NADC30-様PRRSV株に感染したブタにおけるエクソソームmiRNAの発現プロファイルの体系的な同定と比較
Dec 27, 2023
簡単なまとめ:エクソソームは、ウイルス感染、抗原提示、身体免疫の抑制/促進において独特の役割を果たします。 豚生殖・呼吸器症候群ウイルス (PRRSV) は、養豚産業において最も有害な病原体の 1 つです。 ここでは、CHsx1401 株と同様の PRRSV NADC30- を使用して、42- 日齢のブタに人為的に感染させ、血清エクソソームを単離し、感染群と対照群間で発現量が著しく異なる 33 個の (DE) エクソソーム miRNA を同定しました。 PRRSV 感染および免疫に関連する 18 個の DE miRNA が、エキソソームによる PRRSV ウイルス感染の制御に関与する潜在的な機能分子としてスクリーニングされました。
抽象的な：エクソソームは、細胞によって分泌および放出される生物学的小胞であり、細胞間コミュニケーションのメディエーターとして機能し、ウイルス感染、抗原提示、および身体免疫の抑制/促進において独特の役割を果たします。 豚生殖呼吸器症候群ウイルス (PRRSV) は、養豚産業において最も有害な病原体の 1 つであり、雌豚の生殖障害、豚の呼吸器疾患、成長能力の低下、および豚の死亡につながるその他の疾患を引き起こす可能性があります。 この研究では、PRRSV NADC30-様 CHsx1401 株を使用して、42- 日齢のブタに人為的に感染させ、血清エクソソームを分離しました。 ハイスループットシーケンス技術に基づいて、感染前後の血清エキソソームで 305 個の miRNA が同定され、そのうち 33 個の miRNA がグループ間で有意に差次的に発現されました (13 個は相対的に上方制御され、20 個は相対的に下方制御されました)。 CHsx1401 ゲノムの配列保存解析により 8 つの保存領域が特定され、そのうち合計 16 個の発現差（DE）miRNA が 3 つの領域に最も近い保存領域に結合すると予測されました。0 CHsx1401 ゲノムの UTR（CHsx に結合できる 5 つの DE miRNA を含む）1401 30 UTR (ssc-miR-34c、ssc-miR-375、ssc-miR-378、ssc-miR-486、ssc-miR-6529)。 さらなる分析により、差次的に発現された miRNA の標的遺伝子が、エクソソーム機能関連および自然免疫関連シグナル伝達経路、および 18 の DE miRNA (ssc-miR-4331-3p、ssc-miR-744) に広く関与していることが明らかになりました。 PRRSV 感染と免疫に関連する、ssc-miR-320、ssc-miR-10b、ssc-miR-124a、ssc-miR-128 など）がスクリーニングされました。エキソソームによる PRRSV ウイルス感染の制御に関与する潜在的な機能分子として。
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キーワード:PRRSV; 血清エクソソーム。 miRNA
1. はじめに
ブタ生殖呼吸器症候群ウイルス (PRRSV) は、ニドウイルス目アルテリウイルス科ベータアルテリウイルス属に属するエンベロープ構造を持つ一本鎖プラス鎖 RNA ウイルスです [1,2]。 凍結電子顕微鏡で観察すると、直径 50 ～ 65 nm の球形または楕円体です [3,4]。 PRRSV ゲノムは、50 個のキャップと 30 個のポリ A テールを備えた長さ約 15 kb で、50 末端と 30 末端の両方に非翻訳領域 (UTR) が隣接する少なくとも 10 個のオープン リーディング フレーム (ORF) を含みます [5,6]。ヌクレオカプシドタンパク質で包まれ、脂質二重層でコーティングされてウイルス粒子を形成します。 エクソソームは単層膜構造を持つ小胞に属し、細胞と同じトポロジー構造を持っています[7]。 その形状は、電子顕微鏡で観察すると「カップ状」または「ディスク状」である[8,9]。 エクソソームは循環系に長期間存在することができ、エクソソーム内の物質は隣接する細胞または遠く離れた受容体細胞に吸収され、細胞間の遺伝物質の交換に参加するように受容体細胞を制御することができます[10、11]。 それらは主に、細胞表面受容体、膜タンパク質、可溶性タンパク質、脂質、RNA (mRNA、miRNA、lncRNA、ウイルス RNA など)、ゲノム DNA、ミトコンドリア DNA などの膜表面物質とその内容物で構成されています [12-14] ]。 マイクロRNA（miRNA）は、進化的に保存された18～25ヌクレオチド（nt）のクラスの非コード一本鎖低分子RNAであり、標的mRNAの分解を誘導するか、標的mRNAの30 UTRに結合することによって翻訳プロセスを阻害し、転写後の遺伝子サイレンシングに続き、転写後レベルで遺伝子発現を制御します[15-17]。 miRNA は哺乳類遺伝子の 60% 以上を転写後に制御していると推定されています [18,19]。 miRNA は細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしており、病気やウイルスの感染、伝染、防御のための潜在的な機能分子としても使用できます [20]。 miRNA が唾液、尿、母乳、血液などの体液中に存在し、体の体液循環系を通じて作用する可能性があることを示す研究が増えています [21、22]。 エクソソーム miRNA は、遺伝子発現と代謝の内因性調節因子であると考えられており、さまざまな病理学的状態を示す可能性があります [23、24]。
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過去 20 年にわたり、miRNA が免疫細胞の発生、自然免疫応答、獲得免疫応答の制御において重要な役割を果たしていることが示されてきました。 他のいくつかの miRNA は、次のような方法で PRRSV 感染を阻害するか、PRRSV ゲノムまたは PRRSV 受容体を直接標的にするか、宿主の自然免疫応答を調節する役割を果たすことが報告されています。 miR-26 ファミリーはウイルスの複製に重大な損傷を与える可能性があり、miR-26a は I 型インターフェロン (IFN) を制御することでブタ肺胞マクロファージ (PAM) における 1 型および 2 型 PRRSV 株の複製を阻害します。 miR-26b よりも効率的な経路です [25,26]。 miR-30cおよびmiR-125bは、それぞれI型IFN経路およびNF-κB経路を標的とすることによって宿主の自然免疫応答を調節することが確認されている[27-29]。 MiR-23、miR-378、および miR-505 は PRRSV を標的とする抗ウイルス宿主因子であり、2 型 PRRSV 株に保存的な標的部位を持っています [30]。 同時に、宿主 miR-506 は、MARC-145 細胞の PRRSV 受容体 CD151 を直接標的とすることで PRRSV 複製を阻害することが確認されています [31]。 miR-181 は、血中単球および PAM 内の PRRSV 受容体 CD163 を下方制御することにより、PRRSV 複製を間接的に阻害することもできます [32]。 さらに、miRNA は基本的な細胞生理機能に干渉することで PRRSV の複製を促進する可能性があります。 MiR-24-3p と miR-22 は、PRRSV 感染中に HO-1 の 30 UTR を直接標的にし、ヘムオキシゲナーゼ -1 (HO-1) の阻害を回避します。 PRRSV に対する熱ショックタンパク質 (HSP32 としても知られる) [33,34]。 ブタは PRRSV に対して感受性が高く、この病原体の体内への侵入に対して防御する能力が低いことが知られています [35]。 本研究では、このウイルスに感染した豚の自然免疫と獲得免疫を、現場で流行している菌株を用いて分子レベルで研究した。 血清エクソソーム単離キット、透過型電子顕微鏡 (TEM)、ナノ粒子追跡分析 (NTA)、およびウェスタンブロット (WB) を使用して、PRRSV 感染前後の血清エクソソームを単離および同定し、続いて低分子 RNA 配列分析、同定、いくつかの PRRSV 関連血清エキソソーム miRNA を取得するためのバイオインフォマティクス手法を使用した差次的発現結果の分析、続いて定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) を使用したデータ結果の特定。
2。材料と方法
2.1. 動物実験
PRRSV 抗原と抗体の二重陰性の健康な 42- 日齢の大型白豚 6 頭が、隔離、医療、および環境適応のために豚の清潔な給餌システムに配置されました。 すべての豚は制限なく自由に食べたり飲んだりできました。 アイソレータ内の条件に慣れてきたら、先人が言及した CHsx1401 のような 2 mL 105 TCID50/mL PRRSV NADC30- をブタの鼻腔内に接種しました [36,37]。 ウイルス接種前（対照群、n=6）およびウイルス接種 7 日後（治療群、n=6）のブタの血液を、血清単離のために前大静脈から採取しました。 血清中の細胞破片を、3000 gで15分間遠心分離することによって除去した。 私たちの研究におけるすべての動物実験は、中国農業科学院（CAAS）（中国北京）の動物科学研究所の動物倫理委員会、IAS2022-130によって承認されました。
2.2. 血清エクソソームの分離と精製
エキソソームの単離および精製は、exoEasy Maxi キット (QIAGEN、ドイツ、ヒルデン、カタログ番号 76064) を使用して、製造業者のプロトコールに従って実行されました。
2.3. 透過型電子顕微鏡 (TEM)
抽出されたエキソソーム懸濁液を、ホルムバールカーボンコート銅メッシュ上にスポットし、エキソソームを PBS でリンスし、標準的な酢酸ウラニル染色を室温で 3 分間行いました。 室温で数分間乾燥させた後、透過型電子顕微鏡 (HT-7700、日立ハイテク、東京、日本) によってグリッドを可視化し、100 kV で写真撮影しました。
2.4. ナノ粒子追跡分析 (NTA)
抽出したエクソソームを 1 × PBS で 10 μL から 30 μL まで容量を変えて希釈しました。 サンプルをテストした後、メーカーの指示に従って N30E フロー ナノアナライザー (NanoFCM、アモイ、中国) によって血清エキソソームの濃度とサイズを分析しました。
2.5. ウエスタンブロット
抽出されたエクソソームサンプルを、プロテアーゼ阻害剤（Invitrogen、Waltham、MA、USA）およびフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）と混合したRIPAライセートに加えてエキソソームタンパク質を抽出し、氷上で30分間溶解しました。 次に、Bradford キットの説明書に従って、血清エクソソームタンパク質の濃度を定量しました。 エクソソームタンパク質は熱変性を受けました。 同量のタンパク質を 12% SDS-PAGE ゲルで分離し、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Millipore、バーリントン、マサチューセッツ州、米国) に転写しました。 ５％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴに浸漬し、室温で１時間密封した。 希釈した一次抗体 (抗 CD9 抗体、Abcam、マサチューセッツ州ボストン、#ab92726; 抗 CD81 抗体、Abcam、マサチューセッツ州ボストン、USA、#ab109201) にメンブレンを 4 °C で一晩浸漬し、回収しました。一次抗体。 メンブレンを希釈した二次抗体に浸し、室温で 1 時間インキュベートし、二次抗体を回収しました。 洗浄した PBST フィルムを鮮度保持フィルム上に置き、等量の混合 ECL a/b 発色溶液を加え、化学発光イメージャーに置きました。
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2.6. エキソソーム Small RNA の配列決定とデータ分析
メーカーの指示に従って、エキソソームからの全 RNA を Trizol で抽出しました。 次に、RNA 濃度と光学密度 (OD) 値を検出し、1% アガロースゲル電気泳動で RNA の分解と純度を検出しました。 一方、Agilent Bioanalyzer 2100 を使用して RNA の完全性を検出しました。 エクソソームのトータルRNAは品質検査を経て使用しました。 メーカーの説明書に従って、Illumina® (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) 用の NEB NEXT マルチプレックス低分子 RNA ライブラリー調製セットを使用しました。 このキットは小さな RNA cDNA ライブラリを調製し、Illumina Novaseq 6000 プラットフォームによって 50 nt のシングルエンド リードを生成するように配列決定しました。 small RNA ライブラリーの調製手順はすべて Novogene (北京、中国) によって行われました。 品質管理後のデータは、ボウタイを使用してブタ参照ゲノム (Sus scrofa 11.1) と位置合わせされました。 既知の miRNA は、miRbase (v22.0) データベース [38] (https://www.mirbase.org、2022 年 1 月 14 日にアクセス)、miRdeep2 (v0.0.5) [39]、および miRevo (v1.1) によって同定されました。 ) [40]、新しい miRNA を予測するために使用されました。 同時に、miRNA の差次的発現解析が DESeq (v1.24.0) [41] によって実行され、|倍数変化| が必要になりました。 > 1.6 および p < 0.05。 MEGA (V11) [42] を使用してアライメントを実行し、続いて PHAST (v1.6.9) [43] を使用して単一塩基スコアリングを行い、WUH3 (GenBank アクセッション番号 HM853973)、VR2332 ( GenBank アクセッション番号 U87392)、JXA1 (GenBank アクセッション番号 EF112445)、CH-1a (GenBank アクセッション番号 AY032626)、NADC30 (GenBank アクセッション番号 HN654459)、HUN4 (GenBank アクセッション番号 EF635006)、HLJZD 22-1812 (GenBank アクセッション番号 MN648450)、SC/DJY (GenBank アクセッション番号 MT075480)、および Lelystad (GenBank アクセッション番号 M96262.2)。 RNAhybrid (V2.0) [44] を使用して、同定された miRNA 配列の CHsx1401 ウイルス ゲノムの 3 0 UTR への結合を予測しました。 Miranda (v3.3a) と RNAhybrid を使用して、標的遺伝子を予測しました。 クラスター プロファイル [45] R パッケージは、ターゲット遺伝子の GO (Gene Ontology) 機能濃縮分析および KEGG (京都遺伝子およびゲノム百科事典) 経路濃縮分析に使用されました。
2.7. RT-qPCR による miRNA 発現の検証
メーカーのプロトコールに従って、Trizol (Invitrogen、上海、中国) を使用して、血清エキソソームから全 RNA を単離しました。 単離された RNA は、サンプル (グループあたり n=6) の RT-qPCR によって検証されました。 miRNA 1st strand cDNA ynthesis (by Stem-loop) kit (Vazyme, Nanjing, China) の指示に従って cDNA を合成し、ABI 7500 に従って蛍光定量を実行しました。 miRNA ユニバーサル SYBR qPCR マスター ミックス (Vazyme、南京、中国) の説明書。 使用した熱サイクルパラメータは次のとおりです。第 1 段階: 95 °C で 30 秒。 ステージ 2: 95 °C で 5 秒、60 °C で 34 秒、および 40 サイクル。 ステージ 3: 95 °C で 15 秒間、60 °C で 1 分間、95 °C で 15 秒間。 miRNA、U6 遺伝子のプライマー配列は参考として使用され [46]、補足表 S1 にリストされています。 すべての qRT-PCR 検証は、3 つの生物学的複製を使用し、サンプルごとに 3 つの複製を使用して実行されました。 転写産物の相対存在量は 2-Ct 法によって計算され、データ分析とマッピングには SPSS (v22.0) と GraphPad Prism (v8.0) がそれぞれ使用されました。 p < 0.05 は、差が統計的に有意であることを意味します。
3. 結果
3.1. ウイルス接種後の抗原と抗体の相対値
攻撃前（0 日目）と攻撃後（7 日目）の PRRSV 抗原および抗体検査の結果を表 1 に示します。攻撃前の PRRSV 抗原および抗体の血清学的検出は陰性で、抗原は陰性でした。チャレンジ後に陽性反応が出たことは、ブタが CHsx1401 にうまく感染したことを示しています。
3.2. 血清エクソソームの分離と同定
血清から分離された小胞は TEM によって発見されました。 ほとんどの小胞では、中央に凹んだ皿型または円盤型のエクソソームが見えます。 エクソソームの膜端が見え、形態は比較的完全です (図 1A、B)。 ナノ粒子追跡分析により、エクソソームの 95.73% が 30 ～ 150 nm の直径を持ち、主に 72.25 nm 付近で、平均直径が 76.22 nm であることが示され、これはエクソソームのサイズ特性と一致していました (図 1C)。 このサイズ範囲は TEM によって検出されたものと同様であり、これらの小胞がエキソソームであることがさらに確認されました。 ウェスタンブロット分析により、血清サンプルから単離された小胞は CD9 および CD81 タンパク質陽性であることが示されました (図 1D)。 上記の特徴は、MISEV2018 において International Society for Extrace Vesicles (ISEV) が策定したエクソソーム識別基準に準拠しています [47]。
表 1. 攻撃ウイルスによる (0 日目) および (7 日目) の抗原および抗体。
図 1. 血清エクソソームの主な特徴。 (A、B) TEM による小胞の形態的特徴を示します。 スケール バーはそれぞれ 500 nm と 100 nm です。 (C) NTA は、ほとんどの小胞の直径と濃度を示します。 (D) ウェスタンブロットにより、血清エキソソーム中にエキソソームマーカー CD81 および CD9 が存在することが示されました。 注: WB のミックス結果は、exoEasy Maxi キットで分離されたサンプル混合懸濁液です。
3.3. 血清エクソソームの Small RNA シーケンス
各サンプルのクリーン データは 0.5 Gb に達し、Q30 の基本パーセンテージは 96.20% を超えました。 各サンプルのクリーンリードはブタ参照ゲノムと位置合わせされました。 12サンプルのうち、コントロールグループはそれぞれ10,920,887、10,248,696、10,109,117、10,655,494、9,217,285、および9,782,523のリードを取得しました。 治療グループはそれぞれ、11,889,518、10,593,504、10,593,504、12,846,080、10,105,325、11,729,451、および9,789,542のリードを取得しました。 平均して、クリーンリード全体の 77.96% は長さ 19 ～ 22 ヌクレオチド (nt) で構成されていました (図 2A)。 品質管理後の読み取りは、合計読み取りの 92.59% 以上を占めました。 処理されたクリーンリードはブタ参照ゲノムとアライメントされ、ゲノム上の 12 ライブラリのマッピング率は 92.30% 以上、マッピング率は 94.98% でした (図 2B)。 これは、構築された血清エキソソーム miRNA ライブラリーが高品質であり、さらなる分析に適していることを示しました。 詳細は補足表S2に記載されています。
図 2. small RNA トランスクリプトーム データの概要。 (A) 血清エキソソームサンプルの読み取り数の長さの分布 (nt=ヌクレオチド)。 (B) 参照ゲノムにマッピングされた 12 サンプルの割合
3.4. miRNA の差次的発現解析
同定された miRNA 発現の定量分析後、セクション 2.6 で前述した閾値によって miRNA がスクリーニングされました。 CHsx1401 株の接種の前後で合計 305 個の miRNA が得られました (対照、n=6、処理、n=6)。 2 つのグループ間で合計 33 個の発現差がある (DE) miRNA が同定され、治療グループでは 13 個の DE miRNA が上方制御され、20 個の DE miRNA が下方制御されました (図 3 および補足表 S3)。
3.5. miRNA標的遺伝子の機能強化解析
合計 7,283 の標的遺伝子が 33 の DE miRNA によって予測され、標的遺伝子の機能は主に MAPK カスケードの正の制御、脂質代謝プロセス、細胞内シグナル伝達の制御、ERK1 および ERK2 カスケードなどに集中していました (図 4A)。 ）。 分子機能の観点からは、差次的に発現される miRNA 標的遺伝子は、主に GTP 酵素調節活性、キナーゼ活性、ヌクレオシド トリホスファターゼ調節活性、およびシグナル伝達とエネルギー代謝に関連するその他の機能に焦点を当てています (図 4B)。 さらに、細胞構成要素の中で、標的遺伝子は主に超分子ポリマー、ゴルジ、オートファゴソーム、細胞表面、初期エンドソームなどの生物学的機能に関与しています（図4C）。 これらのコンポーネントの機能はエクソソームの形成と密接に関連しており、これが配列決定の精度の説明にもなります。 KEGG 経路濃縮分析により、標的遺伝子はエンドサイトーシス、MAPK シグナル伝達経路、Rap1 シグナル伝達経路、スフィンゴ脂質シグナル伝達経路、および PI3K Akt シグナル伝達経路において有意に濃縮されていることが示されました (p < 0.05) (図 5A) ）。 同時に、濃縮された経路が分類され、分析されました。 結果は、標的遺伝子の KEGG 経路が主に環境情報処理、人間の病気、および生物学的システムに豊富に存在することを示しました (図 5B)。
図 3. エクソソームにおける miRNA の差次的発現。 (A) 対照群と治療群間の miRNA のボルケーノ プロット。 (B) 対照群と治療群間の DE miRNA の階層的クラスタリング ヒートマップ。
図 4. DE miRNA 標的遺伝子の GO 機能濃縮解析。 (A) DE miRNA 標的遺伝子の生物学的プロセス。 (B) DE miRNA 標的遺伝子の分子機能。 (C) DE miRNA 標的遺伝子の細胞成分
図 5. ターゲット遺伝子の KEGG 経路濃縮解析。 (A) DE miRNA の標的遺伝子が大幅に濃縮された KEGG 経路。 (B) 大幅に濃縮された KEGG 経路の分類。
3.6. 血清エキソソーム miRNA および PRRSV CHsx1401 ゲノムのターゲティング予測
PHASTによるアライメント後の単一塩基のphastConsスコアによると、ウイルスゲノム間で合計8つの最も保存されたセグメント(ピークマップ上の黒いバンド)が得られました(図6)。 保存されたセグメントに結合する miRNA を予測することにより、合計 31 個の DE miRNA が保存されたセグメントに結合することが判明しました。 そのうち、CHsx1401 ゲノムの 30 UTR (14,870 ～ 15,020) に最も近い保存領域 (14,644 ～ 15,020 nt) では、5 つの miRNA (ssc-miR-34) を含む 16 の DE miRNA が結合すると予測されています。 c、ssc-miR-375、ssc-miR-378、ssc-miR-486、および ssc-miR-6529）は、CHsx1401 の 30 UTR にバインドできます。 これらの miRNA のうち、ssc-miR-223 のみが感染後に上方制御され、他の miRNA は感染後に下方制御されました。 詳細については、補足表 S4 を参照してください。
図 6. PHAST によって予測された CHsx1401 株のゲノム内の保存されたセグメント
3.7. エキソソーム機能および PRRSV に関連する DE miRNA のスクリーニング
エキソソームおよび PRRSV の機能に関連する、差次的に発現されるさまざまな miRNA が、標的遺伝子の機能濃縮解析によって発見されました。 このうち、ssc-miR-4331-3p、ssc-miR-744、ssc-miR-320など11種類のDE miRNAがエクソソームの取り込みに関与しており、その標的遺伝子は主にRas遺伝子ファミリー、アネキシンファミリー、ADPリボシル化遺伝子ファミリー。 sscmiR-10b、ssc-miR-124a、ssc-miR-128 を含む 18 個の DE miRNA は免疫関連経路に関与しており、それらの標的遺伝子は主に MAPK に集中しています。遺伝子ファミリー、PIK3遺伝子ファミリー、プロテインホスファターゼ遺伝子ファミリー。 11 個の DE miRNA がウイルス侵入に関与していますが、関連する標的遺伝子は主に MAPK 遺伝子ファミリーとプロテインホスファターゼ遺伝子ファミリーに集中しています。 さらに、新規の_102など、差次的に発現される複数のmiRNA。 6 つの DE miRNA（ssc-miR-320、ssc-miR-423-5p、ssc-miR-4331-3p、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR{{ 25}}は、図7に示すように、エキソソーム機能、PRRSVウイルス侵入、および免疫関連経路で共発現されます。詳細は補足表S5に示されています。
図 7. エキソソームの取り込み、PRRSV の侵入、免疫に関連する DE miRNA
3.8. 2 つのグループ間の DE miRNA の QRT-PCR アッセイ
検証のために 5 つの DE miRNA がランダムに選択されました。 qRT-PCR の結果によると、ssc-miR-19a および ssc-miR-32 の発現は治療群で増加しましたが、ssc-miR-124a、ssc-miR{ {8}}、および ssc-miR-34c は、配列データと一致して、コントロール グループでより高い発現を示しました (図 8)。
図 8. qRT-PCR によって検証された 5 つの DE miRNA
4。討議
PRRSV は依然として世界の養豚産業において頑固な病原体であり、世界に多大な経済的損失を引き起こしています。 現在、ワクチン接種は主に PRRSV の予防と制御に使用されており、その中で改変生 (MLV) ウイルスワクチンが最も広く使用されています [48]。 このワクチンはPRRSの発生と発生率を減らすのに効果的でしたが、ウイルスの遺伝的変異と多様性も大幅に増加させ、野外での野生ワクチンウイルスと生ワクチンウイルスの間のウイルス組換えを引き起こしました[49、50]。 近年、PRRSV 株のような組換えウイルス NADC30- の蔓延と蔓延により、中国でブタの生殖器・呼吸器症候群が複数回発生しています。 この研究で使用された CHsx1401 と NADC30 の類似性は 92.2 ～ 99.1% のままでした。 それ以来、中国では伝染病が蔓延しています。 エクソソームは、細胞コミュニケーションのメディエーターとして、さまざまな体液に広く存在し、疾患の診断と治療において独特の利点を持っています [51,52]。 以前の報告によると、エクソソームは、抗原提示 [53]、免疫応答 [53,54]、ウイルス複製 [54]、癌 [55]、神経変性疾患 [56]、血管新生 [57]、腫瘍細胞において重要な伝達役割を果たしている移住 [58] と侵入 [59] があり、研究価値が高い。
この研究では、ハイスループット シーケンス技術を使用して血清エキソソームの miRNA 発現プロファイルを構築し、33 個の DE miRNA が同定されました。 誰もが知っているように、宿主にコードされた miRNA はウイルス ゲノムと結合し、ウイルスの複製、合成、放出を調節して感染を制限し、病理学的プロセスに影響を与えることができます [15]。 ウイルスゲノムを標的とする miRNA の研究も動物で繰り返し報告されています。 鶏伝染性嚢病における gga-miR-454 と gga-miR-130b はウイルスゲノムを標的にしてウイルス複製を阻害することができますが、gga-miR-21 はウイルスタンパク質 VP1 を直接標的にして阻害しますウイルスタンパク質の翻訳 [60,61]。 PRRSV 研究では、ssc-miR-181 はウイルスゲノム ORF4 の下流の高度に保存された領域に特異的に結合し、PRRSV の複製を強力に阻害します [62]。 この研究では、2 つのグループ間の ssc-miR-181 の発現差は有意なレベルに達しませんでした。 私たちの研究では、9 つの異なる PRRSV ウイルスのゲノムが CHsx1401 株のゲノムと比較され、最も保存されている 8 つのセグメントが特定されました。 31 DE miRNA が CHsx1401 の最も保存された 8 つのセグメントに結合でき、16 DE miRNA が CHsx1401 の 30 UTR に近い保存配列に結合できると予測されました。 そのうち、5 つの DE miRNA (ssc-miR-34c、ssc-miR-375、ssc-miR-378、ssc-miR-486、および ssc-miR{{ 36}}) は同時に CHsx1401 30 UTR にバインドできます。 さらに、ssc-miR-223 の上方制御された発現は、PRRSV ゲノムの 30 UTR ターゲットに結合すると予測されました。 その結果、ウイルスゲノムの保存配列がその病原性において重要な役割を果たしている可能性があり、異なるPRRSV株のゲノム間の保存配列に結合できるmiRNAがウイルスの病原性の制御において重要な役割を果たしている可能性があることが示された。 ssc-miR-10b [63]、ssc-miR-378 [30]など、差次的に発現するいくつかの miRNA は、以前の研究によって PRRSV に関連しており、PRRSV の制御に直接関与していることが証明されています。 、ssc-miR-124a [64]、let-7f-5p [65]、ssc-miR-744 [66]、および ssc-miR{{57 }}a[67]。
PRRSV は、自然免疫応答を妨害することで宿主の防御を回避できます。 このプロセスは、MAPK シグナル伝達経路、PI3K Akt シグナル伝達経路、オートファジー、ケモカイン、TNF シグナル伝達経路など、多くのシグナル伝達経路によって制御されます。 現在、MAPK シグナル伝達経路には、ERK1/2、JNK、および p38 経路の 3 つの主要な経路が含まれています。 MAPK カスケードの活性化は、宿主細胞のアポトーシスを促進し、ウイルスが宿主の免疫防御応答から逃れるのを助け、PRRSV の複製を促進する可能性があります [68]。 さらに、c-Jun N 末端キナーゼ (JNK) と p38 の活性化も、炎症性因子 IL-10 の放出を促進し、炎症効果を増強する可能性があります。 PRRSV はアポトーシスの誘導に加えて、PRRSV の複製を促進するオートファジーも誘導できます。 PI3K/Aktの活性化はウイルスの侵入とウイルス複製の促進に必要であり、PRRSVによって活性化されたAktはJNK経路を負に制御することによって宿主細胞のアポトーシスを阻害する[71]。 TNF 他の炎症因子とともに炎症反応の誘導と制御において重要な役割を果たす可能性がありますが、TNF 発現は PRRSV 複製の負の制御によって影響を受けます [72]。 本研究では、miRNA (ssc-miR-10b、ssc-miR-122-5p、ssc-miR-124a、ssc-miR-128、ssc-miR{これらの経路に豊富に含まれる{24}}ap-5pなど）は、PRRSV誘導性のアポトーシス、オートファジー、炎症に関与しており、ウイルス免疫応答、免疫回避、複製と密接に関連しています。
カンクサ-免疫システムを改善する
細胞原形質膜にはさまざまな脂質ラフトが豊富に含まれており、スフィンゴ脂質とコレステロールが豊富なスフィンゴ脂質 (スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質) は脂質ラフトの重要な分子です。 ウイルスの一部のタンパク質による脂質の認識は、ウイルスの侵入に必要な条件である可能性がある[73]。 エンベロープウイルスは、ウイルス侵入の段階でウイルスエンベロープ糖タンパク質を脂質ラフトに挿入し、脂質ラフトにある受容体と相互作用するか、自然状態から活性化型に変化して、HSV、SARSコロナウイルス、ウイルスの内部移行/融合を開始または促進します。子豚流行性下痢ウイルス [73,74]。 以前の研究では、MARC-145 細胞の表面からコレステロールを除去すると PRRSV 感染が大幅に減少することが判明し、PRRSV 感染の阻害が細胞コレステロールの除去によって特異的に媒介されることが実証されました。 細胞膜コレステロールの枯渇は、ウイルスの侵入、特にウイルスの付着と放出を有意に阻害した[75]。 スフィンゴ脂質の代謝は膜の構造と接着を調節することができ、これは PRRSV ウイルスの侵入において非常に重要です。 この研究ではエンドサイトーシスが最も重要な濃縮物でした。 エンドサイトーシスは、標的細胞によるエキソソーム取り込みの重要なメカニズムです。 これまでの研究では、エクソソームの取り込みがエネルギーを必要とし、細胞骨格に依存するプロセスであることが示されており、このプロセスにおけるエンドサイトーシスの潜在的な役割が強調されています[76]。 食作用、マクロピノサイトーシス、クラスリンなどを含むいくつかの経路がこのプロセスを媒介できることが証明されており[77,78]、それがエンドサイトーシス物質の異なる分類と役割につながった。 この経路における差次的に発現されるエクソソーム miRNA の濃縮は、エキソソームが PRRSV 感染において重要な役割を果たしており、エクソソームにおける内容物の輸送と取り込みの調節が標的細胞や臓器の病態生理学的変化につながる可能性があることを示しています。
カンクサ-免疫システムを改善する
5。結論
PRRSV に感染したブタからの血清エクソソーム miRNA の同定とバイオインフォマティクス分析を通じて、この研究では、ssc-miR-4331-3p、ssc-miR{{ などのさまざまな PRRSV 関連経路と差次的に発現された miRNA が得られました。 5}}、sscmiR-320、ssc-miR-10b、ssc-miR-124a、ssc-miR-128 など。PRRSV で潜在的な機能的役割を果たします。 -誘導される免疫応答、侵入、およびエクソソームの取り込み。 さらに、単一の miRNA が複数の遺伝子を標的にすることができ、単一の遺伝子も複数の miRNA によって制御されるため、いくつかの miRNA が上記の経路で複数の機能を実行します。 ssc-miR-10b、ssc-miR-378、miR-124a、 let-7f-5p、ssc-miR-744、ssc-miR-19a など。一方、本研究では、に結合できるさまざまな miRNA も予測しました。 CHX1401 ウイルス ゲノムの 30 個の UTR の最も保存されたフラグメント。ssc-miR-34c、ssc-miR-375、ssc-miR-378、ssc-miR{{34} を含む） }、および ssc-miR-6529、ウイルスの病原性の制御に重要である可能性があります。
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