ラット肝臓におけるミトコンドリア生合成およびMtDNA損傷に対するカロリー制限の年齢に敏感な有効性
Jul 14, 2022
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概要：カロリー制限 (CR) は、ミトコンドリア機能障害などの加齢に伴う変化の発症を遅らせるための最も効果的な治療法です。 ただし、CR に対するミトコンドリア マーカーの感度と CR 有効性の年齢に関連した境界は完全には解明されていません。 自由摂取（AL）ラットの肝臓サンプルを使用し、18-月齢（AL-18）、28-月齢（AL-28）に分けました。 、32-月齢(AL-32)群、およびCR治療(CR) 28-月齢(CR-28)および32-から月齢（CR-32）の対応物を使用して、いくつかのミトコンドリアマーカーに対するCRの効果をアッセイします。 クエン酸シンターゼ活性、TFAM、MFN2、DRP1 タンパク質量、および AL-28 群の mtDNA 含有量の加齢に伴う減少は、CR-28 対応群で防止されました。 したがって、CR は、CR-28 動物の特定の mtDNA 領域での酸化プリンの発生率によって評価される酸化的 mtDNA 損傷を減少させました。 これらの調査結果は、最大 28 か月の CR のアンチエイジング効果を裏付けています。 逆に、CR-28 ラットでは、LonP1、Cyt c、OGG1、および APE1 のタンパク質量と 4.8 Kb の mtDNA 欠失内容は影響を受けませんでした。 AL-32 値と CR-32 値の間に有意差がないことは、この年齢での CRefficacy の年齢に関連した境界を示唆しています。ピューリタンズ ビタミンCただし、これは、一般化された老化の減少と関連するミトコンドリアの関与に対抗するCRの利点を部分的に削減するだけです.
キーワード:ラット肝臓; エージング; カロリー制限; ミトコンドリア生合成; mtDNA損傷; CRの年齢に敏感な有効性
1.はじめに
老化のプロセスを調査する研究の印象的な進歩によると、プロセスのいくつかの異なる定義が連続して構成されており、一連の経路とメディエーターが老化のいわゆる特徴として特定されています [1,2]。 これらの中で、ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、およびミトコンドリアの分子損傷が重要な要因として浮上しています。 老化の重要な特徴は組織特異性であり、ミトコンドリアの関与 [3,4]、エピジェネティックな変化 [5]、およびテロメアの長さなどの他の変化 [6] で強調されています。 加齢に伴う変化の開始を予防または遅らせることを目的としたさまざまな治療法の中で、カロリー制限 (CR) は提案された最も古い戦略であり [7]、この介入によってもたらされる非常に多くの有益な効果のゴールド スタンダードを今でも表しています。 実際、CR によって誘発される分子メカニズムに関する最近の研究では、いくつかの経路がこの栄養介入によってプラスの影響を受けることが示されています [8-10]。シスタンチェさらに、これらの調査結果は、栄養や医薬品の介入、生活習慣などの環境相互作用によって調節できる老化の「可塑性」の存在を強く支持しています[5、9、11、12]。 CR は、いくつかのラット組織におけるミトコンドリアの生合成と代謝の加齢に伴う変化を、組織特異的な効果で打ち消すことがすでに示されています [3,13,14]。 より具体的には、ミトコンドリアレベルでの老化によって深く影響を受けるラット肝臓に関する私たちのグループによる以前の研究では、オルガネラマーカーを調べると、ミトコンドリアの加齢に伴う変化に対するCRのプラスの効果が示されました。 実際、CR 処理した 28- か月齢のラットでは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) の含有量、ミトコンドリアの生合成に関与するタンパク質の量、または ROS 感受性のタンパク質の量、およびミトコンドリア転写因子 A (TFAM) 結合の程度が明らかになりました。特定の mtDNA 領域で、年齢が一致した不断給餌 (AL) 対応動物の値と有意に異なる値を示し、より若い 18- か月齢の AL 給餌動物の値と統計的に異ならない [15]。 最近では、ミトコンドリア生合成と AL 老齢 (28- か月齢) および超高齢 (32- か月齢) ラットの肝臓における mtDNA 損傷の分析により、さまざまな研究が可能になりました。ミトコンドリアのパラメーターの違いを示し、ミトコンドリアの関与に関連して老化のペースが異なることを示唆している[16,17]。 これらの前提により、ラット肝臓のさまざまな年齢でのミトコンドリアマーカーの大規模なセットに対するCRの有効性を評価することを目的としました。 これらの目的のために、我々は非常に寿命の長い雑種系統Fischer 344×Brown Norwayからの動物を使用し、そこから18-月齢の任意給餌ラット(AL-18)を対照として選択した。自由に餌を与えられた、老齢 (AL-28) および極度に老齢 (AL-32) な動物と、CR で処理された年齢が一致した同等の動物 (CR-28 および CR{ {39}})。 これらのラットのグループで、以下を評価しました: ミトコンドリア酵素クエン酸シンターゼの活性、TFAM、Lon プロテアーゼ (LonP1) およびシトクロム c(Cyt c)、mtDNA 修復酵素 8- を含む一連のタンパク質の発現オキソ DNA グリコシラーゼ/アプリンまたはアピリミジン (AP) リアーゼ (OGG1) およびアプリン / アピリミジンエンドヌクレアーゼ 1 (APE1)、およびミトコンドリアダイナミクスタンパク質ミトフシン 2 (MFN2) およびダイナミン関連タンパク質 1 (DRP1)。 最後に、特定の領域のmtDNA含有量と酸化的損傷も決定されました。
2. 結果
2.1.ミトコンドリア機能のマーカーに対する年齢と CR 効果の推定
ミトコンドリア質量のマーカーでもあるクエン酸シンターゼ活性は、加齢と CR に対するミトコンドリア機能の感受性を評価するために、ラットの 5 つのグループすべてで測定されました (図 1)。
AL-28（-41パーセント）およびAL-32（-40パーセント）ラットでは、AL{{ 5}}年齢管理。 AL-28 群と AL-32 群の間に統計的に有意な差は見られませんでした。 CR 効果は、同年齢の AL-28 ラットの値と比較して、CR-28 ラットの酵素活性が有意に高い (プラス 40%) ことによって実証されました。 さらに、CR-28 活性は、若い AL-18 コントロール ラットで観察されたものと同様でした (図 1)。 この効果は代わりに、CR-32 動物では鈍化しました。 実際、生後 32 か月の時点では、AL グループと CR グループの間に統計的な差は見られませんでした。
シスタンケはアンチエイジングできます
ミトコンドリア機能に対する年齢と CR の影響の分析を深めるために、TFAM と LonP1 のタンパク質量を、すべてのラット群から分離したミトコンドリアで、ミトコンドリア外膜 VDAC のタンパク質を内部ローディング制御 (図 2)。
図 2. AL-18、AL-28、CR-28、AL-32、および CR-32- 月から分離された肝臓ミトコンドリア中の TFAM および LonP1 タンパク質の量-古いネズミ。 (A). 異なるラット群から単離された肝臓ミトコンドリア中のTFAMタンパク質量。 挿入図では、代表的なウエスタンブロットが、アッセイされた各グループからの1匹のラットで行われました。 上から下への免疫反応性バンドは、それぞれTFAMおよびVDACからのシグナルを表します。 ヒストグラムは、VDAC の強度に正規化された TFAM のバンドの強度の定量化を示しています。(B).異なるラット グループから分離された肝臓ミトコンドリアの LonP1 タンパク質量。 挿入図では、代表的なウエスタンブロットが、アッセイされた各グループからの1匹のラットで行われました。 上から下へ、免疫反応性バンドは、それぞれ LonP1 と VDAC からのシグナルを表します。シスタンケとはヒストグラムは、VDAC の強度に正規化された LonP1 のバンドの強度の定量化を示しています。(A、B)データは、3 通のウエスタンブロット実験の結果を表し、一方向 ANOVA テストと Tukey の多重比較テストを使用して分析されました。 . バーは、5 つの実験グループの平均値と SD を表します。 データは AL-18 ラットの値に対して正規化され、1.*p として固定されました<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">
ミトコンドリア内因性アポトーシス経路の開始である別のミトコンドリア代謝機能に対する老化と CR の影響を評価するために、ウエスタンブロット実験によって Cyt c のミトコンドリア内量を決定しました (図 3)。
図 3. AL-18、AL-28、CR-28、AL-32、および CR-32- 月から分離された肝臓ミトコンドリア中の Cyt c タンパク質の量古いネズミ。 挿入図では、代表的なウエスタンブロットが、アッセイされた各グループからの1匹のラットで行われました。 上から下へ、免疫反応性バンドは、それぞれ Cyt c および VDAC からのシグナルを表します。 ヒストグラムは、VDAC の強度に対して正規化された Cyt c のバンドの強度の定量化を示しています。 すべてのデータは、3 回のウエスタンブロット実験の結果を表し、一方向 ANOVA 検定とテューキーの多重比較検定を使用して分析されました。 バーは、5 つの実験グループの平均値と SD を表します。 データは AL-18 ラットの値に対して正規化され、1 として固定されました。* p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">アンチエイジング年齢をマッチさせた AL 群と CR 群の間で 28 か月と 32 か月の時点で Cyt c タンパク質の量に有意差がなかったため、CR 効果はまったく関係がありませんでした。 2 つのグループにおける Cyt c 量の年齢に関連した減少は、AL-28 および AL-32 グループで観察されたものと同様の傾向を示し、CR-28 動物でより関連性のある減少が見られました。古い CR-32 ラットでは部分的に阻止されました。
2.2.mtDNA修復酵素に対する年齢とCRの影響の評価
加齢は主に mtDNA への損傷の蓄積と関連していることが示されているため、我々はウエスタンブロット実験によって、単離された肝臓ミトコンドリアで 2 つの主要な mtDNA 修復酵素、すなわち 8- オキソ DNA グリコシラーゼ/アプリン酸の発現を測定しました。または apyrimidinic(AP)lyase (OGG1) および apurinic/apyrimidinic endonuclease 1(APE1) は、一般的な mtDNA 修復メカニズムである塩基除去修復 (BER) に関与しています (図 4)。
図 4. AL-18、AL-28、CR-28、AL-32、および CR-32- 月から分離された肝臓ミトコンドリア中の OGG1 および APEl タンパク質の量-古いネズミ。 (A).挿入図では、代表的な西部のしみは、アッセイされた各グループから 1 匹のラットで実施されました。 上から下への免疫反応バンドは、それぞれＯＧＧ１およびＶＤＡＣからのシグナルを表す。 ヒストグラムは、VDAC の強度に正規化された OGG1 のバンドの強度の定量化を示しています。シスタンチェ・ベネフィシオ上から下へ、免疫反応性バンドは、それぞれ APE1 と VDAC からのシグナルを表します。 ヒストグラムは、VDAC の強度に対して正規化された APE1 のバンドの強度の定量化を示しています。 (A、B)データは、3 通のウエスタンブロット実験の結果を表し、一元配置分散分析テストとテューキーの多重比較テストを使用して分析されました。 バーは、5 つの実験グループの平均値と SD を表します。 データは、1 として固定された AL-18 ラットの値に対して正規化されました。n: 分析された動物の数。
両方の酵素のミトコンドリア内タンパク質量は、年齢および CR 効果と同様の傾向を示しました。 特に、OGG1 と APE1 は、AL グループと CR グループの両方で統計的に有意な年齢関連の変化を示さず、年齢の影響がまったくないことを示唆しています。 予想外なことに、CR-28 グループでは、同年齢の AL 動物と比較して、また 32- 月齢のグループ間でも、CR は OGG1 および APE1 の量に有意な影響を誘発しませんでした。
2.3. ミトコンドリアのダイナミクスに対する年齢と CR の影響の評価
融合 (MFN2) および分裂 (DRP1) に関与するタンパク質の発現に対する著しい年齢の影響を以前に報告しており [16]、ここでは、これらのマーカーに対する CR の長期にわたる影響を評価しました。 したがって、MFN2 と DRP1 のタンパク質量は、すべてのラット グループ (図 5) から分離された肝臓のミトコンドリアで、ウエスタンブロット実験によって決定されました。
図 5.AL-18、AL-28、CR-28、AL-32、および CR-32- 月から分離された肝臓ミトコンドリア中の MFN2 および DRP1 タンパク質の量-古いネズミ。 (A).挿入図では、代表的な西部のしみは、アッセイされた各グループから 1 匹のラットで実施されました。 上から下へ、免疫反応性バンドは、それぞれ MFN2 と VDAC からのシグナルを表します。 ヒストグラムは、VDAC の強度に対して正規化された MFN2 のバンドの強度の定量化を示しています (B)。 挿入図では、代表的なウエスタンブロットが、アッセイされた各グループからの1匹のラットで行われました。 上から下への免疫反応性バンドは、それぞれDRP1およびVDACからのシグナルを表します。 ヒストグラムは、VDAC の強度に正規化された DRP1 のバンドの強度の定量化を示しています。(A、B)データは、3 通のウエスタンブロット実験の結果を表し、一方向 ANOVA テストと Tukey の多重比較テストを使用して分析されました。 バーは、5 つの実験グループの平均値と SD を表します。 データは AL-18 ラットの値に対して正規化され、1 に固定されました。*p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">
AL-18 コントロールと比較して、AL-28 ラットの MFN2 では統計的に有意な加齢に伴う減少 (-43 パーセント) が見られました。 このような減少は、Cyt c について報告されたものと同様に、複雑な年齢効果を示す AL-32 ラットで防止されました。 しかし、Cyt c とは異なり、CR は 28- 月齢の動物に非常に良い影響を与え、CR-28 ラットでは加齢に伴う AL-28 動物の減少を防ぎ、年齢が一致した AL と比較して、MFN2 が大幅に増加 (プラス 52%) しました。 さらに、CR-28 ラットの MFN2 量は AL-18 コントロールの値と変わらず、加齢に伴う影響の効果的な予防を示しています。 AL-32 グループと CR-32 グループの間に有意差は見られず、最年長の動物では CR の効果が限定的であることを示しています。 さらに、AL-18 グループと比較して、AL-32 グループの MFN2 には年齢に関連した影響は見られませんでした。 同様に、DRP1タンパク質の量は、{{29}でCRによって防止されたAL-18グループと比較して、AL-28ラットで加齢に伴う顕著な減少(-49パーセント)を示しました。 }}月齢の動物。 実際、CR-28 グループは、AL-28 グループと比較して正の差 (プラス 50%) を示し、強力な CR 効果を示しています。 ただし、DRP1 タンパク質の量に関して、AL-32 と CR-32 の間に差がないことは、長期老化における CR の有効性が限られていることをさらに示しています。 繰り返しますが、AL-18 グループから AL-32 グループに移行する DRP1 の量についても明らかな年齢効果はありませんでした。 次に、検査した各ラットの融合指数 (FI) の値を MFN2/DRP1 の比率として決定しました (図 6)。
AL{{0}} グループの FI 値は、1.37 から 2.64 の狭い範囲をカバーしていましたが、AL-28 グループでは、すべての値が 2.20 から 8.24 の範囲でより高くなりました。 . CR{{10}} グループの FI 値は 0.99 から 5.14 の範囲であり、AL-18 ラットの値と非常に類似していました。 AL-32 動物では、FI 値は 0.70 から 2.27 の範囲であり、AL-18 グループと同様の間隔をカバーしており、顕著な年齢効果がないことを示唆しています。 CR-32 グループでは、FI 値は 0.87 から 2.02 の範囲であり、AL-32 動物の値に匹敵するものであったため、長期老化 (32 か月) は CR に対する感度が低い可能性があるという考えを裏付けています。老化（28か月）よりも。
すべてのグループの FI 値の統計分析を図 7 に示します。AL-18 グループと AL-28 グループの比較では、後者の FI 値が高いほど、ダイナミックバランス。 CR 治療ラットに関しては、CR-28 グループの値は AL-18 対応ラットの値と変わらず、同年齢の AL 飼育対応ラットと比較して食事の有効性を裏付けました。 . FI の AL-32 値と CR-32 値を分析すると、それらの間に有意差がないことが明らかであり、自然に長期老化に達する動物の食事の有効性が低下しているという考えが補強されました。 さらに、両方の 32- 月齢のグループの FI 値は AL-18 の対応するグループと変わらず、最年長の動物に顕著な年齢の影響がないことを裏付けています。
この記事は Int. Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 2021年22月1665日
