data Bank) データベースの比較により、シロイヌナズナのスクロース シンターゼ AtSus1 (PDBID 3S28) と CtSus の間の配列類似性が 77.93% に達する可能性があることがわかりました。予測された CtSus 構造を AtSus1 の三次元構造と比較したところ、タンパク質を重ね合わせた後の二乗平均平方根偏差 (RMSD) 値は 1.11 Å であり、両者の空間構造が非常に一致していることが示されました (図 5B)。

図 5 CtSus の構造研究。 A: SOPMA を使用して予測された CtSus の二次構造。Blue: らせん。紫: ランダムコイル。赤: 伸びたストランド。緑：シート。 B: AtSus1 (青色) と CtSus (緑色) の三次元構造の配置。両方とも四量体として示されました。C: AtSus1 (青色) および CtSus (標識された残基を持つ緑色) の基質結合ポケット内の重要な残基。 D: AtSus1 (青色) および CtSus (緑色) における UDP とフルクトースの結合立体構造のアラインメント。 E: Discovery Studio クライアントによって分析された 2D 図で示された UDP と CtSus 間の相互作用

報告されているシロイヌナズナ AtSus1 の UDP およびフルクトースとのタンパク質-リガンド結晶複合体構造 (PDBID3S29) をテンプレートとして使用し [16]、UDP およびフルクトースとの CtSus の結合モードを分析しました。分子ドッキングの結果を図 5C に示します。 AtSus1とCtSusの基質結合ポケットは、アミノ酸の種類、空間分布、構成の点で非常に類似しており、重複度が高いことが観察でき、スクロースシンターゼの配列が植物において高度に保存されていることを証明している。タンパク質基質結合ポケット内の 2 つのリガンド、UDP とフルクトースの立体構造を図 5D に示します。 UDPとCtSusの分子ドッキングで最も有利な立体構造は、AtSus1-UDP結晶複合体におけるUDPの立体構造とよく重なり、分子ドッキング結果の精度が証明されています。 UDP とタンパク質基質結合ポケット内の主要なアミノ酸残基間の相互作用を図 5E に示します。 UDP と CtSus は主に水素結合と疎水性相互作用によって結合します。基質結合ポケット内の重要なアミノ酸残基には、Leu294、Gly301、Met576、Arg578、Lys583、Gln646、Asn652、Leu677、Thr678、および Glu681 が含まれます。

議論

グリコシル化修飾は、天然物や薬物前駆体の物理的特性や生物活性を改善するための重要な手段の 1 つです。従来の化学的方法と比較して、酵素的グリコシル化修飾には、反応条件が穏やかで、選択性が高く、環境に優しいという利点があります。しかし、糖転移酵素の糖鎖付加反応には多量のUDP-糖供与体が必要であり、高価かつ入手が困難であるため、工業生産に広く使用することができないのが現状である。スクロースシンターゼは、可逆反応（スクロース + UDP ⇌ UDP-グルコース + フルクトース）を触媒し、グリコシルトランスフェラーゼとのカップリング反応を通じて再生可能な UDP-グルコースサイクルを形成できます。カンカには、フェニルエタノール配糖体化合物に代表される、構造タイプの異なるさまざまなグリコシド化合物が豊富に含まれており、その体内のスクロースシンターゼを含む活性なグリコシル供与体合成経路は強力な代謝を持っているが、カンカ植物の関連するスクロースシンターゼは代謝されていないことが示唆されています。報告されている。この研究では、スクロース合成酵素遺伝子 CtSus がカンカから初めてクローニングされました。この遺伝子によってコードされるタンパク質には、植物スクロースシンターゼの保存されたドメインが含まれています。他の植物のスクロース合成酵素の配列を比較したところ、同目の植物のスクロース合成酵素とのアミノ酸配列の類似性は90%以上であることが判明し、植物のスクロース合成酵素の配列が高度に保存されていることを示した。分子進化解析により、CtSusは双子葉植物のスクロースシンターゼ分枝に属し、Orobanchaceae科のP.ramosa由来のスクロースシンターゼPrSusに最も近縁であることが示された。

CtSusの触媒活性を調べるために、本研究では、研究グループによって以前にその活性が検証されている糖転移酵素UGT71BD1を組み合わせて、二重プラスミド共発現系を構築した。全細胞触媒実験を通じて、UDP 糖供与体を追加することなくこの条件が達成されました。クマリン化合物シナモンとスチルベン化合物レスベラトロールのグリコシル化反応。対照群と比較して、CtSus の添加により、UGT71BD1- が触媒するグリコシル化反応の変換率が大幅に増加しました。これに基づいて、この研究はさらに CtSus 組換え発現プラスミドを構築し、大腸菌での組換えタンパク質の可溶性発現を達成しました。インビトロの酵素触媒反応は、スクロースとUDPの存在下で、CtSusがUDP-グルコースの生成を触媒することができ、組換えタンパク質に含まれるトリガー因子アフィニティータグが除去された後、CtSusの生成物がUDPの生成を触媒することを示しています。・ブドウ糖が得られる。率が大幅に向上しました。全細胞形質転換およびインビトロ酵素触媒反応の結果により、スクロースシンターゼ触媒活性糖供与体UDP-グルコースとしてのCtSusの活性が確認された。 CtSus 遺伝子とカンカにおける配糖体の生合成との相関をさらに調べるために、カンカのさまざまな部分における CtSus の発現をリアルタイム蛍光定量 PCR 実験によって分析しました。その結果、この遺伝子はCistanche tuberosumの吸器で発現していることが示された。最高の発現レベル。カンクサは寄生植物であるため、光合成によって成長と発育に必要な栄養素を得ることができません。したがって、宿主植物の根に寄生し、成長を維持するために栄養を得るために宿主植物に依存する必要があります。植物では、スクロースは主にエネルギーと炭素源の供与体を提供します[12]。ただし、スクロースは細胞によって直接利用できないため、さらに分解する必要があります。ハウストリアはカンクサと宿主植物をつなぐ架け橋であり、その成長過程で重要な役割を果たします。重要な

[25]、したがって、Cistanche desserticola の吸器におけるスクロースシンターゼの高い発現は合理的である。吸器における CtSus の高発現は、吸器におけるフェニルエタノイド配糖体の大量蓄積パターンとも一致します。さらに、乾燥ストレス下でのさまざまな時点でのカンクサ懸濁細胞における CtSus 遺伝子発現レベルの変化の蛍光定量的 PCR 分析を通じて、乾燥ストレスが懸濁細胞株における CtSus 遺伝子の発現を大幅に増加させる可能性があることが判明しました。エキナセアシドと一致します。乾燥ストレス下の浮遊細胞株における蓄積パターンは一貫しています。上記の結果は、CtSus が生体内でのカンクサのエキナセアに代表されるフェニルエタノイド配糖体の生合成経路に関与していることを示唆しています。それは多くの生合成経路の 1 つです。第 1 段階のグリコシル化反応により、活性なグリコシル供与体である UDP-グルコースが生成されます。要するに、この研究は、

この研究により、Cistanche desserticolaの新しいスクロース合成酵素遺伝子が同定され、これにより活性グリコシル供与体のin vitro酵素合成が可能となり、Cistanche desserticola配糖体の生合成用細菌の構築に新たな遺伝要素が提供された。

著者の貢献: Tian Weisheng は、バイオインフォマティクス分析、発現分析、酵素活性分析、および CtSus 遺伝子の初稿の執筆を担当しました。 Yan Yaru は遺伝子スクリーニングとクローニングを担当しました。 Cui Xiaoxue と Huang Wenqian はバイオインフォマティクス分析と発現分析に参加しました。 Wang Yingxia と Zhao Saijing はベクター構築と酵素活性分析に参加しました。 Li Jun と Shi Shepo は主に酵素活性分析と発現分析を指導しました。 Tu Pengfei と Liu Xiao は、論文のアイデア設計、実験の指導、論文の執筆と改訂を担当しました。著者全員が論文の改訂に参加しました。

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