LaminariaJaponicaフコイダンとCistancheTubulosa抽出物の相乗的な抗炎症効果
Mar 03, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
概要
ザ抗炎症薬フコイダンとカンカニクジュヨウ （CT）抽出物は、Vitroマクロファージ培養システムおよびinvivoカラギーナン誘発エアポーチ炎症モデルで調査されました。カンカニクジュヨウ抽出物は、フコイダンが不活性である間、活性化されたRAW264.7マクロファージ細胞からの一酸化窒素産生を阻害しました。 インビボエアポーチ炎症モデル、カラギーナン誘発性血管滲出液、および滲出液中の一酸化窒素およびプロスタグランジンE2濃度の増加は、フコイダンまたはCistanche Ttubulosaエキス。 さらに、組織の炎症は、併用療法によって実質的に弱められた。 ただし、炎症性フコイダンとCTであるが、細胞浸潤(カンカニクジュヨウ)それぞれ著しく減少した細胞数を抽出します。 したがって、フコイダンは炎症性セル、CT（カンカニクジュヨウ）抽出物は細胞の活性化を阻害し、それらの併用治療はさまざまな種類の炎症の緩和のための有望な候補となる可能性があります。
キーワード：カラギーナン、炎症、フコイダン、カンカニクジュヨウエキス。
外来抗原に対する免疫応答として、マクロファージは腫瘍壊死因子-（TNF-）、インターロイキン-1（IL -1）、IL-6などの炎症性サイトカインを放出します。 [1,2]。 このようなサイトカインは、損傷した組織への顆粒球、単球、リンパ球、肥満細胞の走化性流入を誘発し、抗原の除去と組織の回復を促進します[3,4]。 しかし、細胞の過剰な浸潤と活性化は組織の損傷を悪化させ、炎症のよく知られた現象である浮腫（血管の滲出）と痛みを引き起こします。
TNF-は、いくつかの細胞株で一酸化窒素シンターゼ（iNOS）遺伝子発現を誘導するための重要な因子です。iNOSの活性化は、殺菌や血管拡張などのいくつかの生理学的機能を調節するだけでなく、一酸化窒素（NO）の生成をもたらします[5-7]。しかし、炎症も引き起こします[8,9]。 組織損傷後、細胞膜リン脂質のホスホリパーゼによる分解により、アラキドン酸が生成されます。 アラキドン酸は、シクロオキシゲナーゼ（COX）によってさらに分解されてプロスタグランジン（PG）になります[10]。 COX-IIによって形成された過剰な量のPGE2は、炎症のためにいくつかのサイトカインを誘発します。 NOとPGE2の両方が炎症と痛みの誘発の主要な要因として作用するため、TNF-およびCOX-II-PGE2経路は炎症過程の主な流れであり、コルチコステロイドおよび非ステロイド性によって阻害されます。抗炎症薬それぞれ薬物（NSAID）[10,11]。
炎症性疾患の治療にはいくつかのステロイドとNSAIDがありますが、これらの薬は免疫系、胃腸管、腎臓、肝臓、中枢神経系、血圧、心臓血管系に悪影響を与える可能性があります[12-14 ]。 したがって、化学療法を置き換えるか、天然物と組み合わせて使用することにより、化学療法の悪影響を最小限に抑える必要があります。
多くの国で広く分布しているLaminariajaponicaやCladosiphonokamuranusなどの海藻からの硫酸塩多糖類複合体であるフコイダンは、長い間東洋医学の治療薬として使用されてきました。 以前の研究では、フコイダンには抗酸化、抗凝固、抗癌、および抗炎症薬活動[15,16]。 したがって、炎症性疾患、虚血、免疫機能障害、および腫瘍に対するフコイダンの有益な効果は、研究者の注目を集めています[17、18]。 一方で、カンカニクジュヨウ（CT）は、中国の伝統的な薬にも広く使用されています。 CT抽出物は、炎症経路でのNO産生の主要な要因であるTNF-αとIL-4の産生を低下させることが報告されています[19]。
このような以前の発見により、フコイダンとCTの併用効果を調査することになりました。(カンカニクジュヨウ)炎症の2つの主要な経路を抽出します。 作用機序を解明するために、カラギーナン誘発性のエアポーチ炎症からの滲出液中のNOおよびPGE2を分析しました[20]。
材料および方法
材料
CTの半精製フコイダンおよび水抽出物(カンカニクジュヨウ)Misuba RTech Co.、Ltd.（Asan、Korea）から入手しました。 フコイダンとCT抽出物は4oCに保たれ、混合（1：3）され、使用前に精製水に溶解され、5 mL/kgの量で経口投与されました。
細胞培養とNOの定量化
マウスマクロファージRAW264.7細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（マナッサス、米国）から購入し、10％ウシ胎児血清と抗生物質[100 U / mLペニシリン（100 U / mLペニシリン）を含むダルベッコの改変イーグル培地（Sigma、セントルイス、米国）で培養しました。 Sigma）および100 µg / mLストレプトマイシン（Sigma）]。 細胞を加湿した5％CO2雰囲気中で37℃でインキュベートしました。
フコイダンとCTの効果を評価するには(カンカニクジュヨウ)NOの分泌に関する抽出物、RAW 264.7細胞（1×1 06細胞/mL）をフコイダンまたはCT抽出物（1〜320 µg / mL）と5分間インキュベートした後、インターフェロン-（IFN- 、10 U / mL）およびリポ多糖（LPS、10 µg / mL）で24時間。 私たちの予備研究では、RAW264.7細胞の活性化のためのIFN-plusLPSによる処理は、24時間まで細胞の生存率に影響を与えず、フコイダンとCT抽出物は1 mg/mLまで細胞毒性がないことが確認されました。 NOの指標として、NOの酸化生成物である亜硝酸塩（NO2–）の濃度を測定しました。 培地を等量のGriess試薬（1％スルファニルアミド、2.5％リン酸中0.1％ナフチルエチレンジアミド）と混合し[21]、室温で10分間インキュベートしました。 亜硝酸塩濃度は540nmで分析され、NaNO2を使用して検量線が作成されました。
動物と治療
オスのICRマウス（7週齢）はDaehan Biolink（Eumseong、Korea）から購入し、一定の環境条件（22±2ºC;40-70パーセント相対湿度;12-時間光）の部屋に収容しました。 -ダークサイクル;150-300ルクスの明るさ）。 ペレット飼料と精製水は自由に摂取できた。 すべての動物実験は、韓国の忠北国立大学（CBNU）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、CBNUのLaboratoryAnimal Research Centerの標準操作手順（SOP）に従って実施されました。
マウス（n =8 /グループ）をフコイダン（18または54 mg / kg）、CTで経口投与した(カンカニクジュヨウ)抽出物（54または162 mg / kg）、またはそれらの混合物（18 + 54、54+162または90+270 mg / kg）を1日1回7日間。 低用量のフコイダン（18 mg / kg）およびCT抽出物（54 mg / kg）は、体重（Km {{14）の表面積変換後の100 mg / body（70 kg）および300 mg/bodyの推定ヒト用量からのものでした。それぞれ、人間の場合は}}/マウスの場合はKm=3）。 フコイダンとCT抽出物の高用量は、単独または混合物で3倍に設定され、最大用量の混合物は、最大の相乗効果を評価するために5倍に固定されました。
フコイダンとCTの初日(カンカニクジュヨウ)抽出物処理では、マウスの裏側に10 mLの滅菌空気を皮下注射して、ポーチを形成しました[22,23]。 2日後と5日後、ポーチに5mLの空気を再注入しました。 最終処理の1時間後、1 mLのカラギーナン（生理食塩水中1％; Sigma）またはそのビヒクル（生理食塩水）をポーチに注入しました。
滲出液の分析
カラギーナン注射の6時間後にエアポーチを1mLの冷食塩水で洗浄し、洗浄液の正味量を記録した。 炎症細胞、好中球、単球、およびリンパ球の総数は、コールターカウンターを使用して決定されました。 NOおよびPGE2の濃度は、相関EIAキット（Assay Designs、Ann Arbor、AnnArboUSA）を使用して、Griess試薬（Sigma）および酵素免疫測定法（EIA）によってそれぞれ決定されました。
組織病理学的検査
ポーチの裏打ち組織を取り除き、中性ホルマリン溶液で固定した。 パラフィン包埋組織スライドをヘマトキシリン-エオシンで染色し、光学顕微鏡下で炎症性病変を調べた。
統計分析
結果は平均±SEとして表されます。 実験グループの比較は、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの検定補正によって行われました。 P値<0.05 was="" considered="" statistically="">
結果
In vitro RAW 264.7細胞培養、IFN-、およびLPS処理により、NO産生が大幅に増加しました（図1）。 フコイダン（1〜320 µg / mL）による前処理は、マクロファージ細胞株からのNO放出に影響を与えませんでした（図1A）。 比較すると、CT(カンカニクジュヨウ)抽出物（32〜320 µg / mL）は、NO生成を大幅に抑制し、抗炎症薬アクティビティ（図1B）。
マウスエアポーチにカラギーナンを注射すると、ポーチ内の滲出液量が著しく増加しました（図2）。 このような滲出の増加は、フコイダン（18 mg / kg）およびCTによる治療によって軽減されました。(カンカニクジュヨウ)抽出物（54および162mg / kg）。 特に、フコイダンとCTの併用治療(カンカニクジュヨウ)抽出物は、個々の効果と比較して、滲出液の量をさらに減少させましたが、より高い用量の組み合わせ（54 + 162 mg/kgおよび90+270 mg / kg）は、最低用量の組み合わせ（18 + 54 mg / kg）に対して追加の有効性を示しませんでした。 （図2A）。 カラギーナン注射後、ポーチ内のNO含有量も大幅に増加しました（図2B）。 フコイダンの軽度の効果と比較して、CT(カンカニクジュヨウ)抽出物はNO濃度を著しく低下させました。 フコイダンとCT抽出物の併用治療は、用量依存的にNOレベルをさらに低下させました。 同様に、増加したPGE2含有量は、フコイダンとCTの併用療法によって相乗的に抑制されました。(カンカニクジュヨウ)抽出物（図2C）ポーチ内の炎症性メディエーターと並行して、カラギーナン注射によって炎症性細胞の数が劇的に増加しました：好中球、単球、およびリンパ球の対照レベルのそれぞれ37.8、4.8、および24.1倍（表1） 。 ただし、フコイダンとCT(カンカニクジュヨウ)抽出物は炎症性細胞浸潤を有意に減少させ、フコイダンはCT抽出物よりもいくらか優れていました。 予期せぬことに、フコイダンとCTの同時投与では、炎症性細胞浸潤における相乗効果は達成されませんでした。(カンカニクジュヨウ)エキス。
滲出液中の炎症性細胞浸潤から推測されるように、エアポーチを取り巻く皮下組織は重度の炎症性病変を示しました（図3）。 対照動物のほぼ正常な特徴（図3A）と比較して、カラギーナンに曝露された肥厚した皮下組織の非常に多くの細胞が観察されました（図3B）。 このような炎症性病変は、フコイダン（図3Cおよび3D）またはCTによる治療によって著しく軽減されました。(カンカニクジュヨウ)抽出します（図3Eおよび3F）。 特に、フコイダンとCTの併用療法により、より高い抗炎症効果が得られました。(カンカニクジュヨウ)抽出（図3G -3 I）
討論
インビボでのカラギーナン誘発性のエアポーチ炎症モデルを使用して、齧歯動物の背中に空気を注入すると、滑膜に類似した構造を形成するために空洞の表面で層状化する細胞の増殖が誘発される。 このモデルでは、カラギーナン誘発性の炎症性細胞浸潤の注射により滲出液が増加し、これは血管漏出を示しています。 エアポーチは、炎症細胞とメディエーターのリザーバーとして機能し、局所的に蓄積する液体で簡単に測定できます。
血管透過性を誘発する可能性のある多様な炎症性メディエーターの中で、NOおよびPGE2が多くの炎症性疾患の病因に関与する主要な要因であることはよく知られています[24,25]。 それらは、痛みの誘発と知覚のメディエーターとしても知られています[10,11]。 iNOSは、炎症時にTNF-および/またはLPSで刺激することにより、さまざまな細胞型で発現および活性化され、高濃度のNOを持続的に生成します[3、5-7]。 NOは、血管拡張などの多様な生理学的機能における重要な調節分子であり、血管漏出を引き起こします[8,9]。アラキドン酸からコックスを介して生成されるPGE2は、多くの炎症性疾患の発症に寄与します[26,27]。さまざまな炎症性刺激に応答したPGE2の過剰産生は、COX-IIレベルのアップレギュレーションと炎症の進行に関連しています[28]。 したがって、TNF - - NOおよびCOX-II-PGE2経路は、炎症プロセスの2つの主要な流れと見なされており、それぞれiNOS（コルチコステロイド）およびCOX（NSAID）の阻害剤によってブロックされます[22,29]。
本研究では、フコイダンとCTの同時投与(カンカニクジュヨウ)抽出物はポーチ内の滲出液の量を減らし、血管漏出に対する抑制活性を持っていることを示唆しています（図2A）。 各フコイダンとCTの個々の効果と比較して(カンカニクジュヨウ)抽出物、併用治療はさらに増加し、2つの化合物の作用が相乗的に作用することを意味します。 フコイダンとCT抽出物の間のこのような相乗効果は、滲出液中のNOおよびPGE2レベルに対するそれらの活性によって裏付けられました（図3Bおよび2C）。
しかし、興味深いことに、フコイダンはマクロファージのinvitroアッセイの活性化を直接阻害しないことが確認されました（図1A）。 同様に、バイオアッセイにおけるNOおよびPGE2の蓄積に対するフコイダンの阻害能は、CTのそれよりも比較的低かった。(カンカニクジュヨウ)抽出（図2Bおよび2C）。 このようなフコイダンの作用機序は、CT抽出物による細胞の直接的な不活化とは異なります（図1B）。 比較すると、フコイダンはポーチ内の炎症性細胞浸潤の抑制に高い効果を発揮しました（表1）。 フコイダンは、好中球、単球、およびリンパ球のカラギーナン誘発組織損傷部位への移動を阻止する点で、CT抽出物よりも優れていました。 興味深いことに、相乗的な抗遊走効果はなく、フコイダンとCT抽出物の間の異なる作用メカニズムを示しています。つまり、フコイダンは炎症細胞の浸潤をブロックしますが、CTは(カンカニクジュヨウ)抽出物は細胞の活性化を阻害します。
多形核細胞、特に好中球は、カラギーナンによって誘発される急性炎症部位に動員される主要な細胞成分です。 さらに、マクロファージやリンパ球などのその後の炎症細胞も、サイトカインを分泌することによって炎症過程において中心的な役割を果たします[22、30、31]。 フコイダンまたはCTで前処理した場合(カンカニクジュヨウ)抽出物では、カラギーナンを注入したエアポーチに移動した白血球の数が著しく抑制されました。 この結果は、デキサメタゾンなどのコルチコステロイドによって得られる効果と一致していましたが、インドメタシンを含むNSAIDによっては得られませんでした[23,30]。 したがって、フコイダンとCT(カンカニクジュヨウ)抽出物は部分的にステロイドの特性を持っています。
炎症性細胞の走化性に対する遮断作用に加えて、CT(カンカニクジュヨウ)抽出物はマクロファージの活性化を抑制するように見えた。 これは、マクロファージによって産生される主要な炎症性メディエーターである、invitroおよびinvivoでのNOに対するその阻害作用によって確認された。 したがって、CTの効果(カンカニクジュヨウ)マクロファージの抽出物は、mRNA発現の抑制および/またはこれらの細胞におけるiNOS活性の直接阻害に起因する可能性があります。
PGE2も主要な炎症性メディエーターの1つです。 これは、COXの阻害剤であるNSAIDによって抑制される組織浮腫と並行して増加します[21,22]。 カラギーナンは、ポーチ滲出液にCOX-II mRNAおよびCOX-IIタンパク質を誘導することにより、PGE2産生を増加させることができます[32]。 このモデルでは、カラギーナンはPGE2の量を大幅に増加させ、CTによって大幅に抑制されました。(カンカニクジュヨウ)エキス。 この結果がNSAIDインドメタシンによって得られるであろう効果と一致していたことに注目することは興味深いです[23]。 したがって、CT抽出物にはNSAIDの追加の特性があることが結果から推測されます。 まとめると、CTは(カンカニクジュヨウ)抽出物は、カラギーナン誘発性炎症モデルにおいてコルチコステロイドとNSAIDのような効果の両方を発揮し、そのフコイダンは抗炎症薬炎症性細胞浸潤をブロックすることによるCT抽出物の効果。
正確な作用機序を定義するにはさらなる研究が必要ですが、フコイダンとCTの混合物(カンカニクジュヨウ) カラギーナン誘発性のエアポーチ炎症におけるTNF-–NOおよびCOX-II–PGE2経路を遮断することにより、著しく弱毒化された炎症徴候を抽出します。 これらの発見は、フコイダンとCTの併用治療の証拠を提供します(カンカニクジュヨウ)抽出物は、コルチコステロイドまたはNSAIDに反応するさまざまなタイプの炎症を緩和するための有望な候補となる可能性があります。
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