ネオヘスペリジンのアンチエイジングの可能性とその相乗効果パート2
May 27, 2022
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ネオヘスペリジンのインビトロ抗酸化活性は比較的弱かった
インビトロ抗酸化能を測定するために多くの方法が利用可能であり、ほとんどの研究者は、各方法が化合物の異なる抗酸化特性を測定するので、1つ以上のアッセイを適用する[32]。この研究では、DPPH、ABTS、およびFRAPアッセイを含む3つの方法を使用して抗酸化能を決定しました。抗酸化効力複合指数(APCI)は、試験された化合物およびそれらの組み合わせの全体的なインビトロ抗酸化能を記述および評価するために定義された。3つのアッセイの線形回帰式を表1に列挙する。そして、すべての関連データを表2に提示した。一方、APCIを図4Bにプロットした。これらの結果から、ネオヘスペリジンがインビトロ抗酸化能が比較的弱いことが分かった。これは、ネオヘスペリジンのCLS伸長機能が、そのインビトロ抗酸化活性に依存しないことを示唆した。しかしながら、比較的高いインビトロ抗酸化活性を有するCD BCDは、酵母BY4742のCLSを延長した。全体として、化合物のCLS拡張能力は、その抗酸化活性のみに基づいて予測することはできません。
A:ナリンギン、B:ヘスペリジン、C:ヘスペレチン、D:ネオヘスペリジン、A、B、Cand Dis luMの濃度。APCI=>(各サンプル値/そのメソッド内の最大のサンプル値)/メソッドの数。データはSEM(n = 9)±平均として表され、p< 0.05="" by="" graphpad="" prism="" 7.00.="" different="" letters="" (a,="" b,="" c,="" d,="" e,="" f,g,="" h,="" i,="" j,="" k)="" after="" data="" indicate="" values="" in="" the="" same="" column="" with="" significant="">
2.5.ネオヘスペリジンは酵母BY4742の細胞外酸性化の変動を遅らせることができなかった
重要なパラメータには、増殖培地の組成およびpH値が含まれる。増殖培地の組成とpH値は、S.cerevisiaeのCLSに大きな影響を与えることが示されている[33]。出芽酵母のCLSに対するpHの影響は以前の研究によって調査され、その結果は酵母における成長シグナル伝達経路および酸化ストレスの誘導に関連する酢酸毒性のメカニズムを指摘している[34]。酵母培養物の細胞外酸性化の変動に対する4つのフラボノイド化合物の影響を知るために、我々はpHメーターを用いて5分ごとにpH値を検出した。シスタンシェエキス抗放射線図5,10uMナリンギンでは、異なる老化状態での出芽酵母BY4742の細胞外酸性化の変動を明らかに遅くしたが、他の3つのフラボノイド化合物は対照群と比較して同じ濃度で有意に影響を及ぼさなかった。
図5.出芽酵母BY4742を10μMで4種類のフラボノイド化合物により処理した後の培養液の変動。実験は少なくとも3連で行った。∶ ナリンギン、B:ヘスペリジン、C:ヘスペレチン、D:ネオヘスペリジン。
3. ディスカッション
これまでの研究では、ネオヘスペリジンが神経保護作用[15]、ROS消去および抗炎症作用[35]、ミトコンドリア膜電位の低下の減弱、H2O2によって誘発されるカスパーゼ-3活性の増加[16]、および細胞アポトーシス誘導活性[21]など、様々な抗老化関連機能を示すことが報告されていた。これらすべての機能は、ネオヘスペリジンがここで出芽酵母BY4742のCLSを増加させたという結果のための良好な基礎を築いた。ネオヘスペリジンが試験した最低濃度でのみCLSを有意に延長したことは驚くべきことである。Crakerらの報告はまた、オーキシン(10-6IAA)のより低い濃度がプロトン押出を促進することを示した。高濃度のオーキシン(10-4IAA)下でのプロトン押出成形は、オーキシン誘導エチレンによって阻害される[36]。シスタンチェハーブネオヘスペリジンのROS消去活性は、我々の研究で検証された。ネオヘスペリジンのインビトロ抗酸化能力は比較的弱く、ネオヘスペリジンのCLS延長機能がインビトロ抗酸化活性に依存しなかった理由を説明した。しかしながら、CDとBCDの組み合わせは、高いインビトロ抗酸化活性を有し、酵母のCLSを増加させた(図3B)。ROSと抗酸化活性の弱い相関関係は、抗酸化活性を分析するために使用した方法によって引き起こされる可能性があります。抗酸化活性法は、フラヨノイドのC環上のC2-C3の二重結合および/またはC3のヒドロキシル基と反応することを試みた。Areiasらの結果は、フラボノイドの高い抗酸化活性は、C2-C3の二重結合および/またはC3のC3のヒドロキシル基の存在と相関せず、むしろ膜と疎水性に相互作用する活性酸素種の産生を阻害する能力に依存する可能性があることを強く示唆した[37]。同時に、多くの研究は、いくつかの抗酸化物質が寿命を延ばす機能を有することを示しているが、それらの特定の作用機序は複雑である。いくつかの抗酸化物質のみが、直接フリーラジカルおよびROSクリアランスに関連する抗老化効果を示すことが示されている。しかし、モデル生物に対する他の抗酸化物質の寿命延長効果は、直接的な抗酸化機能に限定されず、ストレス関連遺伝子発現の調節および毒性刺激効果の誘導も含まれていた[38]。したがって、酵母のCLSをその抗酸化活性に基づいて拡張する物質の能力を予測することは不可能である。他の系統では結果をテストしませんでしたが、他の研究者や科学者が他の系統やモデル生物で結果を検証するための情報を提供しました。
シスタンチェはアンチエイジングすることができます
多くの細胞プロセスと外因性因子は、中程度の酸性化や酸化ストレスを含む酵母の時系列的寿命に悪影響を及ぼします[39]。2%のグルコース(デキストロース)を含む培地で増殖した酵母細胞で起こる初期の変化の1つは、酢酸の産生と培地の酸性化であり、これは経時的な老化に影響を与えることが示されている[38]。培地をpH6-7に緩衝すると酸性化が防止され、時系列寿命が延びる[10,39-41]。さらに、酢酸は、その潜在的な毒性にもかかわらず、サッカロミセス・セレビシエによって成長および代謝のために利用され得る[42]。10uMネオヘスペリジン、ヘスペリジン、およびヘスペレチンは、対照と比較した場合に細胞外pH値の変動傾向を維持した(図5)。しかし、10uMナリンギンは明らかに細胞外酸性化の変動を遅らせた(図5)。この濃度で、ネオヘスペリジンで処理した酵母BY4742のCLSは、ヘスペリジンおよびヘスペレチンが対照群とほぼ同じであった。
ROSスカベンジの増加は酵母のCLSに顕著な影響を及ぼしますが、その理由は未解決の問題のままです[33]。老化および関連する疾患は、細胞巨大分子に対するフリーラジカル媒介性損傷および内因性抗酸化防御機構を相殺する能力の欠如の結果である[43]。しかし、データは、ROSがストレス応答遺伝子(ホルミシス)の誘導において積極的な役割を果たすことができることを示している[43-46]。
さらに、最近の知見は、ROSの種類とそれらが発生する時間もS.cerevisiae [47-49]の寿命延長に重要であることを示唆しており、酵母の老化におけるROSの複雑な役割を示しています。Grazianoら[47]は、ネオヘスペリジンがヒトケラチノサイトにおけるROS生成を減少させたことを報告した。シスタンチェ陰茎の成長野原らは最近、ノビレチン(柑橘類のフラボノイドの1つ)が骨格筋のミトコンドリア呼吸を強化し、代謝の課題に対して健康的な老化を促進することを明らかにした。ROS産生は、用量依存的にノビレチン処理によって有意に抑制された[50]。図3Bおよび4Aは、DおよびCDが酵母BY4742のCLSを増加させ、細胞内ROS含量を減少させたことを示した。しかし、ABDおよびBCDについては、細胞内ROSを増加させながらCLSを延長した。この結果は、呉の51]と一致した。したがって、化合物のROS消去活性と寿命に対するそれらの影響との間には、特定の正または負の関係はなく、これは酵母の老化におけるROSの複雑な役割とも一致していた。
図3Aにおいて、異なる化合物およびそれらの組み合わせの治療下での酵母BY4742の生存率は、2日目から20日目まで徐々に低下しなかった。彼らは二重のピークを提示します。これは、Wu et al. (2014)の結果にも見られる。最初の数日間、生存率は比較的高かった。これは、この間の十分な栄養素と低い生存圧によって説明することができます。時間が経つにつれて、栄養が少なくなるにつれて、谷のポイントは非常に短い時間のために現れました。すると、再びピークが現れました。この現象は、生存圧力を緩和した別の栄養素の代謝に成功を帰するかもしれない。
Quiet al. [36] は、抗酸化混合物/化合物の組み合わせの抗酸化活性が単一の化合物よりも効果的であると報告した。我々の実験では、AB、AC、CD、ABC、BCDの組み合わせは、それらに対応する単一の物質よりも強い抗酸化能を有していた。シスタンチェサルサの利点我々の観察に基づいて、混合物中に存在するフラボノイドは相互作用する可能性があり、それらの相互作用は溶液の総抗酸化能力に影響を与える可能性があると結論付けることができる(図4B)。我々は、4つのフラボノイド相互作用が抗酸化力に対する相乗的または拮抗的な効果を引き起こすことを実証したが、これらの相互作用に関与するメカニズムをよりよく理解するために、より詳細な研究を必要とする他のフラボノイドの組み合わせがある。Lutchman et al. [52] は、酵母のCLSを増加させる植物抽出物を報告していた。そして、TORC1シグナル伝達の減少によって促進されるオートファジーは、長いCLSにとって極めて重要である[10]。これらの研究を参照することにより、将来の研究において化合物がその効果を実行する方法を探ることができます。
4. 材料と方法
4.1.素材
野生株S. cerevisiae BY4742(ATCC(8),201389TM)(Mata his3A1 leu2△0 lys2A0 ura3A0)をAmerican Type Culture Collection(米国バージニア州マナサス)から入手した。酵母基準株の培養物を10uLに小分けし、-80°Cで保存した。 すべてのL-アミノ酸、酵母窒素塩基含有アミノ酸(YNB)、硫酸アンモニウム、ペプトン、寒天および酵母エキス、H2DCFDA、2,4,6-トリピリジル-s-トリアジン(TPTZ)、2,2'-およびビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル(DPPH)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ネオヘスペリジン、ナリンギン、ヘスペリジン、およびヘスペレチンは、シグマアルドリッチ(中国、上海)から購入しました。YPDBroth、YPD、およびその他の化学物質は、Solebo Biotech Co., Ltd.(中国、北京)からのものでした。平底を有する96ウェルポリスチレンマイクロプレートは、コーニング社(ケネバンク、ME、米国)から購入した。
4.2.寿命と酵母細胞グロゾスアッセイ
酵母の時系列寿命(CLS)の決定は、Wu et al. [25] の方法に従って、以下のように中程度の改変を行った。要するに、酵母細胞は、凍結ストックからYPD寒天(0.5%酵母エキス/1%ペプトン/2%デキストロース/1.4%寒天)プレート上にストリーク株を移すことによって調製された。細胞を30°Cで2日間インキュベートした後、単一コロニーをピックアップし、10mL滅菌遠沈管(丸底)内の1.0mL YPD液体培地(1%酵母エキス/2%ペプトン/2%デキストロース)に接種し、午後200時にフラットインキュベーター内で30°Cで2日間培養した。2日間のYPD培養物をオートクレーブ処理した18QmミリQグレードの水(1:10)で希釈し、4°Cの冷蔵庫で2日間保存した。4°Cで2日間インキュベートした後、希釈培養物の5 μL(≈1×10*細胞)を993マイクロリットルの合成定義(SD)培地(補足表S1、[51])に移し、実験全体を通して30°C、200rpmに維持した。数濃度(2.0 μL)のDMSO中の化合物を、初期接種(0時間)時に添加した。各実験は、少なくとも3連で行った。細胞培養物を、実験を通して老化培地を交換することなく30°Cでインキュベートした。老化培地での2日間の培養後、細胞は固定期に達し、その後、最初の老化点を採取した。その後の年齢ポイントは2〜4日ごとに採取した。各年齢点について、混合培養液の5.0 μLを96ウェル平底マイクロプレートの各ウェルにピペッティングした。次いで、95マイクロリットルのYPD培地を各ウェルに添加した。細胞集団をマイクロプレートリーダー(Varioskan Flash;サーモサイエンティフィック、ウォルサムマサチューセッツ州、米国)は、24時間、10分ごとにOD660を記録することによって。
生存率は以下のようにして算出された[25]。ここで、tOD=0.3,2day は、2 日目の年齢ポイントの OD 値が、外生曲線で 0.3 に達する時間です。初期年齢点(2日目)は100%生存率と定義され、連続する各年齢点の相対生存率は次のように計算できます。
各ウェルの生存積分(Sl)は、生存曲線(AUC)の下の面積として定義され、次の式で推定できます。
ここで、day は、days2,4,6,8,10,12,14,16,18and20 などの年齢ポイントです。
4.3 細胞内ROS消去能力アッセイ
4つの化合物の有無にかかわらず標準的なSD培地中で増殖させた酵母細胞の細胞内活性酸素種(ROS)レベルを定量するために、Wu et al. [51]に記載の方法が参照されていた。すなわち、DMSO中の新鮮な5mMストック溶液から2μL ROSプローブH2DCFDAを、30°Cで1時間(2日目)した1.0mL酵母老化培養物に添加した。次いで、培養物を滅菌蒸留水で2回洗浄し、1.0mLの50mMトリス/Cl緩衝液(pH7.5)に懸濁した。20マイクロリットルのクロロホルムと10μLの0.1%(w/o)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え、細胞を200rpmで30分間インキュベートして色素を拡散させた。培養物を5000rpmで5分間遠心分離し、上清の蛍光をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、480nmで励起し、520nmで発光させた。
4.4.抗酸化活性アッセイ
この研究では、DPPH、FRAP、およびABTSアッセイをインビトロ抗酸化能評価に使用した。DPPHアッセイは、Barreca et al.[53]によって記載された方法に従って実施された。各試料のアリコート(0.5mL)を75uM(3.5mL)のDPPHinメタノールと混合し、最終容量4.0mLに光なしで30分間反応させた後、混合物の吸収を波長517nmで検出した。ラジカル消去活性の阻害割合をDPPH値とした。FRAPアッセイは、Hungerら[54]に従って、いくつかの改変を加えて実施した。試料の0.2mLアリコートを3.8mLのFRAP試薬と混合した(0.3mol/L酢酸緩衝液(pH3.6)、10mmol/L TPTZ溶液、および20mmol/L塩化第二鉄(FeCl3)を混合した(10:1:1、容量比))。30分後、波長593nmの吸光度が検出された。そしてABTSアッセイは、Mnbら[55]の方法をほとんど改変することなく従った。ABTSラジカルカチオン(ABTS・+)は、12~16時間無光条件下で、176μLの過硫酸カリウム溶液(140mM)と10mLのABTS水溶液(7mM)の反応により生成した。その後、734nmにおける吸収値0.7±0.02単位となるようにメタノールで希釈した。0.1 mLサンプルを4.9 mL ABTS試薬に添加した。cistanche tubulosa dosage reddit10分反応後の波長734nmにおける吸光度を測定した。全ての吸光度値は、UV-VIS分光光度計(パーキンエルマー社製ラムダ25 UV/VIS、マサチューセッツ州ウォルサム、米国)を用いて測定し、抗酸化値を検量曲線法により計算し、トロロックス当量(TE mg/g DW)として表した。
4.5. 細胞外pH検出
初期段階における酵母の培養過程は、「寿命と酵母細胞増殖アッセイ」の項で説明した方法とほぼ同じであった。具体的な操作は以下の通りであった。酵母菌体を、凍結ストックからYPD寒天プレート上に酵母株を移すことによって調製した。細胞を30°Cで2日間インキュベートした後、単一のコロニーをピックアップし、10mL滅菌遠沈管内の1.0mL YPD液体培地に接種し、午後200時にフラットインキュベーター内で30°Cで2日間培養した。2日間のYPD培養液をオートクレーブ処理した18mΩミリQgrade水(1∶10)で希釈し、4°Cの冷蔵庫に2日間保存した。4°Cで2日間インキュベートした後、希釈培養液の10 μL(~2×104 cells)を1986 μLのSD培地に移し、30°C、200rpmで2/10/20日間維持した。DMSO(4.0 μL)中の種々の化合物を、初期接種(0時間)時に終濃度10 μMとなるように培地に添加した。次いで1mLの2/10/20日目のSD培養物を19mLの新鮮なYPD液体培地に添加した。pHは、酵母を200rpmのシェーカーで30°CCで培養し、全体の検出のためにpHメーターを使用して5分ごとに試験した。各実験は、少なくとも3連で行った。
4.6.データ解析
マイクロプレートリーダーからの生データは、Microsoft Excel 2007(米国ワシントン州レドモンド)にエクスポートされました。増殖曲線から、酵母の生存率は、以前の報告[25]に従って得ることができる。各加齢培養物の生存積分[56]を生存曲線下面積[25,57]として定義した。データは一元配置分散分析(一元配置分散分析)によって分析され、平均値±平均の標準誤差(SEM)として表した。差異の意義(* p<><0.01;***><0.001;*><0.0001) was="" determined="" using="" sidak's="" multiple="" comparisons="" test.="" graphpad="" prism="" 7(graphpad="" software,="" inc.,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)was="" used="" for="" the="">
5. まとめ
結論として、ネオヘスペリジンは、細胞内ROSを除去するための比較的高い能力を有し、出芽酵母BY4742のCLSをヘスペレチンと個々にまたは相乗的に延長することに大きな可能性を示した。これは、酵母のCLS伸長と試験された指標(例えば、ROS消去能、インビトロ抗酸化活性、および細胞外pH)との間に限られた関係があったため、老化問題の治療のための新しい選択肢につながる可能性がある。この現象の分子メカニズムを発見するためのさらなる研究は、老化を防ぐために非常に有益であろう。このため、新しい栄養補助食品や機能性食品を設計する際には、フラボノイドの最良の組み合わせを選択することの重要性を念頭に置く必要があります。
この記事はMolecules 2019, 24, 4093から抜粋したものです。DOI:10.3390/分子24224093 www.mdpi.com/journal/molecules