細胞膜修復タンパク質がどのように転写因子シグナル伝達を調節して腎線維化を制御するか
Mar 15, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
ハイチャン・リー
肝臓線維症は急性の進行に関連しています肝臓慢性腎臓病への傷害。 細胞膜修復タンパク質であるMG53は、腎臓上皮細胞の損傷および急性腎損傷から保護することが示されています。 ここでは、の変調におけるMG53の役割を評価しました肝臓老化したマウスおよび片側性尿管閉塞（UUO）のマウスにおける線維症は、進行性腎線維症の既知のモデルです。 MG53を切除したマウスは、同じ年齢のMG53-無傷のマウスよりも年齢とともにより多くの間質性線維症を発症しました。 同様に、MG53がない場合、肝臓線維症は、反対側の閉塞していない腎臓または偽手術したマウスの腎臓と比較して、閉塞した腎臓に無傷のMG53を有するマウスと比較して誇張されていた。 尿管閉塞腎臓MG53欠損マウスからの炎症は、MG53無傷マウスからの尿管閉塞腎臓よりも有意に多くの炎症を示しました。 インビトロ実験は、MG53が近位尿細管上皮細胞の核に入り、転写因子NF-kBのp65成分と直接相互作用する可能性があることを示し、MG53の非存在下での炎症の増強の可能性のある説明を提供します。 これをテストするために、操作された細胞または直接の組換えタンパク質送達による強化されたMG53発現がUUOの対象となるマウスに与えられました。 これにより、NF-kBの活性化と炎症が減少し、腎線維化が減弱しました。 したがって、MG53は慢性腎臓炎症の治療に治療的役割を果たし、それによって線維症それは慢性腎臓病の表現型につながります。
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翻訳ステートメント慢性炎症は、急性腎障害から慢性腎疾患への移行の根底にある可能性のある線維性リモデリングにつながります。 タンパク質炎症性転写因子核因子-kB（NF-kB）の活性化は、腎臓の炎症の病因に関与しています。 ここでは、以前に同定された細胞膜修復タンパク質であるMG53がNF-kBと直接相互作用し、その転写活性を低下させるという証拠を提供します。 付随して、外因的に投与されたMG53は、炎症を起こした腎臓の線維性リモデリングを減少させることができます。 これらの発見は、炎症を介した腎線維化の発症を軽減するためのMG53とNF-kBの間の保護的相互作用を示しています。 MG53の薬理学的投与は、進行性腎線維症の治療のための有望なアプローチである可能性があります。
急性腎障害（AKI）または慢性腎疾患（CKD）に分類できる腎機能障害は、高齢者の流行に発展しています。 2017年、CKDの有病率は65歳以上の人々の14.5％に達し、その結果、治療に840億ドルを超えるメディケア支出が発生しました。1,2AKIとCKDは、主に傷害に対する感受性の増加と老化した腎臓を修復する能力の低下により、高齢者に多く見られます。 臨床研究は、CKDがAKIの主要な危険因子であることを示しており、逆に、AKIのエピソードはCKDの末期腎疾患への進行を加速させる可能性があります。 現在、AKIの治療は主に支持的であり、確立されたCKDの治療は、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の阻害を通じて、そしておそらくナトリウム-グルコース共輸送体-2阻害を通じて進行を遅らせることに焦点を当てています。3,4
損傷の重症度に応じて、急性損傷の主な標的である近位尿細管細胞は、細胞周期の進行の変化5,6代謝、7タンパク質炎症性および線維化促進性サイトカインの分泌、または部分的な上皮-間葉移行8を受ける可能性があります。これは、リモデリング/修復が成功するか不適応であるかを決定し、CKDの特徴である腎線維化を引き起こします。9,10このリモデリングは通常、腎臓の炎症の背景で発生します。
血管供給の減少、および細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の産生。これには、上皮細胞の喪失とコラーゲン、平滑筋アクチン、およびフィブロネクチンの蓄積が含まれます。 また、腎臓機能の低下と高い相関関係があります。
慢性炎症は線維性リモデリングを引き起こし、これもAKIからCKDへの移行の根底にある可能性があります。11–13累積的な研究は、感染、傷害、正規のNF-kB経路の活性化は、NF-kB（IkB）キナーゼの阻害剤の活性化から始まり、IkBaのリン酸化と分解、およびNF-kBヘテロダイマーの核移行を引き起こします。15腎臓上皮細胞および浸潤性免疫細胞におけるNF-kBシグナル伝達の活性化は、リポ多糖（LPS）への曝露や虚血再灌流障害などの病態生理学的トリガーによって誘発される可能性があります16。分子プロファイリング研究により、nfkb1が腎臓線維症の主要なドライバーであることが明らかになりました。17腎臓の尿細管細胞に加えて、マクロファージや樹状細胞などの自然免疫細胞も、腎臓の損傷、炎症、線維性リモデリングに関与しています。13,18–20
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増大する証拠は、筋肉由来の分泌因子（すなわち、マイオカイン）が組織クロストークを介して全身の生理機能を調節し、腎臓病の進行に影響を与えることを示唆しています。21MG53（TRIM72とも呼ばれる）は、細胞膜修復に重要な機能を持つ筋肉強化三者モチーフ（TRIM）タンパク質です22,23。TRIMファミリータンパク質は、免疫シグナル伝達の調節から組織修復に至るまで、さまざまな機能を持っています。24MG 53-を介した膜修復は、骨格筋への急性損傷の軽減に関与しています。25腎臓、26心臓、27 肺、28脳、29,30と肌。31私たちの以前の研究では、AKI保護の重要な要素である腎臓でのMG53発現のレベルが低いことが確認され、MG53（mg53 /）が不足しているマウスはストレス誘発性AKIの影響を受けやすくなりました。26また、最近、循環中のMG53の持続的な上昇が、組織損傷の修復と再生を促進することを示しました32。進行性CKD中の腎線維化の調節における腎臓特異的および外因性循環MG53の相対的な役割はまだ不明です。
最近、炎症の抑制、特にNF-kBシグナル伝達の調節を介した組織保護の調節におけるMG53の新たな役割が進化しました。 たとえば、MG53はTLR4 / NF-kB経路を阻害することでLPS誘発性の神経毒性と神経炎症を軽減し33、心臓のMG53はKChIP2の発現を調節して、心臓肥大時の電気生理学的リモデリングを制御します34。 IRF3 / NF-kB活性化の抑制と、マクロファージにおける異常な細胞内Ca2þシグナル伝達の阻害を介して、過剰なインターフェロンb産生を特徴とする、致死量以下のインフルエンザAウイルス感染時の不適応な過炎症反応の予防35。ウイルス感染、MG53は、ウイルス力価自体に直接影響を与えるのではなく、負の調節を通じてサイトカインストーム（インターフェロン-b、インターロイキン-6、およびインターロイキン-1 b）を軽減することにより、死亡率と肺損傷を予防することが示されました。 NLRP3インフラマソームの感染と肺のピロプトーシスの予防36。さらに、外因性MG53の高用量慢性治療はNF-kBの抑制に関連していた –老化した心臓の炎症を介した37。これらの研究は、MG53が炎症中の異常なNF-kBシグナル伝達を調節できることを示唆していますが、これが腎臓の炎症との関連で起こるかどうかは研究されていません。
MG53はNF-kBの転写活性を調節することにより腎炎症を調節し、そうすることで慢性炎症の結果として発生する腎線維化を軽減できると仮定しました。 この研究は、この仮説に取り組むために行われました。
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方法
動物実験
動物を用いたすべての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドを順守し、オハイオ州立大学の動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従った。 年齢を一致させた野生型（WT）またはmg53-/-129S1 / SvImJ株の非同腹仔を使用して22、年齢依存性および片側性尿管閉塞（UUO）誘発性腎線維症の調節におけるMG53の役割を確立しました。 C57B6 / Jマウス（9〜10週間）はJacksonLabsから購入しました。
腎障害の研究では、マウス（9〜12週間）をUUOに供して、腎線維化を誘発しました。 マウスをイソフルラン（1.5パーセント–2。0パーセント）で麻酔し、深い麻酔面を確保しました。 UUOの手順は、公開されているプロトコルに従って、左尿管を5-0外科用シルクで2回結紮することによって実行されました38。偽のマウスには腹部の皮膚切開しかありませんでした。 閉塞性腎障害に対するrhMG53の効果を評価するために、UUOマウスの1グループにRhMG53（2 mg / kg）を、UUO手術の直後（0日）から7日間、2日間毎日尾静脈注射で投与しました。 9日目と11日目に追加投与。UUOマウスの対照群は、同じスケジュールに従って生理食塩水注射を受けました。 UUO手術後12日目にマウスを殺し、腎臓をリン酸緩衝生理食塩水でその場で灌流し、組織学およびウエスタンブロット分析のためにUUO腎臓および反対側の腎臓から組織サンプルを収集した。
別の研究では、WTとmg53-/-マウスはUUOまたは偽手術を受け、手術後7日目に死亡した。 MG53は、細胞ベースの治療アプローチを使用してマウスに投与されました。39RAW 264.7マクロファージは、ドキシサイクリン（DOX）依存性AdtPA-MG53-チェリーウイルス粒子に24時間感染しました。 感染した細胞（マウスあたり{{1 0}} / 1 0 0 mlの生理食塩水の濃度で）を手術直後（0日目の注射）にマウスに尾静脈注射した。 マウスは、0、1、3、および6日目にAd-tPA-MG53形質導入RAW細胞を4回注射しました。0日目の細胞注射の直後に、マウスをDOXを投与したグループと投与しなかったグループにランダムに分けました（2飲料水に5％スクロース溶液でmg / mlを7日間入れた後、殺しました。 UUO腎臓および対側腎臓からの組織サンプルは、組織学、RNA、およびタンパク質分析のために収集されました。
統計分析データは平均-SDとして表されます。 グループ内の比較は、2つの実験的基礎研究を比較するときにスチューデントのt検定を使用して実行されました。および1-2つ以上のグループの分散分析（Graphpad Prism 8.2; GraphPad）と、それに続くボンフェローニまたはホルム-シダックの多重比較検定のアドホック。 P <>
補足方法組織学的評価、血清クレアチニン測定、プラスミド構築物、細胞培養および一次尿細管上皮細胞単離、アデノウイルス調製および細胞感染、NF kB p65核移行アッセイ、免疫組織化学および共焦点画像、NF-kBルシフェラーゼレポーターアッセイ、サイトカインを含む完全な方法酵素結合免疫吸着アッセイ、組織分画、免疫ブロッティング、共免疫沈降、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（補足表S1）、およびrhMG53産生は補足方法にあります。
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結果
MG53を切除したマウスは、年齢依存性の腎線維化を発症します
mg53の腎機能と線維症に対する加齢の影響を比較しました-/-およびWTマウス。 MG53を使用した場合と使用しない場合の若いマウス（2か月）の血清クレアチニンレベルに有意差はなかったものの、より古い（16〜20か月）mg53であるという以前の観察結果を確認しました。-/-マウスは、年齢を一致させたWTコントロールよりも有意に高い血清クレアチニンを示しました（図1a）。 三色染色に基づいて、mg53が-/-マウスは、WTマウスと比較して腎線維化が多く、5か月齢から始まり、20か月齢まで続きました（図1bおよびc）。 免疫組織化学的染色を使用して、2-月齢および5-月齢のマウス腎臓における白血球、単球、およびマクロファージの浸潤に対するMG53アブレーションの影響を評価しました（図1dおよびe）。 若いWTおよびmg53-/-マウスの腎臓は、同様のレベルの腎内白血球を持っていましたが、5-月齢のマウスのWT腎臓よりもmg53/腎臓で有意に多くの炎症細胞が見つかりました。
さらに、腎臓線維症の領域で一般的に見られる2つの細胞外マトリックスタンパク質である平滑筋アクチンおよびフィブロネクチンの免疫組織化学は、{からの腎臓の糸球体および尿細管間質における増強された（3-から8-倍）染色を示した。 {4}}月齢のmg53-/-マウスと10-月齢のWTマウスの比較（補足図S1）。
UUOは、mg 53- /-マウスで悪化した腎炎症と線維症を誘発します。イムノブロッティングで検出された腎臓MG53レベルは、UUOの7日後に有意に増加しました（図2a）。 mg 53- /-UUO腎臓は、WT UUO腎臓よりも、30％の追加のトリクローム染色領域を伴う、誇張された線維症を示しました（図2b）。
MG53はNF-kBの活性化とp65の核局在化を調節します
NF-kB（p65）の活性は、UUOモデルで評価されました。 総p65（t-p65）の数は、WTおよびmg53 /マウスのUUO腎臓で有意に増加しましたが、p65のリン酸化として評価されたNF-kB活性化は、mg53 / UUOでより大きかった（16-倍）。偽手術動物と比較したWTUUO腎臓よりも腎臓（2-倍）（図3a）。 閉塞した腎臓におけるトランスフォーミング成長因子b1（TGF-b1）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1（PAI -1）、およびI型コラーゲンα1（Col1a1）の相対RNAレベルを分析しました40。 WTおよびmg53/からのUUO腎臓で、偽の動物で低レベルの遺伝子発現と同様の誘導（TGF-b1、w10倍、PAI -1、w40倍、Col1a1、w40倍）が検出されました（図3b）。 通常の条件下での腎皮質におけるMG53の空間分布を調べるために、腎組織画分を分析しました。 抽出された核タンパク質の合計よりも10-倍多い細胞質ゾルタンパク質を定期的に取得しました。 t-p65レベルは、WTマウスとmg 53- /-マウスの細胞質ゾル画分で同等でしたが、mg 53- /-マウスの核画分で大きかった（図3c）。 MG53はサイトゾル画分で検出されました（サイトゾルマーカーとしてチューブリンを使用）。 予期せぬことに、かなりの量のMG53が核画分で検出されました（核画分マーカーとしてヒストンH3を使用）。
この発見を確認するために、骨格筋画分におけるMG53の局在も調べました（補足図S2）。 MG53が細胞質ゾルと筋鞘膜（膜画分のマーカーとしてのナトリウム-カリウムアデノシントリホスファターゼ）に局在するという以前の研究を再現しました22,23,25が、骨格筋から濃縮された核MG53も検出しました。
MG53はp65と相互作用して、腫瘍壊死因子-αによって誘導される転写活性を制御します。組織分画の結果を確認するために、以下の免疫組織化学的研究を実施しました。 培養されたWT近位尿細管上皮細胞では、p65は主に細胞質ゾルに見られましたが、MG53の非存在下では核に局在していました（図4a）。 これらの細胞をLPS（5 mg）で8時間処理した場合、炎症性サイトカインの分泌は、WT細胞よりもmg53 /細胞で有意に大きかった（図4b）。
これらのデータは、MG53がp65と相互作用して炎症性サイトカインの発現を調節する可能性があることを示唆しているため、p65とMG53の間の直接相互作用は、Flag-p65およびHA-MG53で同時トランスフェクトされたHEK293細胞を使用した共免疫沈降アッセイによって評価されました。 弱い相互作用を示しました（図4c）。 GFP-p65およびRFP-MG53プラスミドの同時トランスフェクションと共焦点分析により、p65とMG53の共局在が確認されました（図4d）。 次に、いずれかのpHM6ベクターで一過性にトランスフェクトされた安定したNF-kB / 293- GFP-Luc転写レポーター細胞株からのルシフェラーゼ活性を測定することにより、MG53がTNF刺激後のNF-kB（p65）転写活性に影響を与えるかどうかを定量化しました。またはHA-MG53。 レポーター細胞には、上流のコンセンサスNF-kB転写応答エレメント（kBサイト）の4つのコピーと組み合わせて、最小のサイトメガロウイルスプロモーターによって駆動される形質導入レンチウイルス発現ホタルルシフェラーゼレポーターが含まれています。 TNF-αが存在しない場合、MG53タンパク質を発現するレポーター細胞で検出された固有のルシフェラーゼ活性は非常に低かった。 MG53は、TNF-αによって誘発されるNF-kB（p65）の転写活性を約40％抑制しました（図4e）。
MG53の過剰発現は、TNF-α治療時にNF-kBp65核移行を防止しましたNF-kBp65は、腎臓近位尿細管上皮におけるTNF-a治療時に核に移行しました41。MG53による治療がNF-kBp65核移行を弱めることができるかどうかを調査するTNF-α刺激により、HKC -8細胞でMG53をDOX依存性Ad-tPA-MG53ウイルス形質導入または組換えヒトMG53（rhMG53）での処理により過剰発現させました。 MG 53-特異的モノクローナル抗体を使用して、DOX依存性誘導後にMG53をイムノブロッティングで検出しました。 MG53は、Ad-tPA-MG53で形質導入されたHKC-8細胞に非常に高いレベルで存在していました。
1 ng rhMG53/mg細胞溶解物に相当します。 対照的に、HKC -8は、はるかに少ない量のrhMG53を取り込み、発現しました（図5a）。 HKC -8によるFL蛍光標識rhMG53の取り込みは、共焦点顕微鏡によって確認されました（補足図S3）。 TNF-α処理後、p65活性化がピークに達するまでの時間は15〜30分でした（図5b）。 基本的な条件下では、NF-kB p65は主に細胞質ゾルに存在し、MG53の過剰発現はこれを変化させませんでした（図5cおよびd）。 しかし、TNF-α刺激後、p65はMG53を過剰発現していないHKC-8細胞の核に移行しました。 比較すると、p65の核転座は、MG53を過剰発現している細胞では33％（rhMG53を与えられた細胞）から50％（DOXを与えられた形質導入細胞）に減少しました（図5cおよびd）。
UUOmouseモデルへの操作されたRAW細胞の養子移入は、UUO手術の直後に尾静脈注射によって投与された1 - 106細胞で行われました。 マウスは、通常の飲料水（-DOX）を摂取したグループと、飲料水中のDOX（2 mg / ml）を摂取したグループにランダムに分けられました。 UUOマウスは、RAWを隔日で合計4回注射しました。 腎臓は手術の7日後に収穫されました。
操作されたRAWとそれに続くDOX誘導を注入されたマウスは、細胞を受け取らなかったマウスまたは操作されたRAW細胞を注入されたがDox誘導されなかったマウス（66％の線維化領域;図6aおよびb）と比較して、腎線維症の有意な減少（30％）を示しました。
実験の終わりまでに細網内皮系の監視を生き延びたのは、わずかなRAW/Ad-tPA-MG53集団だけでした。 免疫組織化学染色により、腎臓におけるDOX治療によるRAWを介したMG53の発現が確認されました（図6c）。 興味深いことに、RAW注入マウスとDOX誘発MG53のUUO腎臓は、RAWを投与されなかったマウスまたはDOXなしでRAWを投与されたマウスよりも低いp -65 / t-p65比（約40％）を示しました（図6dおよびe）。 p-p65レベルの低下は、UUO腎臓のp-p65（S536）免疫組織化学染色で確認されました（図6f）。 Raw / Ad-tPA-MG53 /þDOXによって送達される循環MG53と腎臓近位尿細管細胞による取り込みは、p-p65（S536）の減少に関与し、UUO腎炎症を減少させる可能性があると考えています。 UUOのみの腎臓と比較して、TGF-b1、PAI - 1、およびCol1a1の発現は、DOXなし（MG53誘導なし）のRAWを注入したマウスのUUO腎臓で有意に増加しました。 これらの線維化促進遺伝子の上昇は、注入された細胞から免疫担当マウスへの強力な同種移植反応の誘導に起因する可能性があります。 ただし、RAWを注入してDOX（MG53誘導）を与えたマウスのUUO腎臓は、DOX治療を受けていないマウスよりも有意に低い（60％〜72％の減少）PAI -1と比較的低いレベルのTGF-b1およびCol1a1を発現しました（図6g）。
rhMG53の全身投与は、UUOを受けたマウスのNF-kB活性化と線維症の発症を軽減します
rhMG53が前述の人工RAW細胞治療と同様の抗線維化効果を示すかどうかをテストしました。 私たちの以前の薬物動態データは、rhMG53.42の短い循環半減期（げっ歯類で約90分）を示しました。マウスは2〜6 mg/kgの慢性投与に耐えました。
rhMG5326,37であるため、図7aに示す管理戦略が使用されました。 UUOマウスには、手術後最初の7日間は毎日、ビヒクル（生理食塩水）またはrhMG53（2 mg / kg）をランダムに投与し、その後、12日目に殺されるまで1日おきに投与しました。とフィブロネクチンの発現レベル、p-p65レベルは偽の腎臓と比較して反対側の腎臓でわずかに増加しました。 UUO後、腎臓のt-p65が増加しました。 生理食塩水で治療した動物と比較して、rhMG53-で治療した動物のUUO腎臓のp-65 / t-p65比は約37％減少しましたが、IkBaは約27％増加しました（図7bおよびc）。 さらに、フィブロネクチンは約33％減少しました（図7bおよびc）。 免疫組織化学により、治療後にrhMG53がUUO腎臓に存在することが確認されました（図7d）。 総線維症は、rhMG 53-で治療されたUUO腎臓で減少しました（図7e）。 ただし、TGF-b1、PAI -1、およびCol1a1のRNA発現は、生理食塩水またはrhMG53のいずれかで処理されたマウスで類似していた（図7f）。
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討論
MG53は、原形質膜修復機構の主要な構成要素として最初に同定された筋肉に富むTRIMタンパク質です。22,26,42,43しかし、MG53の作用は骨格筋に限定されず、MG53はmyokine.32 MG53が遠隔臓器の組織損傷時の炎症を制御できることを以前に示しました。27,29,33,35–37今回の調査では、MG53-を介した臓器保護の範囲を腎臓にまで拡大しました。 MG53は、炎症誘発性および線維化促進性の転写因子NF-kBのサイトカイン誘導性活性化をブロックすることにより、腎内炎症および腎線維化を軽減できると結論付けています。 この結論は、以下の観察に基づいています：（i）正常なマウスにおけるMG53の遺伝子欠失。
腎線維化の増加と白血球およびマクロファージによる腎臓の浸潤を伴う、老化したマウスとしての腎臓機能の低下をもたらした。 （ii）マウスUUO腎臓損傷モデルでは、MG 53-欠損マウスの閉塞した腎臓は、MG53-補充マウスよりも多くの線維症と炎症を示しました。 （iii）LPS処理近位尿細管上皮細胞によるTNF-αおよびインターロイキン-6産生は、MG53の存在下で減弱しました。 （iv）近位尿細管上皮細胞株におけるMG53による治療または過剰発現は、-kBのp65成分の核移行をブロックすることによりTNFa誘導性NF-kB活性化を減少させました（MG53は弱くはありますがp65に直接結合することがわかりました）。 （v）NF-kBの活性化に必要なステップであるp65のリン酸化は、マクロファージでMG53を過剰発現するように誘導された組換えMG53で処理されたUUOマウスの閉塞した腎臓で減少しました。 さらに、NF-kB活性化の阻害剤であるIkBaは、組換えMG53を注射したUUOマウスの閉塞した腎臓で増加しました。
正常なマウスにおけるMG53の遺伝的欠失は、腎臓に対する加齢の悪影響を許容していました。 これは、内因性MG53の存在が老化中のベースラインレベルの保護を提供することを示唆しています。 同様に、内因性MG53の喪失は、閉塞によるAKIを悪化させました。 UUO腎臓はMG53を蓄積し、骨格筋からの遠隔ミオカイン活動を反映している可能性があります。 損傷中に筋肉MG53がどのように腎臓に動員されるかは不明です。 しかし、損傷した腎臓はしばしば低酸素症を発症し、酸化ストレスを受けます。44,45MG53を募集するのに役立つ可能性のある信号。 もしそうなら、この「筋肉-腎臓-免疫細胞」軸を利用して腎臓の損傷を軽減することができます46。あるいは、腎臓細胞はベースラインで低レベルのMG53を発現します。26そして、急性または慢性の傷害の間に、MG53の生産がアップレギュレーションされる可能性があります。
NF-kBは、腎臓の損傷と老化における炎症と線維症の顕著な転写ドライバーです。14,17,47,48腎臓ホモジネートの核コンパートメントにMG53が存在することから転写干渉の可能性が示唆されたため、MG53の効果がNF-kBを介して媒介されるかどうかを調査するよう促されました。 MG53の核局在化は前例がないわけではありません。 心筋MG53を過剰発現するトランスジェニックモデルでは、核MG53がペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αの発現を転写レベルで調節し、心臓脂質代謝に影響を及ぼしました49。さらに、最近、rhMG53がNF-kB活性化を抑制して加齢性心不全を緩和することを示しました老化した心筋細胞の炎症誘発性サイトカイン、アポトーシス、および酸化ストレスを減らすことによって。37
MG53がp65の核/細胞質動員をどのように調節するかの分子メカニズムは不明なままです。 MG53には核局在化シグナルは含まれていませんが、核外輸送タンパク質exportinによって認識されるモチーフである3つの推定N末端ロイシンに富む核外輸送シグナルが含まれています。50MG53とp65の間の直接的な相互作用は、NF-kBの活性化に対するMG53の唯一または主な破壊的効果として、かなり弱かった。 MG53はNF-kBの重要な成分の動的な核細胞質シャトルに影響を与えるように見えますが、正確なメカニズムはまだ解明されていません。
MG 53-を介した腎保護の重要な結果は、NF-kBを介した炎症の減弱を通じて線維性リモデリングを減少させることであるように思われます。 腎線維症は、さまざまなECMタンパク質の病的沈着を伴う複雑なプロセスです51。MG53は、ECMタンパク質フィブロネクチンに明らかな影響を与えるようでした。 フィブロネクチンは、MG53を欠損したUUO腎臓で増加し、MG53で治療したUUOマウスで減少しました。 MG53の存在下および非存在下での他のECMタンパク質の発現を理解することはより困難です。 我々は以前、rhMG53がTGF-b1 / Smadシグナル伝達を負に調節し、invitro研究でECMタンパク質の合成を抑制することを示しました31。 mg53/欠乏した動物。 これらの転写産物は、ウイルスによって誘発されたマウスの投与によってMG53を過剰発現するように誘発されたUUO動物では減少しました
マクロファージですが、組換えMG53を投与した場合、効果は見られませんでした。 達成された腎内MG53レベルは、組換えMG53とは対照的に、マクロファージベクターを与えられた動物ではるかに大きかったので、これは単に十分な投薬の場合である可能性があります。 さらに、タンパク質レベルは測定されておらず、転写後のイベントがUUOのECMを変更する可能性があります。 特定のECMタンパク質の調節におけるMG53の新たな役割を解明するには、さらなる研究が必要です。 結論として、この研究は、マイオカインが腎臓などの遠隔臓器のベースライン炎症を調節するのに役立つ可能性があり、腎臓損傷の状況では、炎症を軽減および制御するのに役立つ可能性があることを示しています。 図8は、腎保護におけるMG53の役割の作業モデルを示しています。 ダメージ関連分子パターン（TNF-aなどのDAMP）および病原体関連分子パターン（LPSなどのPAMP）の刺激と虚血性ストレスの間、NF-kBシグナロソームは腎臓で活性化されます。 MG53は、NF-kBシグナル伝達のリン酸化と活性化を阻害し、IkBaを安定化し、p65核動員を減少させ、炎症誘発性プログラムの活性化をブロックすることにより、腎臓を保護します。 内因性MG53はこれらの効果を媒介する可能性がありますが、MG53を治療的に使用することで、より強力な保護が得られる可能性があります。これは、外因性MG53がUUOの損傷を軽減する能力に基づいて実現可能です。 このマイオカインが臨床的にどのように利用されるかを理解するために、さらなる調査が必要です。
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開示
JMは、ヒトの疾患の治療のためにrhMG53を開発しているTRIM-edicine、Inc.に出資しています。 MG53の使用に関する特許は、ラトガーズ大学とオハイオ州立大学が保有しています。 他のすべての著者は、競合する利益を宣言しませんでした。
謝辞
この作業は、国立衛生研究所（NIH）R 01- DK106394（JM、BHR、およびP-HL）およびNIH R 01- AG062896（P-HLおよびBHR）によってサポートされていました。 このプロジェクトは、オハイオ州立大学（P-HL）の壁内ロックウッド基金と、国立先進トランスレーショナル科学センター（NCATS; P-HL、賞番号UL1TR002733）からの賞によって部分的にサポートされていました。 内容は著者の責任であり、必ずしもNCATSまたはNIHの公式見解を表すものではありません。
著者の貢献HL、
PD、P-HL、JM、およびBHRは、研究を考案および/または設計しました。 HL、PD、P-HL、ZL、およびXZは、実験を実施し、データを取得し、データ分析を実行しました。 PD、P-HL、およびBHRが結果を解釈しました。 P-HLとBHRは原稿の草稿、改訂、承認を行いました。 すべての作成者は、最終バージョンを読んで承認しました。
補足資料
補足ファイル（PDF）補足方法。
表S1。プライマー配列。 図S1。 mg53-/-マウスは強化されたECMタンパク質沈着を示します。 年齢を一致させた（1 0か月齢）野生型（WT）およびmg 53- /-腎臓組織を40 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI;青、左のパネル）、a-平滑筋アクチン（SMA;緑、2番目のパネル）、フィブロネクチン（赤、3番目のパネル）、およびマージ（右のパネル）。 バー¼25mm。 腎線維化領域の定量化（グループあたりn¼3）。 データは平均-SDとして表示されます。 スチューデントのt検定。 ***P<>
図S2。核と細胞質の間の骨格筋MG53の分布。 野生型（WT）ormg 53- /-マウスに由来する骨格筋を分画し、カスタムメイドの抗MG53抗体（3 mgライセート）および細胞コンパートメントマーカー（20 mgライセート）で免疫ブロットしました。 ナトリウム-カリウムアデノシントリホスファターゼは細胞膜マーカーとして使用され、ヒストンH3は核マーカーとして使用され、チューブリンは細胞質ゾルマーカーとして使用されます。
図S3。HKC -8腎臓近位尿細管細胞は、AlexaFluor647標識rhMG53を特異的に取り込みます。 rhMG53（Trimedicine）およびウシ血清アルブミン（BSA; ThermoFisher Scientific）は、製造元のプロトコルに従ってAlexa Fluor（AF）抗体標識キット（Life Technologies）で標識されました。 HKC -8細胞は、Delta TPGガラス底皿（Bioptechs Inc.）で、標識タンパク質BSA-AF647（左）の存在下で10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。 ）およびrhMG 53- AF647（右）、24時間。 Zスタック画像はLSM780共焦点顕微鏡（Zeiss）から撮影されました。 画像は皿の底にある細胞を示しています。 バー¼25mm。
図S4。誘導性MG53分泌を媒介するようにRAW細胞を操作する。 （A）RAW細胞をAd-tPA-MG53に24時間感染させ、（ドキシサイクリン[Dox]）なしまたはDox（þDox、1 mg / ml）でさらに24時間処理して、tPA-MG53の発現を誘導しました。 共焦点画像は、マクロファージ様RAW細胞からのMG53発現（カスタムメイドの抗MG53抗体、赤、下のパネル）の誘導を示しました（F4 / 8 0染色、緑、上のパネル）。 バー¼25mm。 （B、C）感染したRAW細胞からのtPA-MG53およびMG53の誘導発現に関する細胞溶解物（0。6、3、および6 mgの量）のウエスタンブロット分析（B）および対応する培養物培地濃縮物（2、5、および1 0 mlの容量）（C）。 さまざまな量のrhMG53（0。2、1、0.05、および0.025 ngの量）が標準としてロードされました。 Mw、分子量マーカー。