カテキンで乳酸デヒドロゲナーゼAを標的とすることは、SNU620/5FU胃癌細胞を5-フルオロウラシルパート1に再感作させる
Mar 23, 2022
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概要：抗癌治療に対する耐性は、事実上すべての種類の癌で発生し、癌治療において大きな困難になります。 5-フルオロウラシル（5FU）は胃癌の抗癌療法の第一選択ですが、薬剤耐性のためにその有効性は限られています。 最近、エネルギー生産のための酸化的リン酸化よりも解糖の優先であるワールブルク効果を含む癌代謝の変化が、化学療法に対する耐性を調節する極めて重要なメカニズムとして受け入れられています。 したがって、本発明者らは、確立された胃癌細胞株、SNU620およびSNU620 /5FUを使用して5FU耐性を改善する上での抗糖分解剤の詳細なメカニズムおよび可能な有用性を調査した。の解糖関連酵素、親SNU620細胞のものよりも乳酸デヒドロゲナーゼA（LDHA）など。 解糖を制限するために、既知のカテキンとその誘導体を調べました。抗炎症薬エピガロカテキンガレートがLDHA発現の抑制剤として以前に報告されているため、抗がん性天然物。 その中で最も単純な化合物であるカテキンは、乳酸産生とLDHA活性に対して最も高い阻害効果を示しました。 さらに、5FUとカテキンの組み合わせは、追加の細胞毒性を示し、SNU620 / 5FU細胞で活性酸素種（ROS）を介したアポトーシスを誘導しました。 したがって、これらの結果に基づいて、LDHAを制限することにより5FUへの化学療法抵抗性を低下させる新規アジュバント薬の開発の候補としてカテキンを提案します。
キーワード：5-フルオロウラシル;化学療法抵抗性; 解糖; 乳酸脱水素酵素; カテキン
1.はじめに
原発腫瘍の外科的切除と、エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシル、ドセタキセル、オキサリプラチン、5FUなどの5-フルオロウラシル（5FU）ベースの併用化学療法による胃癌の治療において、目覚ましい進歩が達成されました[1 、21今日まで、チミジル酸シンターゼを阻害することによってDNA合成をブロックするウラシルの類似体である5FU [3]は、胃癌の治療に一般的に使用される化学療法薬であり続けています[1、A4]。 しかし、化学療法の臨床的有効性は、薬剤耐性に関連する原発性または転移性の癌の再発のために不十分でした[1,5]。
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薬物の活性化または不活性化、DNA損傷の修復機構、薬物標的の修飾、アポトーシス経路の不活性化、オートファジーの増加など、いくつかの細胞プロセスが化学療法抵抗性の根底にある重要なメカニズムと見なされています[6,7]。 癌は不均一であり、さまざまな癌がエネルギー代謝に解糖と酸化的リン酸化の両方を使用します[8]。 しかし、代謝の再プログラミング、特に異常な嫌気的解糖は、胃癌における5FUを含む化学療法薬に対する耐性の発達における重要な役割を果たしていると報告されています[9]。 乳酸デヒドロゲナーゼA（LDHA）およびピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）は、ピルビン酸から乳酸を生成する好気性解糖の主要な調節因子として知られています[10,11]。 PDKの確立された阻害剤であるジクロロ酢酸の組み合わせは、5FUに対する感受性を回復させます[12]。 さらに、ピルビン酸から乳酸への変換を触媒する重要な酵素であるLDHAは、胃癌の治療の潜在的な標的として報告されています[13,14]。 癌細胞におけるLDHA発現のノックダウンは、ミトコンドリア呼吸を増加させ、細胞生存率を低下させることにより、腫瘍形成能を阻害します[15]。 FX11、PSTMB、GSK 2837808AなどのいくつかのLDHA阻害剤は、ATPレベルを低下させ、酸化ストレスを生成し、最終的にアポトーシス細胞死を引き起こします[16-18]。 microRNA -34 aによるLDHAの阻害が結腸癌の5FUに対する耐性を回復することを示した研究がありますが[19]、これまでの研究では、化学療法抵抗性に対する遺伝的または薬理学的LDHA阻害剤の効果は報告されていません。
カテキン（CA）、エピカテキン（EC）、ガロカテキン（GC）、エピガロカテキン（EGC）、エピカテキン-3-ガレート（ECG）、エピガロカテキン-3-ガレート（EGCG）などの緑茶ポリフェノールは、ヒトを促進します炎症、糖尿病、心血管疾患、悪性癌などのいくつかの病気を予防および治療することによる健康[20,21]。 ポリフェノールの中で、EGCGはAMPK経路を活性化し、癌の幹細胞性を制限することにより、結腸直腸癌および肝細胞癌細胞の5FU化学感受性を増強します[22,23]。 さらに、EGCGは乳がんおよび膵臓がん細胞での発現を抑制することによりLDHAを阻害することが報告されています[24,25]。
この研究では、CAが胃癌細胞の5FUに対する耐性を低下させるためのアジュバント薬の候補である可能性があると仮定しました。 ＬＤＨＡ活性に対するＣＡの阻害効果、および／または５ＦＵとのその組み合わせが、それによって５ＦＵ耐性細胞においてミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）およびアポトーシス細胞死を誘導することが調べられた。
2.結果
2.1。 5FU耐性細胞の解糖特性
増殖の増強は、5FU耐性の癌細胞を含む化学療法抵抗性の特徴です[26,27]。 まず、SNU620およびSNU620/5FU細胞の5FUに対する耐性と長期増殖率を確認しました。 これらの細胞を指示された濃度の5FUで48時間培養した場合、SNU620 / 5FU細胞（100.63 uM）で50％の増殖阻害（Gl50）を引き起こす推定用量は、親SNU620細胞でGIsoを引き起こす用量（28.88μM）よりもはるかに高かった。 ）（図1Aおよび補足図S1）。 さらに、SNU620 / 5FU細胞の増殖速度は、SNU620細胞の増殖速度よりも速かった（図1Bおよび補足図S2）。 化学療法抵抗性と急速に成長する特性は胃癌細胞の解糖特性の上昇に関連している可能性があるため[28]、細胞外酸性化率（ECAR）と酸素消費率（OCR）を、よく知られているオキサメートの存在下で両方の細胞で測定しました。解糖阻害剤かどうか。 結果は、SNU620 / 5FU細胞が、SNU620細胞によって分泌される乳酸よりも有意に多くの乳酸を分泌し、続いて培地を酸性化することを示しました（図1Cおよび補足図S3）。 ただし、これらのセル間でOCRの有意な変化は観察されませんでした（図1D）。 LDHAのmRNAとタンパク質の発現レベルを測定しました。 LDHAの発現はSNU620細胞よりもSNU620/5FU細胞の方が高かった（図1E、F）。 さらに、PDKアイソタイプのmRNAおよびタンパク質の発現レベルを調べたところ、PDK2およびPDK3の発現レベルはSNU620細胞よりもSNU620 / 5FU細胞の方が高かった（補足図S4A、B）。 PDKによって増加したピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDHA1）のE1サブユニットのリン酸化も評価され、SNU620細胞よりもSNU620 / 5FU細胞の方が高いことがわかりました（補足図S4C）。 SNU620/5FU細胞の5FU耐性を克服するためのLDHA阻害剤としてのオキサメート。 この化合物は、SNU620細胞とSNU620 / 5FU細胞の両方で細胞増殖を阻害しました（補足図S5）。 さらに、オキサメートまたは5FUin SNU620 / 5FU細胞による個別の処理と比較して、オキサメートおよび5FUによる同時処理は細胞増殖を抑制しました（図1G）。 これらのデータは、SNU620 / 5FU細胞がLDHAを高度に発現し、LDHA活性の阻害がSNU/5FU細胞の5FUに対する耐性を克服できることを示唆しています。
図1.結果によると、5-フルオロウラシル（5FU）耐性細胞は解糖特性が高くなっています。（A）SNU620およびSNU620 / 5FU細胞は、示された濃度の5FUで48時間処理されました。 これらの細胞の生存率はMTTアッセイによって評価されました;（B）SNU620およびSNU620 / 5FU細胞の成長レベルはMTTアッセイで4日間毎日測定されました;（C、D）SNU620およびSNU620 / 5FU細胞はオキサメートで処理されました（ 5mM）または24時間なし、ECARおよびOCR値をSeahorse XFアナライザーで評価しました;（E、F）SNU620およびSNU620/5FU細胞でのLDHAの発現をqRT-PCRおよびウエスタンブロット分析で検出しました。 （G）SNU620およびSNU620 / 5FU細胞をオキサメート（25 mM）および/または5FU（10μM）で48時間処理しました。結果は平均±SEMとして示されています。** p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
2.2。 CAはLDHAアクティビティを抑制します
乳酸産生は、SNU620 / 5FU細胞において、CAおよびその誘導体（EC、GC、EGC、およびEGCGを含む）を使用して分析されました。 これらの誘導体と比較して、CAは乳酸産生をより効果的に減少させました（図2A）。 さらに、in vitroで、LDHA活性が確認され、CAはその誘導体よりもLDHA活性に対して強い阻害効果を示しました（図2B）。 インビトロLDHAおよびLDHB活性に対するCAの阻害効果を用量依存的に測定した。 CAは、LDHB活性に影響を与えることなく、LDHA活性を阻害しました（図2C、D）。 さらに、LDHAおよびLDHB活性は、LDHA活性を阻害することが知られているEGCGで測定され、用量依存的に減少することがわかりました（補足図S6A、B）。 さらに、細胞内LDHAおよびLDHB活性は、SNU620/5FU細胞におけるCAの示された濃度で評価されました。 CAはinvitroの結果で用量依存的にLDHA活性を阻害しましたが、LDHB活性は阻害しませんでした（図2E、F）。 p-PDHA1、PDK2、PDK3、およびLDHAのタンパク質発現レベルもCA処理後のSNU620 / 5FU細胞で測定され（補足図S7）、これらはこの処理の影響を受けないことが観察されました。 これらの結果は、CAがその発現に影響を与えることなくLDHA活性を調節することを示唆している。
2.3。 CAによるLDHA阻害の作用機序
CAおよびその誘導体に対するLDHA活性の阻害メカニズムを分析するために、ヒト組換えLDHAとCAの間の結合相互作用の分子モデリングを実施しました（図3A、B）。 結果は、CAがLDHAのT94、A95、Q99、R105、S136、R168、H192、およびT247の残基と相互作用する可能性があることを示しました。 それらの中で、R105、S136、およびR168は基質（ピルビン酸）結合に重要です。 したがって、CAが基質結合部位に干渉する可能性があると想定しました。 それどころか、EGCGは別のサイトを介してLDHAに結合しています。 CAによるLDHA阻害の作用機序をさらに検証するために、ミカエリスメンテンプロットとラインウィーバーバークプロットをさまざまな濃度のピルビン酸とCAで確認しました。 LDHA活性は、ピルビン酸の用量依存的に増加しました。 しかし、CAの増加により逆転しました。 したがって、ミカエリスメンテンプロットとラインウィーバーバークプロットの結果は、CAがLDHAに対する非競合的阻害剤であることを示しました（図3C、D）。さらに、等温滴定カロリメトリー（ITC）データは、CAがKdによってLDHAに物理的に結合することを示しました。 197 uMの値（補足図S8）。 これらの結果は、CAがLDHAの基質結合部位に結合することでLDHA活性を抑制するという洞察を提供します。
2.4。 CAはLDHA活性を低下させることにより5FU耐性を再感作します
SNU620およびSNU620/5FU細胞に対するCAの細胞毒性効果を評価し、CAが両方の細胞群で増殖を抑制することを発見しました（図4A）。 増殖阻害がLDHA活性の抑制に関連していることを確認するために、LDHA（shLDHA）のショートヘアピンリボ核酸（shRNA）によってLDHAの発現を無効にし、LDHA発現プラスミドのトランスフェクションによってその発現を回復させました（補足図S9A、B ）shLDHAをトランスフェクトしたSNU620 / 5FU細胞では、偽トランスフェクト細胞と比較して、乳酸産生と細胞生存率はCA処理によって著しく変化しませんでした（図4B、C）。さらに、CAの増殖阻害効果はLDHAノックダウンSNU620/5FU細胞でのLDHA発現の回復により増加しました（図4D）。 さらに、SNU620およびSNU620 / 5FU細胞は、CAおよび5FUを個別に、または両方を組み合わせて処理した後に検査されました。 CAと5FUの併用治療は、SNU620 / 5FU細胞の増殖を有意に抑制しました（図4E）。 さらに、CAと5FUの組み合わせ効果は、ヒト胃癌AGS、膵臓癌Panic -1、MIA PaCa -2、結腸癌LS174TおよびRKO細胞などの他のいくつかの細胞株で調べられました。 SNU620およびSNU620/5FUセル。 乳酸産生とLDHA発現は互いに良好な相関関係を示し、これらの解糖特性はSNU620 / 5FU、AGS、およびRKOで比較的高い（補足図S10A、B）。 さらに、CAと5FUの併用処理は、AGSやRKOを含む解糖系細胞での5FUの単一処理と比較して、細胞の生存率を大幅に低下させました（補足図S10C）。 ただし、CAと5FUの同時処理は、SNU620、Panic -1、MIA PaCa -2、およびLS174T細胞の増殖を有意に阻害せず、LDHAの発現は低かった。 これらの結果は、5FU耐性細胞に対するCAの感作効果がLDHA活性に対するその阻害効果に関連している可能性があることを示唆した。
図2.カテチン（CA）はLDHA活性を阻害しますが、その発現は阻害しません：（A）CA誘導体（10μM）で24時間処理した後、SNU620 / 5FUの乳酸産生を測定しました。（B）invitroLDHA活性は処理時に評価しました。 CA誘導体（10 uM）およびオキサメート（20 mM）;（C、D）in vitroで、LDHAおよびLDHB活性は、示されたCA濃度で推定されました。 （E、F）細胞を指示された濃度のCAで24時間処理した。 細胞内LDHAおよびLDHB活性は、酵素源として細胞溶解物を使用して測定されました。 結果は平均±SEMとして示されています。 ** p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
図4.5FU耐性細胞におけるカテキン（CA）および5-フルオロウラシル（5FU）との同時処理により、細胞生存率が阻害されました。 CAで48時間;（B）SNU620/5FU-pLKO.1およびSNU620/5FU-shLDHA細胞をCA（10μM）で24時間処理しました。 乳酸産生は、SNU620/5FU-pLKO.1およびSNU620/5FU-shLDHA細胞の培地で測定されました;（C、D）SNU620 / 5FU-pLKO.1、SNU620 / 5FU-shLDHA、SNU620/5FU-shLDHAプラスEV 、およびSNU620 / 5FU-shLDHAとLDHA＃2細胞を、示された濃度のCAで48時間処理しました。 細胞生存率はMTTアッセイを使用して測定しました;（E）SNU620およびSNU620 / 5FU細胞をCA（10μM）および/または5FU（10μM）で48時間処理しました。 これらの細胞の生存率は、MTTアッセイを介して測定されました。 結果は平均±SEM。*pとして示されています。<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">
この記事はIntから抜粋したものです。 J.Mol。 科学 2021、22、5406。https：//doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms
