シクロアストラゲノールによるカテプシン B の標的化は、MHC-I 分解の阻害を介して CD8 T 細胞の抗腫瘍免疫を強化します パート 1

抽象的な

バックグラウンドPD-1/PD-L1 経路によって引き起こされる腫瘍抗原の喪失と CD8 T 細胞の枯渇は、腫瘍免疫回避の重要な要因です。 近年、腫瘍治療における伝統的な中国医学の研究が増加しています。 Astragalus membranaceus の有効な活性分子であるシクロアストラゲノール (CAG) は、抗ウイルス、老化防止、抗炎症などの機能があることがわかっています。 しかし、その抗腫瘍効果とメカニズムは明らかではありません。

また、シスタンケのグリコシドは、心臓および肝臓組織の SOD の活性を高め、各組織のリポフスチンおよび MDA の含有量を大幅に減少させ、さまざまな活性酸素ラジカル (OH-、H2O2 など) を効果的に消去し、引き起こされる DNA 損傷から保護します。 OHラジカルによる。 Cistanche フェニルエタノイド配糖体は、フリーラジカルの強力な消去能力、ビタミン C よりも高い還元能力を持ち、精子懸濁液中の SOD の活性を向上させ、MDA の含有量を減らし、精子膜機能に一定の保護効果をもたらします。 Cistanche 多糖類は、D-ガラクトースによって引き起こされる実験的老化マウスの赤血球および肺組織における SOD および GSH-Px の活性を高めることができるほか、肺および血漿中の MDA およびコラーゲンの含有量を減少させ、エラスチンの含有量を増加させることができます。 DPPHに対する優れた除去効果、老化マウスの低酸素状態の延長、血清中のSOD活性の改善、実験用老化マウスの肺の生理的変性の遅延 細胞形態学的変性を伴うCistancheには優れた抗酸化能力があることが実験で示されています皮膚の老化疾患を予防および治療する薬になる可能性があります。 同時に、Cistancheに含まれるエキナコシドは、DPPHフリーラジカルを捕捉する顕著な能力を有し、活性酸素種を捕捉してフリーラジカルによるコラーゲン分解を防ぐ能力があり、また、チミンフリーラジカルアニオン損傷に対する優れた修復効果もあります。

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メソッドCAG の抗腫瘍効果は、MC38 および CT26 マウス移植腫瘍モデルで調査されました。 CAG の抗腫瘍効果は、単一細胞マルチオミクス配列決定によってさらに分析されました。 CAG の標的タンパク質を見つけるために、標的応答アクセシビリティ プロファイリング技術が使用されました。 続いて、共焦点顕微鏡、免疫沈降、および変異プラスミドのトランスフェクションを使用して、CAG の抗腫瘍メカニズムが調査されました。 最後に、マウスまたはオルガノイドにおけるCAG抗体とPD-1抗体の組み合わせた抗腫瘍効果を調査しました。

結果われわれは、CAG が in vivo での腫瘍増殖を効果的に阻害することを発見しました。 私たちの単一細胞マルチオミクスアトラスは、CAG が腫瘍細胞表面抗原の提示を促進し、CD8 プラス T 細胞の殺傷機能の強化を特徴とすることを実証しました。 機構的には、CAG はその標的タンパク質であるカテプシン B に結合し、主要組織適合性複合体 I (MHC-I) のリソソーム分解を阻害し、MHC-I の凝集体が細胞膜に到達するのを促進し、腫瘍抗原のプレステーションを促進します。 。 一方、CAGとPD-1抗体の組み合わせは、異種移植マウスおよび結腸直腸癌オルガノイドにおける腫瘍死滅性CD8プラスT細胞を効果的に強化した。 結論 我々のデータは、カテプシン B のダウンレギュレーションが抗腫瘍免疫を付与し、天然産物 CAG の抗腫瘍メカニズムを解明することを初めて報告しました。

導入

結腸直腸がんは、世界中で最も一般的ながんの 1 つです。 その発生率と死亡率はトップ 3 にランクされており、人間の生命と健康を深刻に脅かしています。1 一般的な治療法には、外科的化学療法と放射線療法、分子標的薬、免疫療法が含まれます。2-4 しかし、がん細胞は通常、表面抗原の喪失を示し、発現します。免疫細胞の監視を逃れるための高レベルの阻害分子。 したがって、腫瘍の免疫逃避の問題を解決するために、研究者らは、免疫細胞に対するがん細胞のマスキングをブロックする免疫チェックポイント阻害剤とネオアンチゲン療法を開発しました。 5-8 免疫チェックポイント阻害剤は、枯渇した免疫細胞を回復させることができますが、がんの表面抗原は細胞は大幅に改善されていません。 したがって、腫瘍表面抗原の提示を促進できる薬剤を見つけることが特に重要です。細胞傷害性 CD8 プラス T 細胞によるがん細胞の認識は、TCR/CD3/主要組織適合性複合体 (MHC-I) 経路に依存します。 TCR は、樹状細胞/がん細胞膜タンパク質 CI によって存在する抗原を受け取り、シグナルを伝達して CD3 にしっかりと接続し、CD3 は細胞質の奥深くまで広がります。9 10 同時に、CD28/B7 シグナルが活性化されます。 CD8 プラス T 細胞は、がん細胞を認識して殺すために共活性化されます。11 最近の研究では、腫瘍の進行過程で、リソソームががん細胞表面の MHC-I 凝集を減少させるが、これは効果的ではないことがわかっています。 12 13 Liu らは、PCSK9 を阻害すると、リソソームでの MHC-I の分解が防止され、MHC-I が細胞膜に戻って抗原を提示できるようになると報告しました。12 したがって、抗原提示機能が回復すると、 MHC-I の作用は、腫瘍の免疫回避をブロックするのに特に重要です。

伝統的な中国医学の活性分子の抗腫瘍介入への応用には大きな展望があることが判明した研究が増えています。14 15 シクロアストラゲノール（CAG）は、抗ウイルス、抗菌、抗抗腫瘍作用を持つレンゲの有効な活性分子です。この研究では、CAG が結腸癌腫瘍の転移腫瘍の増殖を阻害することを発見しました。そのメカニズムは主に、カテプシン B (CTSB)、がん細胞の抗原提示を促進し、CD8 プラス T 細胞の殺傷能力を強化します。

材料および方法

抗体と試薬

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99パーセント）。 CTSB (カタログ番号12216-1-AP、PRID: AB_2086929 )、HLA (カタログ番号15240-1-AP、PRID: AB_1557426)、アクチン (カタログ番号{{ 5}}Ig、PRID: AB_2782959 )、チューブリン (カタログ番号10094-1-AP、PRID: AB_2210695 )、および抗マウス/ウサギ免疫組織化学検出キット (カタログ番号PK10006)プロテインテック社から購入しました。 H2-Kd の抗体 (Cat#sc-53852、PRID: AB_784514)、LAMP1 (Cat#sc- 20011、PRID: AB_626853)、および CTSB (Cat#sc-365558、PRID: AB_10842446) は Santa Cruz Biotechnology から購入しました。 Ki-67 の抗体 (カタログ番号 12202、PRID: AB_2620142 ) は Cell Signaling Technology から購入しました。 Na/K ATPase の抗体 (カタログ番号 ab3528、RRID: AB_303877) は、Abcam から購入しました。 CD45-V500 (カタログ番号561487、RRID: AB_1069704 6)、CD3-APC (カタログ番号345767、RRID: AB_2833003)およびCD{のフローサイトメトリー抗体{31}}PerCP (カタログ番号 345774、RRID: AB_2868802) は BD Bioscience から購入しました。 Gzmb-FITC のフローサイトメトリー抗体 (カタログ番号 515403、RRID: AB_2114575 ) は BioLegend から購入しました。 NK1.1-PE-Cy7 (カタログ番号25-5941-81、RRID:AB_469664) および IFN- -PE (カタログ番号12-7311-81、RRID) のフローサイトメトリー抗体:AB_466192) は Thermo Fisher Scientific から購入しました。 DMEM 培地 (カタログ番号01-052-1ACS)、ペニシリンストレプトマイシン (カタログ番号 15140122)、およびウシ胎児血清 (カタログ番号 C04001-500) は、Biological Industries から購入しました。 ヤギ血清 (カタログ番号 88RNG001) および Pierce BCA タンパク質アッセイ キット (カタログ番号 23225) は、Thermo Fisher Scientific から購入しました。 抗ヒト PD-1 (カタログ番号 BE0188、RRID: AB_1095031 8) および抗マウス PD-1 (カタログ番号 BE0146、RRID: AB_1094905 3) の抗体Bio X cellから購入しました。 MACS 腫瘍組織解離キット (カタログ番号130-095-929) は Miltenyi Biotec から購入しました。

細胞培養

マウス結腸癌細胞株 MC38 および CT26 は私たちの研究室で維持されました。20 ヒト結腸癌細胞株 HCT-116 は、中国科学院 (中国、上海) の Type Culture Collection から入手しました。 MC38、CT26、および HCT-116 細胞は、10% ウシ胎児血清および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM 培地中で、5% CO2 インキュベーター内、37 度で培養されました。

移植腫瘍実験

6〜8週齢の雌C57BL/6JGptマウス、BALB/cマウス、およびBALB/cヌードマウスをGemPharmatech（南京、中国）から購入した。 MC38またはCT26癌細胞(1×106)を各マウスの皮下に接種した。 腫瘍が１００ｍｍ ３ まで成長すると、マイクをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）群（例えば、１日１回）とＣＡＧ群（例えば、５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回）にランダムに分けた。 腫瘍体積は、式 V= 長さ×幅 2 /2 を使用してキャリパー測定によって決定されました。 ＰＢＳ群マウスの腫瘍体積が１０００ｍｍ ３ に達したとき、マウスの腫瘍を取り出し、写真を撮り、重量を測定した。

単細胞 RNA/ATACseq のマウスからの単細胞解離

マウスからの固形腫瘍を腫瘍解離キットを使用して消化し、単一細胞を取得しました。 シングルセル 10x ゲノミクスメーカーのプロトコルに従って、10x ゲノミクスクロムコントローラーシングルセルシングルセルにロードされた 1000 セル/1000 セルの濃度のシングルセル。 逆転写試薬、バーコード付きゲルビーズ、および分配オイルを細胞と混合して、逆転写用のエマルション中のゲルビーズ（GEM）を生成しました。 scRNA-seq データの前処理と品質管理。

マウス参照ゲノム GRCm38 (mm10) に基づいて、CellRanger V.4.0.0 パイプライン (10×Genomics) で単一細胞 RNA を処理します各実験の配列データ (GSE197229)。 デジタル遺伝子発現マトリックスは、Seurat (V.4.0.0) パッケージを使用して R (V.4.0.4) で実行されました。21 dBeforem 解析の前に、細胞は UMI 番号 (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq データの前処理と品質管理

単一セル ATAC-seq データ (GSE197229) は、count コマンド ラインを使用して cell ranger-at (V.2.0.0) によって前処理されました。 その後の scATAC-seq データ処理と分析には、ArchR (V.1.0.1) パッケージを使用しました 24。その後、ゲノム アノテーションに addArchRGethe nome ('mm10') 関数を使用し、 cre ArrowFiles 関数とデフォルトのパラメータを使用して arrow ファイルを作成します。 次に、filterDoublets 関数を使用して潜在的なダブレットを削除し、デフォルト パラメーターを指定した ArchRProject 関数を使用して ArchR プロジェクトを作成しました。 次に、Harmony パッケージを使用して、addHarmony 関数によるバッチ効果を削除しました。25 次元削減の場合、ArchR の addIterativeLSI 関数を使用して、def t パラメーターで実行します。 単一セルの埋め込みの場合、ハーモニーを備えた ReduceDims オブジェクトを選択し、視覚化のためにパラメーター 'perplexity=30' を指定した addTSNE 関数を使用しました。

siRNA-seqデータとscATAC-seqデータの統合解析

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5。 予測の精度を向上させて 2 つのデータセットをより適切に統合するために、「制約付き統合」モードを使用して scATAC-seq データと scRNA-seq データを再度統合しました。 簡単に説明すると、scATAC-seq の遺伝子スコアに基づいて、scATAC-seq データに細胞型の注釈を付けました。 次に、scATAC-seq と scRNA-seq の両方について、同じ細胞種でのみ遺伝子発現類似性が計算されるように制限リストを作成しました。 t-SNE を使用した教師なしクラスタリングにより 13 個のサブセル クラスターが明らかになり、オンライン補足表 1 に既知または推定のマーカーで注釈が付けられました。

擬似時間系統の軌跡

がん細胞の細胞系統軌跡は、Monocle2 (V.2.18.0) R パッケージを使用して推定されました。26 単球は、逆グラフ埋め込みによって単一細胞ゲノミクス データから明示的なマスター グラフを学習して細胞を分類し、複雑な問題を解決します。我々は、「DifferentialGeneTest」機能を使用して各クラスターから DEG を導出し、細胞軌跡を構築した後、擬似時間内で差次的に発現される遺伝子を検出しました。 すべての擬似時間依存遺伝子は、CellDataSet オブジェクトを取得するプロット_擬似時間_ヒートマップ関数によって視覚化されました。 CellDataSet に基づく系統軌跡プロットと滑らかな発現曲線は、それぞれ_細胞_軌跡と_遺伝子_を擬似時間でプロットすることによって生成されました。28

単一細胞のコピー数変異呼び出し

クローン性の大規模染色体コピー数変異 (CNV) を持つ悪性細胞を特定するために、inferCNV R パッケージを使用して、腫瘍ゲノムの各染色体領域における大きな遺伝子セットの平均発現に基づいて各細胞の遺伝的プロファイルを推論しました。 29 サンプルごとに、がん関連細胞の CNV を推定するための参照として免疫細胞が使用されました。

エンリッチメント分析

KEGG パスウェイと GO アノテーション分析は、PValueCutoff=0.05、PAdjustMethod=BH、QValueCutoff{{6} のパラメーターを指定した R パッケージ clusterProfiler (V.3.11.1) を使用して実行されました。 }.05、MingsSize=10、および MaxGSSize=500.20 50 個のホールマーク遺伝子セット (h.all.V.7.4.symbols. gmt) を使用して遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) を適用し、著しく濃縮されたものを特定しました。 GSEA ソフトウェア (V.4.1.0) による機能経路、名目上の P 値のスクリーニング基準<0.05and false discovery rate q<0.250.30

定量的リアルタイム PCR 分析

MC38 細胞と HCT-116 細胞を 6 ウェル プレートに 6 時間播種し、さらに 24 時間 CAG で処理しました。 細胞を冷PBSで3回洗浄し、18{18}g、4度で5分間遠心分離した。 同時に、腫瘍組織を粉砕した後。 メーカーの指示に従って、TRIzol 試薬を使用して、MC38、HCT-116 細胞、および腫瘍組織から全 RNA を抽出しました。 反応量は、1μg RNA、5μL 5×Hiscript III qRT SuperMix、および RNase Free dH2O を含む 20μL でした。cDNA は、1μL cDNA、5μL qPCR ミックス、0.75μL 5μM プライマーを含む 10μL の反応量で定量 PCR に供されました。プライマーは、以下の配列に従って GenScript Biotech Corporation (中国、南京) によって合成されました (オンライン補足表 2)。

ターゲットに応じたアクセシビリティ プロファイリング アプローチによるターゲットの発見

CAG 結合タンパク質のスクリーニングは前述のように実施されました。31 32 簡単に言うと、標的応答性アクセシビリティ プロファイリング (TRAP) アプローチを使用して、リガンド結合によって誘導されるリジンをモニタリングすることにより、細胞環境における CAG の結合タンパク質を発見しました。アクセシビリティはプロテオームレベルで変化します。 簡単に説明すると、2 つのディッシュの細胞をそれぞれ 10 μM C​​AG およびジメチルスルホキシド (DMSO) で処理しました。 1- 時間のインキュベーション後、細胞を M-PER バッファー (Thermo Scientific) で透過処理し、得られたライセートを、アクセシビリティ プロファイリングのために室温でタンパク質性リジン残基を特異的に標識するホルムアルデヒドとボラン ピリジン複合体の添加により共有結合的に標識しました。 。 次に、溶解物を有機溶媒で沈殿させ、収集したペレットを8mol/L尿素に再溶解し、ジチオスレイトール(DTT)により56度で30分間還元し、続いて暗所でヨードアセトアミド(IAA)を使用して30分間アルキル化した。 適量のＤＴＴ溶液を再度添加して、過剰のＩＡＡと反応させた。 続いて、尿素の最終濃度が 1mol/L に達するまで、プロテオームを重炭酸アンモニウム溶液で希釈しました。 収集したタンパク質消化物を C18 HLB カラム (米国マサチューセッツ州ミルフォードのウォーターズ) で脱塩し、濃縮されたペプチドを乾燥させ、0.1 パーセントのギ酸 (FA) 水溶液で再構成しました。 AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF システム (Waters) を使用してサンプルを分析し、ターゲット発見のための CAG 結合に応答したリシンのアクセス可能性の変化の定量的プロファイリングを行いました。 データ取得にはポジティブモードでのデータ依存性取得を採用した。 データ分析は、PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions、ウォータールー、カナダ) を使用して実行されました。 具体的には、固定修飾としてcysアルキル化を選択し、可変修飾としてTRAP標識によるメチオニン酸化とリジンジメチル化を設定しました。 簡単に言うと、TRAP 誘導性のジメチル化を含み、CAG インキュベーションの有無にかかわらず有意な存在量変化を示したペプチドを、標的応答性ペプチドとして割り当てました。 各 TRAP 標識ペプチドの存在量の比は、アクセシビリティの変化の程度を示し、リガンド結合親和性と密接に関連しています。 スチューデントの t 検定を実行して、検出された標識ペプチドのアクセシビリティの変化が統計的に有意であるかどうかを評価しました。 グループ間 p 値 (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

オルガノイド培養

ヒト結腸直腸がんオルガノイドは、重慶キングバイオテックによって構築および培養されました 33。外科手術によって採取された患者組織サンプルは、滅菌ハサミでできるだけ小さな断片に切り刻まれました。 組織片を氷上でおよそ 1:4 の比率で Matrigel (Corning、カタログ番号 356231) と完全に混合しました。 その後の処理は公開されたプロトコルを参照しました。 簡単に説明すると、小片マトリゲル懸濁液をマルチウェル プレートにすばやく播種して半球状の液滴を形成し、37 度に 15 ～ 20 分間移して液滴を固化させました。 適切な量​​の培地 (KingcultureTM Organoid Growth Medium、Cat#KCW-2) を各ウェルに添加し、2 ～ 4 日ごとに培地を交換します。

ヒトCD8 T細胞の分離と培養

抗凝固剤を含む健康な人の末梢血に同量の生理食塩水を加えて、全血を希釈します。 一定量の分離液を 15mL 遠沈管に加え、希釈した全血を管壁に沿って分離液の上部にゆっくりと加え、750g で 20 分間遠心分離します。 遠心分離後、ピペットを用いて中央の白色層の単球を 15mL 遠沈管に注意深く吸引し、一定量の PBS を加えて再懸濁し、250g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。 細胞沈殿にヒト CD8 磁気ビーズを添加した後、CD8 T 細胞を LS ソーティング カラムでソーティングしました。 CD8 T 細胞を、5μg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific カタログ番号 16-0032-38、RRID: AB_2865578) 抗体でプレコートした多孔プレートに添加し、次に 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech カタログ番号 212-12) および 5μg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific カタログ番号 16-0281-81、RRID: AB_468920) 機能性抗体を添加し、24 時間培養しました。

共培養

オルガノイドを CAG とともに 24 時間インキュベートした後、新鮮な培地を交換し、オルガノイドと活性化 CD8 T 細胞をマトリックス ゲルに懸濁し、懸濁液を 6 ウェル プレートに加え、37 ウェルプレートに配置しました。 15 分間インキュベーターに入れ、その後 2mL の無血清完全培地を加えて 24 時間培養しました。

ウエスタンブロット

MC38 細胞と HCT-116 細胞を 6 ウェル プレートに 6 時間播種し、さらに 24 時間 CAG で処理しました。 細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、４℃、１８０ｇで５分間遠心分離した。 全タンパク質を、1パーセントのプロテアーゼ阻害剤を含むWB-IP溶解液で氷上で30分間溶解させた。 総タンパク質は、BCA タンパク質定量キットを使用して評価されました。 タンパク質サンプルは 10% ～ 12% SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、350 mA で 90 分間 PVDF (ポリフッ化ビニリデン) 膜に転写されました。 PVDF 膜を 5 パーセント BSA で 1 時間ブロックし、ストリップを指定の一次抗体で一晩ブロックし、二次抗体で室温で 90 分間インキュベートしました。 最後に、LumiGLO 化学発光基質システム (KPL、米国メリーランド州ゲーサーズバーグ) を使用してストリップを検出しました。

フローサイトメトリー

腫瘍組織を消化した後、単細胞懸濁液を調製しました。 表面染色は、FCM (フローサイトメトリー) 緩衝液 (1% FBS を含む PBS) 中の表面抗原抗体を用いて実行し、適切な抗体を用いて氷上で 30 分間染色しました。 死細胞を除去するために反応性色素 (eBioscience) が使用されました。 細胞内サイトカイン染色はBD細胞固定液/細胞外膜液を用いて行い、細胞を固定・浸透させた後、Perm/Washバッファー(BD Biosciences)中でサイトカインに対する抗体で染色した。

CTSB 変異プラスミドのトランスフェクト

HCT-116 細胞を 6- ウェルプレートに 12 時間播種し、CTSB-WT-EGFP または CTSB 変異体プラスミド (Y75A、A77V、および G198A) で 36 時間トランスフェクトしました。

MC38 細胞または HCT-116 細胞への CTSB プラスミドのトランスフェクション干渉または過剰発現

MC38 細胞 (1×106 /ウェル) を 6- ウェルプレートに 6 時間播種し、次に CTSB 干渉 RNA (配列: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT および Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) を 48 時間トランスフェクトし、mRNA またはタンパク質の発現レベルを測定しました。のCtsbとH2-k1が検出されました。 HCT-116 細胞 (1×106 /ウェル) を 6- ウェルプレートに 6 時間播種し、CTSB 干渉 (配列: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) または過剰発現プラスミドを 48 時間トランスフェクトし、mRNAまたは、CTSBおよびHLA-Aのタンパク質発現レベルが検出されました。

ドッキング技術

CTSB の 3D 構造は Protein Database (PDB ID: 2iPP) からダウンロードし、CAG の構造は PubChem からダウンロードしました。 ドッキング プロセスは、シミュレーテッド アニーリング アルゴリズムを使用した粗いドッキングとその後の遺伝的アルゴリズムを使用した改良により、Autodock 2 で実行されました。

細胞サーマルシフトアッセイ

MC38細胞を10cmプレートに一晩播種し、次にCAGまたは0.1パーセントDMSOでさらに2時間処理しました。 細胞を収集し、冷PBSで洗浄し、180gで5分間遠心分離した。 次に、細胞を遠心分離チューブ (各チューブ 70 μL) に均等に分割し、次の温度で 3 分間加熱しました: 46、49、52、55、58、61、64、および 67 度、サンプルを以下の温度で 3 分間冷却しました。その後氷上に置いた。 次に、サンプルを-80度の冷蔵庫に一晩置きました。 サンプルを室温で 30 分間解凍し、-80 度で 4 時間冷蔵しました。 最後に、サンプルを 12,000 g で 25 分間遠心分離し、上清をローディングバッファーに加え、ウェスタンブロッティングで分析しました。

免疫組織化学的染色

腫瘍組織のパラフィン切片をキシレンに 20 分間浸して脱蝋し、その後 100 パーセント、75 パーセント、および 50 パーセントのエタノールに 10 分間浸しました。 スライスをクエン酸ナトリウム抗原修復溶液で抗原修復した後、内因性過酸化水素を 3% 過酸化水素で不活化しました。 ５％ヤギ血清で１時間ブロッキングした後、抗Ｋｉ６７抗体（１：２００）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。 抗マウス/ウサギ HRP 標識ポリマー (100 μL) を加え、サンプルを 37 度で 30 分間インキュベートし、続いて 100 μL の DAB 作業溶液を加え、室温で 5 分間インキュベートしました。 ヘマトキシリンで 1 分間染色した後、サンプルを 50 パーセント、75 パーセント、100 パーセントのエタノールとキシレンで 5 分間洗浄し、中性ゴムを使用してフィルムをシールしました。 フィルムを顕微鏡で観察し、写真に撮った。

統計的分析

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェア (V.8.0) を使用して実行されました。 すべての結果は、3 回の独立した実験の平均値±SEM として表されます。 3 つ以上のグループがある場合の差異を評価するために、一元配置分散分析とそれに続くダネットの事後検定を使用しました。 スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間の有意差を評価しました。 統計的有意性は p に設定されました。<0.05.

結果

マウス移植結腸癌の増殖を阻害するCAGの単細胞マルチオミクス解析

CAG に抗腫瘍効果があるかどうかを調べるために、まず MC38 がん細胞を C57BL/6 マウスに移植しました。 我々は、CAG が腫瘍の増殖を有意に阻害したことに注目しました (オンライン補足図 S1A、B)。 続いて、CT26細胞をBALB/cマウスに移植したところ、CAGが腫瘍の増殖も阻害することがわかりました（オンライン補足図S1C、D）。

CAG が腫瘍増殖を阻害する具体的な機構をさらに明らかにするために、scRNA-seq および scATAC-seq 技術を使用して解析しました (図 1A)。 細胞集団をがん細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、リンパ球の 4 つのグループに分けました (図 1B、オンライン補足図 S2A、B)。 私たちは、主に癌細胞 (52 パーセント) と線維芽細胞 (41 パーセント) が腫瘍組織に浸潤しているのに対し、免疫細胞はわずか 7 パーセントを占めていることを発見しました。 次に、がん細胞を 8 つのサブセットに、線維芽細胞を 3 つのサブセットに分割しました (図 1C ～ E)。 続いて、各細胞集団における高発現遺伝子の濃縮分析により、T 細胞および NK 細胞の抗腫瘍シグナルと同様に、がん細胞における MHC-I 分子経路が濃縮されていることが示されました (オンライン補足図 S2C)。 次に、scATAC-seq および scRNA-seq 統合解析を使用して 4 つの細胞グループも見つかりました (図 2D–G)。 比較の結果、癌細胞 (C01、C03 細胞)、CD8 プラス T 細胞、Spp1 プラス TAM 細胞、および線維芽細胞 (F01 および F02 細胞) が ATAC シーケンスに出現し (図 1F、G)、さらに高度に発現していることがわかりました。これらの細胞には転写因子が豊富に含まれていました (図 1H)。 これらの分析を通じて、CAG による腫瘍増殖の阻害はこれらの細胞の変化と密接に関連していると推測されます。

Cagは腫瘍細胞抗原提示を促進します

CAG の抗腫瘍メカニズムを分析するために、我々はまず腫瘍細胞集団を分析し、癌細胞を 8 つのサブグループに分けました (図 2A、B、オンライン補足図 S3A)。 結果は、PBS グループと比較して、C05 グループの細胞が大幅に減少し、C07 グループの細胞が増加したことを示しました (図 2C)。 一方、腫瘍細胞のクラスタリングの精度を検証するために、参照細胞としてリンパ球と骨髄細胞の CNV を比較しました。 結果は、癌細胞の CNV が免疫細胞の CNV よりも有意に高いことを示しました (オンライン補足図 S3B)。 がん細胞のサブセットを分析したところ、インターフェロン応答遺伝子 Isg15、Irf7、Ifit3、および Ifi47 が、PBS グループと比較して CAG グループの C07 および C08 細胞集団で高度に発現していることがわかりました (オンライン補足図 S3C)。 腫瘍細胞集団の分析により、抗原提示関連経路が複数の細胞集団で大幅に濃縮されていることが判明しました。 したがって、我々は、CAG が癌細胞の抗原提示を促進して抗腫瘍の役割を果たす可能性があると推測しています (図 2D)。 次に、抗原提示関連遺伝子を選択したところ、CAG グループの発現レベルが PBS グループよりも有意に高いことがわかりました (図 2E、オンライン補足図 S3D)。 また、CAG が腫瘍組織における抗原提示を促進することも発見しました (図 2F、G)。

次に、scATAC-seq を使用して、CAG 促進腫瘍細胞抗原提示の背後にある特定の理由を分析しました。 我々は、腫瘍細胞集団が転写因子Fos、Junb、Jund、Fosb、Fosl1を高度に発現していることを発見しました（図2H、I）。 次に、CAGが腫瘍細胞抗原提示関連遺伝子の発現を促進することを説明するために、転写因子と対応する遺伝子の間の相互作用マップを構築しました（図2J）。 腫瘍組織では、CAG 治療下の PBS グループで転写因子 Junb、Fos、Jund、および Fosb が有意に過剰発現していることもわかりました (図 2K–N、オンライン補足図 S3E-I)。 これまでに、CAGが抗原提示関連遺伝子の転写因子の発現を促進し、がん細胞の抗原提示機能を増強することがわかってきました。 しかし、これらのがん細胞が免疫細胞応答にどのように応答するかは依然として不明です。

CAG ががん細胞の抗原提示を促進する現象を明らかにするために、我々はトラジェクトリー解析を実行して、がん細胞が免疫細胞応答に応答してどのように相互に変化するかを調べました。 私たちは、時間の経過とともに、C07 がん細胞が C05、C06、および C08 細胞に形質転換することを発見しました。また、遺伝子濃縮により、がん細胞が抗原提示に形質転換することが示されました (図 3A ～ E)。

CAGは免疫細胞の殺傷機能を強化します

これらの結果は、CAG が腫瘍細胞抗原を提示できることを示していますが、腫瘍細胞抗原提示の強化は免疫細胞機能の強化につながるでしょうか? これを解明するために、リンパ球と骨髄細胞をそれぞれ分析しました。 結果は、CAGが腫瘍組織におけるCD8プラスT細胞の浸潤を促進し、CD8プラスT細胞とNK細胞の浸潤も増加していることを示し、フローサイトメトリーで検出されました（オンライン補足図S4A〜F）。 また、CAG が CD8 プラス T 細胞における Ifitm2、Cxcr6、および S100a6 遺伝子の発現を増強することも観察しました。

NK 細胞の Fcer1g、Gzmb、AW112010、および Zfp36i2 遺伝子、および CD4 プラス T 細胞の Nfkbia および Junb 遺伝子 (オンライン補足図 S4G)。 フローサイトメトリーによって検出されたように、CD8 プラス T 細胞における Ifng および Gzmb の発現も大幅に増強されました (オンライン補足図 S4H、I)。 さらに、CAG 治療後、CD8 プラス T 細胞の表面上の抑制性受容体 Lag3、Tigit、および Havcr2 の発現が減少し、Cd28、Cd69、Gzmk、Ccl5、および Pdcd1 遺伝子の発現が減少することを発見しました。 CD8 プラス T 細胞の活性化が大幅に増加しました (オンライン補足図 S4J)。 CAGが腫瘍抗原提示の強化を促進することによってCD8プラスT細胞の殺傷機能を強化することをさらに検証するために、ヌードマウスの移植腫瘍にCT26細胞を移植し、CAGが腫瘍の増殖を効果的に阻害できないことを観察した（オンライン補足図S4K-M） ）。

これに続いて、骨髄細胞を分析したところ、CAG治療後にSpp1 + TAM細胞が増加する一方、C1qc + TAM細胞の数が減少し、Il1b + 単球の数が増加したことがわかりました（オンライン補足図S5A〜D）。 CAG 処理後、Spp1 プラス TAM 細胞および C1qc プラス TAM 細胞は、炎症誘発性 TAM 形質転換を受けやすくなりました。 濃縮分析により、主に Tnf-α、Ifn-g、および炎症反応シグナル伝達経路に焦点を当てていることがわかりました (オンライン補足図 S5E-H)。 上記の結果に基づいて、CAG はがん細胞における抗原提示を促進することにより、免疫細胞の認識および殺傷機能を強化すると推測されます。 ただし、CAG がどのように規制されているかは明らかではありません。

トラップによるCAG標的タンパク質CTSBの発見

次に、抗腫瘍の役割を果たす特定の CAG 標的タンパク質を調査します。 CAGががん細胞の抗原提示を増強し、免疫細胞の殺傷機能を増強することがわかったため、研究対象としてがん細胞を選択しました。 私たちは最初に CAG のビオチン誘導体を合成し、3-OH のみが反応できることを発見しました (オンライン補足図 S6A)。 次に、CAG-ビオチンがマウスMC38腫瘍細胞株における抗原提示関連遺伝子の発現も促進するかどうかを調査しました。 結果は、CAG-ビオチンがH2-K1、Cd74、およびAnxa1遺伝子の発現に影響を及ぼさなかったことを示しています（オンライン補足図S6B-D）。

したがって、実験室では以前の TRAP ターゲット検索方法を使用しました 32。CAG と DMSO の両方を MC38 細胞株とともにインキュベートしました (図 4A)。 CAGの標的タンパク質の候補として、FCが2以上、apが0.05以下のタンパク質を選択しました。 小分子がタンパク質に結合するとリジンの標識効率が低下するという原理に従って、研究には CTSB を選択しました (図 4B)。 次に、細胞熱シフトアッセイ (図 4C) およびマイクロスケール熱泳動 (MST) (図 4D) を使用して CAG と CTSB 間の結合を検証したところ、CAG と CTSB 間の親和性が 26.6nM であることがわかりました (図 4D)。 次に、PDB ライブラリーの CTSB のタンパク質結晶構造に基づいて、CAG と CTSB 間の結合部位を予測しました。 CAG の両端の水酸基と CTSB の ALA77 および GLY198 部位が水素結合で結合しているのに対し、CAG と CTSB の TYR75、PRO76、ALA173 部位はファンデルワールス力で結合していることがわかりました (図 4E)。 。 CAG と CTSB の間の結合部位を検証するために、HCT-116 細胞に CTSB の変異プラスミドをトランスフェクトしました。 結果は、A77VおよびG198Aの変異プラスミドとCAGの間の親和性がWTプラスミドの親和性よりも数百倍高かったことを示しています(図4F、G)。 次のセクションでは、CAG が CTSB を通じて抗腫瘍の役割を果たす具体的なメカニズムを検討します。

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