SARS-CoVのスパイクタンパク質やその他の構造タンパク質をコードするDNAワクチンとの同時免疫によるマウスの相乗的な免疫と防御-2
Dec 18, 2023
抽象的な：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS CoV-2) の新たな変異種の出現により、世界的な感染爆発が繰り返し発生しています。 これらの高度に変異した変異体は、元のウイルスのスパイク (S) タンパク質のみを標的とするように設計された現在のコロナウイルス感染症 2019 (COVID-19) ワクチンの有効性を低下させます。 SARS-CoV-2 の S を除いて、ワクチン標的抗原としての他の構造タンパク質 (ヌクレオカプシド、N; エンベロープ、E; 膜、M) の免疫防御能力はまだ不明であり、研究する価値があります。 この研究では、4つのSARS-CoV-2構造タンパク質（pS、pN、pE、pM）をコードする合成DNAワクチンが開発され、筋肉内注射とエレクトロポレーションによってマウスに3回の免疫が与えられた。 注目すべきことに、Sタンパク質とNタンパク質を発現する2つのDNAワクチンによる同時免疫は、マウスにおいてSタンパク質単独よりもより高い中和抗体を誘導し、SARS-CoV-2ウイルス量の減少に効果的でした。 さらに、pN または pE + pM との pS の同時免疫化は、3 回の免疫化後により高い S タンパク質特異的細胞免疫を誘導し、攻撃後の pS 単独よりも穏やかな組織病理学的変化を引き起こしました。 N/E/Mタンパク質を含むSARS-CoV-2の保存された構造タンパク質の役割は、mRNAワクチンなどのワクチン設計への応用のためにさらに研究される必要がある。
カンクサ-免疫システムを改善する
キーワード: 新型コロナウイルス-19; SARS-CoV-2}}; 同時予防接種。 DNAワクチン。 スパイクタンパク質。 構造タンパク質
1. はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、2019 年コロナウイルス感染症 (COVID-19) の原因であり、世界中で数百万人の感染と死亡を引き起こし、人間の健康と世界経済を危険にさらしています。 。 効果的な治療アプローチはまだ利用できませんが、CAR-T 細胞療法やナノテクノロジーの応用など、急速に進歩しています [1、2]。 ワクチン接種はパンデミックを制御する効果的な方法であり、いくつかのワクチンがさまざまな規制保健機関によって使用が承認されています[3、4]。 コロナウイルスのゲノムは、4 つの主要な構造タンパク質、すなわち、スパイク (S)、ヌクレオカプシド (N)、膜 (M)、およびエンベロープ (E) タンパク質をコードしており、これらはビリオンの構築と宿主の免疫応答の抑制に関与しています [5] ]。 S タンパク質は、2 つのサブユニット、つまり S1 と S2 を含む 1273 アミノ酸残基で構成されています。 これはウイルスの侵入を媒介し、コロナウイルスワクチン開発の主要な標的となっている[6-11]。 ただし、SARS-CoV-2 S タンパク質には高い変異頻度があります。 当然のことですが、RNA ウイルスである SARS-CoV-2 では、変異が継続的かつ不可避です。 2020 年 9 月以降、B.1.1.7 (英国、アルファ)、B.1.351 (南アフリカ、ベータ)、P.1 を含む 5 つの SARS-CoV-2 の懸念される変異株 (VOC) が出現しました。 （ブラジル、ガンマ）、B.1.617.2（インド、デルタ）、B.1.1.529（南アフリカ、オミクロン）（Andreano and Rappuoli、2021; Gupta、2021）。 それらはすべて、スパイクタンパク質にいくつかの変異を持っています[12]。 これらの変異体は、スパイクタンパク質のみを標的とするように設計された現在の新型コロナウイルス-19ワクチンの有効性を脅かしています。
SARS-CoV-2 の N タンパク質は、ウイルスのコアにある 140- アミノ酸長の RNA 結合ドメインを介して「紐状のビーズ」様式でウイルス RNA に結合します。 これはコロナウイルス間で高度に保存されており、SARS-CoV の配列と約 90% の同一性を共有しており、ビリオン内の唯一の構造タンパク質でもあります [13]。 さらに、ウイルス RNA をリボヌクレオ キャプシド複合体にパッケージングする際に重要な役割を果たし、ウイルス RNA の複製、ビリオンの構築、および宿主細胞からの放出に必要です [14]。 コロナウイルスの N タンパク質の高い配列類似性に基づいて、交差防御ワクチンの標的として示唆される可能性があります。 我々は以前、Eタンパク質とMタンパク質を発現する2つのDNAワクチンによる同時免疫がSARS-CoV-2に対する部分的な防御を提供することを発見しており、この方法はワクチン開発中に考慮されるべきである[15]。 WHO の状況文書に応じて、SARS-CoV-2 ワクチン候補には通常 7 つの戦略があり、さらに 3 つのカテゴリーに分類できます。1 つ目は、不活化ウイルスワクチンを含むタンパク質ベースのワクチン、ウイルス様ワクチンです。粒子およびタンパク質サブユニットワクチン。 2番目は、ウイルスベクターワクチン、DNAワクチン、mRNAワクチンなどの遺伝子ベースのワクチン。 3 つ目は、弱毒生ウイルス ワクチンなど、タンパク質ベースのアプローチと遺伝子ベースのアプローチの両方を組み合わせたものです。 新しい遺伝子ベースのワクチン戦略としての DNA テクノロジーは、前臨床試験中に複数のワクチン候補と戦略を迅速に比較できます [16、17]。 理論的には、ほぼすべてのウイルスタンパク質が免疫原およびワクチンの標的となる可能性があります。 しかし、私たちの知る限り、合成 DNA ワクチンの免疫原性と、SARS-CoV-2 S タンパク質やその他の構造タンパク質をコードする防御能力については、まだ体系的に報告されていません。 SARS-CoV-2 S、N、E、および M1 タンパク質を発現する 4 つの DNA ワクチンの免疫原性とマウスにおける防御効果を評価し、他の構造タンパク質と組み合わせた S の免疫学的効果を調査しました。
2。材料と方法
2.1. 細胞
Huh7.5 細胞とヒト胎児腎臓 293T 細胞は、研究全体を通じて 5% CO2 の加湿雰囲気下、37 °C で培養されました。 細胞は、10% FBS (GEMINI Co.、上海、中国) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco、米国ニューヨーク州ニューヨーク) を添加した DMEM 培地 (HyClone、米国ユタ州ローガン) で培養しました。 すべての細胞株はマイコプラズマ汚染について陰性であることが確認されました。
2.2. SARS-CoV-2 S/N/E/M をコードする DNA ワクチンの構築
SARS-CoV-2 S/N タンパク質をコードする遺伝子は、N 末端コザック配列 (GCCACC) とそれに続く開始コドン (ATG) を含み、哺乳類に最適化されたコドン (GenScript Co.、南京) を使用して合成されました。 、 中国）。 次に、これを EcoRI および XbaI 消化によって発現ベクター pcDNA3.1 (+) にクローン化し、pS/pN (DNA ワクチン) と名付けました (図 1A)。 pE/PM タンパク質は、以前に記載されているように構築および同定されました [15]。 ワクチンはエンドトキシンフリーの Maxiprep キット (Qiagen、北京、中国) を使用して調製され、配列はサンガー DNA シークエンシングを使用して確認されました。 S/N タンパク質の発現は、ウェスタンブロッティングおよび 1:1000 に希釈した抗 S (Sino Biological、北京、中国)/抗 N 抗体を使用して確認しました。 これらの実験は、以前に説明されたように実施されました[15、18]。
図 1. 組換え DNA ベースの SARS-CoV-2 S/N タンパク質ワクチン構築物の設計と発現。 (A) SARS-CoV-2 スパイク (PS)、ヌクレオカプシド (pN)、エンベロープ (pE)、および/または膜 (PM) タンパク質をコードする組換え DNA ベースのワクチンの概略図。 (B) DNA ワクチンにおける標的タンパク質の発現は、pS/pN/pE/pM プラスミドでトランスフェクトされた 293T 細胞のウェスタンブロット分析によって検証されました。
2.3. 予防接種とチャレンジ
生後 6 週齢の雌 BALB/c マウス (Charles River Laboratories、フランス) を国立労働衛生毒物管理研究所で、21 ℃、湿度管理された環境、12 時間の明暗サイクルで飼育しました。 一方、餌と水は自由に与えられ、すべての動物実験は中国疾病予防管理センター（中国CDC）の動物実験倫理委員会によって承認されました。 研究は関連する倫理規制に準拠しました。
マウスをランダムに 5 つのグループに分け、pS/pN 単独で免疫するか、0、21、および 42 日目に筋肉内注射とエレクトロポレーション (35 mg/50 mL) (図 2) [19,20]。 簡単に説明すると、DNA ワクチンを前脛骨筋 (TA) に注射し、針を備えた 5 mm 間隔の 2 針アレイ電極 (ECM830; BTX) を使用して直ちに電気パルスを与えました。 マウスからの血清は体液性免疫応答分析のために収集され、マウスの脾臓は細胞性免疫応答を測定するために処理されました (図 2)。
図 2. 予防接種と SARS-CoV-2 攻撃の概略図。 ワクチン接種、チャレンジ、および血液/組織サンプリングの時間経過。 BALB/C マウスをランダムにグループに分けました。
SARS-CoV-2 攻撃実験は、以前に記載されているように実施されました [15,21]。 簡単に説明すると、マウスに麻酔をかけ、総量 45 μL の 2.5 × 108 PFU の Ad5- hACE2 を鼻腔内に導入しました。 形質導入の5日後、マウスに麻酔をかけ、総量50μLの生理食塩水に溶かした1×105 TCID50のSARS-CoV-2（武漢/IVDC HB-02/2019）を鼻腔内に投与しました。バッファ。 マウスモデルにおける生きたSARS-CoV-2を使った研究はすべて、動物バイオセーフティレベル3（ABSL-3）実験室で行われました。
2.4. 酵素免疫測定法
酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) は、以前に記載されているように実施されました [15]。 簡単に説明すると、炭酸緩衝液 (0.1 M、pH 9.6) で希釈した S (Sino Biological から購入)/N タンパク質 (Song からの贈り物) を 96- ウェル EIA/RIA プレート (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）4℃で一晩。 プレートを PBS 中の 10% ヤギ血清 200 μL で 37 °C で 2 時間ブロックし、続いて PBST で 5 回洗浄しました。 次に、PBS 中の 2% ヤギ血清で連続希釈した血清サンプルを加え、37 °C で 2 時間インキュベートした後、PBST で 5 回洗浄しました。 HRP 結合ヤギ抗マウス IgG Ab (1:5000) を 37 °C で 1 時間添加しました。 合計 100 μL の TMB 基質を各ウェルに添加し、50 μL の 2M H2SO4 でクエンチしました。 吸光度は、SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE、香港、中国) を使用して 450 nm の波長で読み取られました。
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2.5. シュードウイルス感染および中和実験
シュードウイルス中和アッセイは、以前に記載されているように実行されました[21、22]。 祖先ウイルスの S タンパク質を発現するプラスミドは以前に構築されています [22]。 Omicron 変異体 SARS-CoV-2 スパイクタンパク質遺伝子 (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) が合成されました (中国、南京の Vazyme Biotech Co., Ltd. からの寄贈)以前に記載されているように、哺乳類に最適化されたコドンを使用し、pcDNA3.1 ベクターにクローン化しました [22]。 簡単に説明すると、ルシフェラーゼ レポーターを発現するプラスミドと S タンパク質を発現するプラスミドを、X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent を使用して HEK 293T 細胞に同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの 6 時間後に細胞培養を更新し、48 時間後にシュードウイルスを含む上清を回収し、-70 °C で保存しました。 シュードウイルス中和アッセイでは、等量の血清とウイルスの混合物を 37 倍量のシュードウイルスを含む上清でインキュベートし、希釈した血清に加えました。 °Cで1時間。 次に、Huh7.5 細胞の培地を 100 μL の血清 - ウイルス混合物と交換し、37 °C で 12 時間インキュベートしました。 SARS-CoV-2 シュードウイルスのみで培養した細胞を並行して実行しました。 次に、培地を DMEM (2% FBS) に交換し、37 °C で 48 時間インキュベートしました。 次に、Bright-Glo ホタルルシフェラーゼキット (Promega) を使用してルシフェラーゼシグナルを測定しました。
2.6. SARS-CoV-2 中和アッセイ
この実験では SARS-CoV-2 (武漢/IVDC-HB-02/2019) が使用されました。 簡単に説明すると、血清を 1:10 の開始希釈から 2 倍に希釈し、等量 (10-15 pfu/ウェル) の生きた SARS-CoV-2 と混合し、37 °C で 1 時間インキュベートしました。その後、それらを播種したベロ細胞に加えました。 37 °C で 48 時間インキュベートした後、細胞変性効果 (CPE) が観察され、核酸抽出およびリアルタイム蛍光逆転写 PCR (RT-PCR) のために培養上清 100 μL が採取されました。 中和線量中央値 (ND50) は、Reed-Munch 法を使用して計算されました [15]。
2.7. IFN-ELISpot アッセイ
10 アミノ酸ずつ重なる連続したマーとして S/N/E/M タンパク質全体にわたるペプチド プールは、Scilight Biotechnology, LLC によって合成されました。 ペプチドプールには、バイアルあたり約 2.5 mg の各精製ペプチドが存在していました。 実験は以前に説明されたように行われました[18]。 簡単に説明すると、96- ウェル プレート (BD ELISPOT Set、米国) を抗 IFN 捕捉 Ab でコーティングし、4 °C で一晩インキュベートしました。 ３回洗浄した後、プレートを完全培地でブロックした。 マウスを 35 日目と 120 日目に安楽死させた後、脾細胞を採取しました。各グループの新鮮な単細胞懸濁液をウェルあたり 5 × 106 個でプレーティングし、ペプチドを添加しました。 次に、プレートを 37 ℃、5% CO2 で 22 時間インキュベートし、ELISpot プレートリーダー (Biosys、米国カリフォルニア州パサデナ) を使用して検出しました。 スポット形成ユニット (SFU) は、T 細胞分泌 IFN-β を表します。
2.8. SARS-CoV-2 感染後のマウスにおける保護の評価
実験は以前に説明されたように行われました[15、21]。 簡単に言うと、マウスを安楽死させた後に肺を採取した。 組織の半分は、核酸抽出、リアルタイム蛍光 RT-PCR、および TCID50 に使用されました。 残りの半分は病理学的評価のために中国農業大学獣医学部に送られた。
2.9. 統計分析
対応のない t 検定、二元配置分散分析検定、およびダネットの多重比較検定は、GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC) を使用して実行されました。 p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p < 0.001; **** p < 0.0001)。
3. 結果
3.1. DNA ワクチンの特性評価
E および M タンパク質レベルは、ウェスタンブロッティングを使用して検出されました。 私たちは、pS/pN/pE/pM プラスミドをトランスフェクトした HEK-293 T 細胞における SARS-CoV-2 のコードされた S/N/E/M タンパク質の発現を、抗ウイルスを使用したウェスタンブロット分析によって測定しました。細胞溶解物中の -S/抗 N 抗体および抗 -6 x His 抗体。 バンドは、S (140 ～ 142 kDa)、N (45 kDa)、E (10 kDa)、および M (22 ～ 25 kDa) タンパク質の予測分子量に近似しました (図 1B)。
3.2. pS および/または pN DNA によって誘導される強力かつ持続的な抗 S および/または抗 N IgG 産生
ワクチン 35、56、96、および 120 日目に BALB/c マウスから血清を収集しました (図 2)。 抗 S/抗 N IgG レベルは ELISA を使用して検出されました。 pS または pN によって誘導される S または N 特異的 IgG 応答の大きさは、1 回目および 2 回目の追加免疫後の血清中で増加しました。 抗 S および抗 N IgG 力価は、pS + pN グループの方が他のグループよりも高かった。 ただし、その差は統計的に有意ではありませんでした (図 3A、B)。 強力な E/M タンパク質特異的抗体応答は検出されませんでしたが、これは以前の研究の結果と一致しています (データは示されていません) [15]。
図 3. BALB/c マウスにおける SARS-CoV-2 に対する B 細胞応答。 (A) SARS-CoV-2 S (A) および N タンパク質 (B) の血清 IgG 結合エンドポイント力価。 (C) 中和力価は、SARS-CoV-2 シュードタイプ ウイルス システムに基づいて決定されました。 (D) 抗 SARS-CoV-2 中和力価は、SARS-CoV-2 ウイルスを使用して測定されました。 (E) SARS-CoV-2 Omicron シュードタイプウイルスシステムに基づく中和アッセイ。 モック (青)、pS (赤)、pS + pN (緑)、pS + pE + pM (ピンク)、および pN (オレンジ) グループの血清の阻害率を示します。 エラーバーは SEM を表し、p 値は二元配置分散分析と Sidak の事後分析を使用して計算されました。ここで * p < 0.05
3.3. pS ワクチンおよび pN ワクチンとの同時免疫により誘導される高レベルの中和抗体
段階希釈した血清サンプルの中和力価は、偽型 SARS-CoV-2 ウイルスを使用して決定されました。 最高レベルの中和抗体 (nAb) は pS + pN グループで観察され、EC50 幾何平均力価の逆数は 2988 (35 日目) および 3578 (56 日目) に達しました (図 3C)。 生ウイルス微量中和（MN）アッセイを使用しても同様の結果が観察され、pS + pN グループの nAb レベルは 56 日目と 96 日目で S グループよりも高かった（p < 0.05; 図3D）。 さらに、56 日目 (2 回目の追加免疫) の pS + pN グループの nAb レベルは、35 日目のものよりも有意に高かった (p < 0.05; 図 3D)。
SARS-CoV-2 オミクロン変異体に対する各ワクチンレジメンの中和活性は、シュードタイプ化されたプラットフォームと血清サンプルを使用してさらに決定されました。 35 日目と 56 日目の Omicron ウイルスに対する中和プロファイルは、祖先ウイルスに対するものと類似しており (図 3E)、PS + pN 処理が交差中和能力を持っていることを示唆しています。
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3.4. DNAワクチン接種によって誘発されるT細胞反応
以前に説明されたように、SARS-CoV-2 S/N/E/M 抗原に対する T 細胞応答は、IFN-ELISpot を使用して推定されました [15]。 予想通り、PS + pN レジメンと pS + pE + pM レジメンは両方とも、12 日目0 では 35 日目よりも有意に高いレベルの S タンパク質に特異的な IFN + T 細胞を誘導しました (p < 0)。 05; 図 4A)。 さらに、120 日目（2 回目の追加免疫）の N タンパク質に特異的な IFN + T 細胞の数は、pS + pN グループの 35 日目の細胞数よりも有意に高かった（p < 0.05; 図 4B）。 最後に、120 日目 (2 回目の追加免疫) の M タンパク質に特異的な IFN + T 細胞の数は、両グループとも 35 日目の細胞数よりも有意に高かった (p < 0.05; 図 4D)。
図 4. BALB/c マウスにおける SARS-CoV-2 の個々の構造タンパク質に対する T 細胞の応答。 (A) T細胞応答は、SARS-CoV-2 S、(B) N、(C) E、(B) N、(C) E、 (D) M タンパク質。 バーは平均±SDを表します。 統計分析は、二元配置 ANOVA および Sidak の事後検定を使用して実行されました。ここで、* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.01、および **** p < 0.0001。
3.5. pS/pN または pS/pE/pM との同時免疫により誘発される相乗的防御
次に、祖先型 SARS-CoV-2 ウイルスによる攻撃後に免疫化した hACE2 マウスを使用して、DNA ワクチンの防御効果を評価しました。 チャレンジ後、模擬グループのマウスは徐々に体重減少を示しました。 対照的に、pS または pS+ で免疫したマウスは、感染直後に軽度の体重減少を示し、その後回復しました (図 5A)。 pS、pS + pN、または pS + pE + pM をワクチン接種したマウスでは、生きたウイルスは検出されませんでした。 さらに、ｐＳ＋ｐＮワクチン接種は、ｐＳワクチン接種単独で得られたものと比較して、ウイルスＲＮＡコピー数を有意に減少させた（ｐ｛｛１０｝｝．０２２８；図５Ｂ）。 さらに、肺の組織病理学では、模擬群と pN 群のマウスの両方で、局所的な炎症斑点、胸膜陥入、肺胞虚脱、高レベルの炎症細胞浸潤、および出血領域が見られることが実証されました。 比較すると、pS + pN または pS + pE + pM で治療したマウスは、他のグループよりも攻撃後の組織病理学的変化が穏やかで、INHAND スコアが低かった (図 5C)。
図5. 生きたSARS-CoV-2ウイルスによる感染後の免疫の防御効果。 (A) チャレンジ後 3 日間、マウスの体重を毎日測定しました (平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM)、n=4)。 (B) TCID5{{10}} アッセイおよび RNA コピー数によって測定された、攻撃後 3 日目の肺ホモジネート中の感染性 SARS-CoV-2 力価。 グループ間の統計的有意差は、一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較補正を使用して決定されました (* p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001、および**** p < 0.0001)。 (C) H&E 染色を使用した肺の組織病理学的分析。
4。討議
この研究では、S タンパク質と N タンパク質を発現する 2 つの DNA ワクチンによる同時免疫化により、高レベルの nAb が誘導され、マウスにおける SARS-CoV-2 ウイルス量の減少に非常に効果的でした。 Sタンパク質を発現するDNAワクチンは、マウスをN/EおよびMタンパク質で同時免疫した場合、3回の免疫化後にSタンパク質特異的細胞性免疫レベルの上昇を誘導し、攻撃後の組織病理学的変化を軽減した。 私たちの知る限り、これは、SARS-CoVの他の構造タンパク質をコードするDNAワクチンで同時免疫した場合に、Sタンパク質をコードするDNAワクチンを使用したマウスの免疫力と防御力が相乗的に強化されることを明らかにした最初の報告である{{8 }}。
カンクサ-免疫システムを改善する
N 抗原領域の免疫優性 B 細胞エピトープは、いくつかの研究で観察されています。 N ベースのワクチンは通常、nAb を誘導できません。これは、N タンパク質がウイルス表面に表示されないためと考えられます。 注目すべきことに、Sタンパク質とNタンパク質を同時免疫すると、祖先ウイルスおよびオミクロンSARS-CoV-2ウイルスに対して、他のグループよりも高いレベルのnAbが誘導されました。 nAb 応答の増加は、より優れたウイルス除去効果と保護効果に関連しています。 私たちの結果は、攻撃後の SARS-CoV-2 ウイルス量の減少において、pS + pN 治療が pS 治療単独よりも効果的であることを実証しました。 以前の研究では、Mタンパク質とNタンパク質を共発現するワクチンで免疫したハムスターは、重度の体重減少と肺の病変から保護され、SARS-CoV-2攻撃後の中咽頭と肺のウイルス力価が大幅に低下したことが報告されています。これは我々の結果と一致しています[23]。 残念ながら、ウイルス力価の低下が特に M または N タンパク質に起因するものではなく、nAb レベルはこの研究では評価されませんでした。 ある SARS-CoV-2 mRNA ワクチン研究では、S+N 同時免疫が S 特異的 CD8+ T 細胞反応の増強と中和抗体活性を誘導し、デルタウイルスに対する肺の保護を強化すると報告しました。これは、この研究の結果と一致しています [24]。 別の研究では、インビトロでブタのTGEV-IMMUNE細胞をSタンパク質とNタンパク質の組み合わせで刺激したときに、伝染性胃腸炎コロナウイルスのNタンパク質が中和抗体の合成を促進したと報告しており、この効果は、感染性胃腸炎コロナウイルスに対するヘルパーTリンパ球の反応によって説明される可能性がある。 Nタンパク質[25]。
N 抗原領域の免疫優性 CD{0}}/CD8+ T 細胞エピトープは以前に同定されています。 いくつかの研究では、SARS-CoV-2 N タンパク質に基づくワクチンが細胞性免疫応答を効果的に誘導することが報告されています。 S + N グループは、3 回の免疫後、S タンパク質特異的な細胞性免疫レベルの増加を示しました。 ある SARS-CoV-2 mRNA ワクチン研究では、S + N の組み合わせにより、S 単独と比較して S 特異的 CD8+ T 細胞反応の増強が誘導されたことが報告されており、これは我々の結果と一致している[24]。 別の研究では、二重抗原hAd5 S + Nプライムワクチン接種のみ後のS抗原およびN抗原に対するT細胞反応は、以前にSARS-CoV-2-に感染した患者の反応と同等であることが報告されており、T細胞のインシリコ予測モデルも報告されています。エピトープ HLA 結合は、hAd5 S + N ワクチンに対する T 細胞応答が B.1.351 変異体に対する効果を保持することを示唆しました。 さらに、以前に SARS-CoV-2- に感染した患者からの血漿は、hAd5 S-Fusion 単独よりも二重抗原 S-Fusion + N-ETSD 構築物を発現する細胞に対して高い結合親和性を示し、さらに、 S + N 二重抗原ワクチンは、S 単一抗原ワクチンよりも優れています [26]。
肺では生ウイルスは検出されず、pS、pS + pN、および pS + pE + pM グループでは攻撃後の体重減少が軽減されましたが、pN 処理ではウイルス力価が効果的に低下しませんでした。 これらの発見は、ワクチン標的としての S タンパク質の不可欠性と有効性を強調しています。 注目すべきことに、pSとpNによる同時免疫は、ウイルスクリアランスに関してpSまたはpNのいずれよりも優れた効果をもたらしました。 pS + pE + pM グループは肺の組織病理学的変化が少ないことを示し、これは我々の以前の研究の結果と一致しています [15]。 S+N グループは、S/N 単独で免疫したグループと比較して、肺内のウイルス RNA コピーが低く、体重減少が減少し、SARS-CoV-2 攻撃後の回復時間が早かった。これは、S/N 単独で免疫したグループと比較して、この研究の結果。 しかし、どのグループも中和抗体力価を検出しなかったが、これはワクチンの種類と実験動物の違いによって説明される可能性がある[26]。 あるSARS-CoV-2アデノウイルスベクターワクチン研究では、SワクチンはNワクチンと同時免疫した場合にのみ急性脳保護を提供すると報告した[27]。 別の研究では、それぞれ S1/N/RdRp、N/RdRp、S1 タンパク質を発現する Tri:ChAd、Bi:ChAd、Mono:ChAd ワクチンを開発し、B.1.351 動物モデルでテストしました。 Mono: ChAd肺では広範な肉眼的病状が観察されましたが、Bi: ChAdおよびTri: ChAd肺にはこの病状がほとんどないように見えました[28]。
さらに、ワクチン接種を受けていない動物では肺のウイルス量が高かったのに対し、Tri:ChAd 治療ではウイルス量が 3.5 log 有意に減少しました。 比較すると、Bi:ChAd ワクチンと Mono:ChAd ワクチンはどちらもウイルス量を中程度に減少させるだけでした。 これらの結果は、変異体に対する S/N 二重抗原ワクチンの防御効果が S 単一抗原ワクチンよりも優れている可能性があることを示唆しており、これは我々の結果と一致しています [28]。 いくつかの研究では、N タンパク質で免疫化したマウスが SARS-CoV 感染後に重度の肺炎症を発症することが報告されている [29-31]。 以前の研究では、マウス肝炎ウイルス N タンパク質を発現するアデノウイルス ベクター ワクチンによる免疫がマウスを致死感染から保護することも報告されており、N タンパク質が保護効果を生み出す可能性があることが実証されています [32]。 さらに、CRT/N DNA ワクチンで免疫したグループでは、攻撃後のウイルス力価が大幅に低下しており、ワクシニアウイルスは SARS-CoV N タンパク質を発現していました [33]。
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S タンパク質に関するある研究では、DNA/タンパク質混合ワクチンが DNA/タンパク質ワクチン単独よりも体液性免疫と細胞性免疫の両方をよりよく誘導することが実証されました [8]。 S タンパク質のみを標的とするワクチンでは、新たな変異体によって引き起こされる軽度から中等度の新型コロナウイルス（-19）に対する防御効果が低下することが実証されています。 保存されたエピトープに対するワクチン誘発性 T 細胞応答は一般に変異の影響を受けないため、N/E/M タンパク質を含む保存された SARS-CoV-2 構造タンパク質の役割は、ワクチンの設計と応用において注目に値します。 。 ある研究では、SARSから回復した患者(n=23人)は、2003年の発生から17年経った今でも、SARS-CoV Nタンパク質に反応する長期持続性メモリーT細胞を保有しており、SARS CoVに対して強い交差反応性を示したと報告されている。{ {15}} N タンパク質。交差防御ワクチンの標的としての N タンパク質の使用をさらに検証します [34]。 この研究は、pS/pNの同時免疫化がより高いnAb応答、より優れたウイルスクリアランス、および改善された細胞免疫応答と関連しており、pS単独と比較してSARS-CoV-2攻撃後により優れた防御を提供する可能性があることを実証しました。 さらに、SARS-CoV-2 変異体は多くの動物種に感染することが示されており、一部の野生動物やペットではヒトから動物への感染が観察されています[7]。 したがって、動物用SARS-CoV-2ワクチンにはさらに注意が必要です。 さらに、ナノテクノロジーはワクチンを最適化する強力なツールとなる可能性があり、さらに注目される価値があります[2]。
この研究にはいくつかの制限があります。 まず、我々は BALB/c マウスで DNA ワクチン戦略を観察しただけであり、今後の研究では他の動物モデルでこれらのワクチンレジメンの免疫原性効果を評価する必要があります。 第二に、Sタンパク質とNタンパク質を使用した同時免疫によって誘発されるnAb特異的およびS特異的CD8 T細胞反応の増強の根底にある分子機構を完全に理解し、この知識を活用して新型コロナウイルスを最適化するには、追加の研究が必要である。-19ワクチンのデザイン。 最後に、N タンパク質特異的抗体の機能はさらなる研究に値します。
カンクサ-免疫システムを改善する
結論として、この研究では、SARS-CoV-2 S、N、E、M タンパク質との同時免疫による免疫防御の可能性を評価しました。 S タンパク質のみを標的とするいくつかのワクチンは、新たに出現した変異株に対する防御効果が低下しています。 私たちの結果は、現在および新たに出現するSARS-CoV-2の変異種を制御し、潜在的なコロナウイルスのパンデミックを防ぐための交差反応性の新型コロナウイルス-19ワクチンを開発するための基礎を築くでしょう。
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