概日時計はネズミの腎臓におけるリズミカルなエリスロポエチン発現を調節する
Mar 11, 2022
詳細情報：ali.ma@wecistanche.com
Lina K. Sciesielsk et al
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概日リズムの生成は細胞自律的であり、CLOCK、BMAL1、およびCRY1やCRY2などのリプレッサーを含む概日時計転写因子活性化因子のファミリーによって制御される転写/翻訳フィードバックループに依存しています。 本研究の目的は、概日エリスロポエチン発現の分子メカニズムと造血の意味の両方を調べることでした。 コア概日時計遺伝子クリプトクロム1および2（Cry-null）のホモ接合性欠失を有する変異マウスを使用して、概日エリスロポイエチン調節を解明した。 野生型対照マウスは、肝臓概日時間06と18の間のエリスロポエチンmRNA発現。並行して、エリスロポエチン産生細胞の数が大幅に増加しました。肝臓（RNAscopeによる）および有意に高いレベルの循環エリスロポエチンタンパク質（ELISAによる）が概日時間18で検出されました。このような変化はCry-nullマウスでは廃止され、酸素分圧、酸素飽和度、または低酸素誘導因子2alphaの発現とは無関係でした。その概日エリスロポエチン発現は、CRY1およびCRY2によって転写的に調節されています。 レポーター遺伝子アッセイは、CLOCK/BMAL1ヘテロダイマーが5'エリスロポエチンプロモーターのE-boxエレメントを活性化することを示しました。 RNAscope in situハイブリダイゼーションにより、エリスロポエチン産生細胞にBmal1が存在することが確認されました。肝臓。 Cry-nullマウスでは、赤血球数とヘマトクリット値は変化しなかったものの、網状赤血球数の大幅な減少が見られました。 したがって、正常酸素状態の成体マウスにおける概日エリスロポエチン調節肝臓マスター概日活性化因子CLOCK/BMAL1およびリプレッサーCRY1/CRY2によって転写的に制御されます。 この発見は、腎臓生理学病気、検査室診断、貧血治療。
キーワード：時間生物学; 概日リズム; 時計; クリプトクロム; エリスロポエチン; 造血; 低酸素誘導因子
翻訳ステートメントほぼすべての細胞型の分子時計は、組織特異的因子と協力して遺伝子転写を促進します。 これまでのところ、概日振動メカニズム肝臓エリスロポエチン（Epo）の生物学にリンクされていません。 ここでは、概日Epoの発現がマスタークロックタンパク質（クリプトクロム1および2、クロック、およびBmal1）によって調節されていることが解明されています。 EPOは赤血球形成の複雑な調節ネットワーク内で明確に作用するため、肝臓不十分さには、真夜中頃の生理的概日最大値の直前の適用が含まれる場合があります。
腎臓学における概日リズムは、ほとんど未踏ですが、交代制勤務、ライフスタイルの選択、および老化による概日リズムは、心血管障害を含むさまざまな疾患のリスクの増加に関連しているため、非常に関連性があります。1–4概日時計の乱れの動物モデルは、造血系に対する概日調節不全の悪影響の最初の証拠を提供します（例えば、老化した赤血球の数の増加による）。5,6
エリスロポエチンに関しては、細胞への影響だけでなく、その主要な調節因子であるエリスロポエチン（Epo）の律動性も特に興味深いものです。循環Epo濃度と血液学的パラメーター7,8ヒト血清Epo（S-Epo）レベルの日内変動は、1981年に慢性肺および石炭労働者の呼吸器疾患の患者で最初に報告されました。9その後、健康な被験者に。10,11現在までに、いくつかの報告では、夜間のS-Epoレベルが高く（午後8時から午前4時）、早朝のS-Epoレベルが低い（午前4時から午前8時）ことが示されています。 S-Epo振動の位相と振幅は、存在する場合でも、人間の個人間で変動します。9,10,12,13平均して、S-Epoレベルは最小値の約1.5-倍変化しました。14–22この日周リズムは、加齢、20トレーニング、16、または高度曝露の影響を受けないことが示されました17。対照的に、S-Epoの日周振動は、日中の低酸素血症を合併した慢性閉塞性肺疾患の患者、腎不全の骨髄腫では廃止されます。 、および骨髄異形成症。15,21,23
2009年に、時計制御遺伝子のプロモーターの大規模な分析でマウス腎臓における概日Epo mRNA発現を説明しましたが、EPO遺伝子の別個の遺伝子要素または概日振動の原因となるトランス活性化因子のいずれかを特定できませんでした。 24最近では、出血性ショックのラットモデルは、並行発現パターンに従って、時計遺伝子（Bmal1およびPer2）が低酸素/虚血中のEPO分泌の調節に関与していることを示唆しました。25
概日リズムの生成は細胞自律的であり、CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、CRY1、およびCRY2.26を含む概日時計転写因子のファミリーによって制御される転写-翻訳フィードバックループに依存していますCLOCK/BMAL1ヘテロダイマーは転写を活性化します概日時計遺伝子PER1/2およびCRY1/2の、それらのプロモーターのEボックス要素への結合を介した。 ただし、PERおよびCRYタンパク質は、CLOCK / BMAL1活性を阻害することにより負のフィードバックを提供し、それによってそれら自身の発現を低下させます。 最終的な結果は、概日遺伝子発現の振動パターンと細胞および臓器の生理学における律動的な変化につながります。27
体内時計の意味を理解するために、これまでにシングルコア時計転写因子が破壊または除去されたさまざまなタイプの変異マウスが研究されてきました28,29。ここでは、Cry1 – / – / Cry2 – / –二重変異体を利用しました内因性概日リズムを表現する能力を欠くマウス（Cry-null）。26,30invivoとinvitroのデータを組み合わせると、Cry1/2が正常酸素状態の腎臓でCLOCK/BMAL1-によって誘導される転写を介して概日Epoの発現を調節することがわかります。
方法
動物実験
ホモ接合性Cry1– / – / Cry2 – / –動物（Cry-null;オスとメス; C57BL / 6Jベース）31および野生型（WT）コントロールを飼育し（For-schungseinrichtungenfürExperimentelleMedizinCharité）、5匹飼育しました。 7ヶ月まで。 WTマウスはCry-nullコロニーの繁殖から来ました。
Cry-null遺伝子型は、ポリメラーゼ連鎖反応によって確認されました（補足表S1）。 同伴のために、マウスをグループで飼育し、12-時間：12-時間の明/暗サイクルで14日間餌と水を自由に摂取させた。 一定の暗闇に解放されてから2日目に、概日時間（CT）06または18で動物を犠牲にしました（各グループおよび時点でn¼13–15）。 組織（肝臓と腎臓）をすばやく採取し、液体窒素で急速凍結しました。 オスとメスのWTおよびCry-null動物のサブグループを、体重と血球計算の違いについて詳細に分析しました。
血液ガス分析のために、動物を麻酔し（フェンタニル、{{0}}。075 mg / kg、ミダゾラム、1.5 mg / kg、およびメデトミジン、0.75 mg / kg）、気管切開し、挿管し、換気した（一回換気量）。容量、9 ml / kg;呼吸数、160分- 1;呼気終末陽圧、2 cm H2O）、説明されているように32。左頸動脈にポリエチレンカテーテルを外科的に導入した。 安定化の5分後、頸動脈カテーテルを介した迅速な放血により実験を終了し、血液ガスを分析し（ABL -800;ラジオメーター;温度制御）、事後分析のために腎臓を切除しました。
すべての手順は、Local Animal CareCommittee（T0307 / 08; G0100 / 17、2021年1月からの補遺付き）によって承認され、ドイツの動物保護法のガイドラインと規制に従って実行されました。
RNAの調製と定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析
全RNAは記載されているように抽出されました33。製造元の指示に従って、SuperScript III逆転写酵素（Thermo Fisher; No. 18080085）およびランダムヘキサマー（Thermo Fisher; No. SO142）を使用して合計1000ngの全RNAを逆転写しました。 定量的ポリメラーゼ連鎖反応は、イントロンスパニングプライマーまたはTaqManアッセイ（補足表S2）を使用してStepOnePlusサイクラー（Life Technologies）で実行されました。 絶対的なmRNAの定量化は、ポリメラーゼ連鎖反応テンプレートの段階希釈からの標準曲線と比較することによって達成されました。
RNAscope技術による腎臓でのEpomRNA発現の検出
RNAscopeアッセイは、製造元のプロトコル（ACD;テクニカルノート320536）に従って実行されました。 10- mmの腎臓中央部の横方向凍結切片を、DapB（ネガティブコントロール; ACD; No. 310043）またはEpo（ACD; No. 315501）に対するC1プローブで染色しました。 Amp4-6を使用したハイブリダイゼーションステップと赤信号の検出は省略されました。 2人の独立した盲目の研究者が、Axioplan 2イメージングシステム（Zeiss）で、動物1匹あたり3〜8個の凍結切片で、元の倍率200でEpo陽性細胞をカウントしました。
代表的なEpo定量画像と二重蛍光染色は、RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 Kit（ACD; No. 323110）を使用して、製造元のプロトコルに従って実行されました。 1. 5- mmの中央腎臓横パラセクションは、Bmal1に対するC1プローブ（ACD; No.438741）およびEpoに対するC2プローブ（ACD; No. 315501- C2）で染色されました。 Opaleye 520（Akoya BioSciences; No. FP1487001KT）をC1プローブで使用し、オパール色素650（Akoya BioSciences; No. FP1496001KT）をC2プローブで使用しました。 - 400の元の倍率で、Epo陽性細胞をEclipse Ti2imagingシステム（Nikon）でBmal1共局在化のために画像化しました。 40、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを対比染色として使用しました。
EPO血清濃度
血液サンプルを室温で1時間凝固させた後、2000 -gで20分間遠心分離しました。 血清を除去し、希釈していないサンプルを使用してEpo（Quantikine; R＆D Systems; No. MEP006）の酵素免疫測定法を実行するまで、–80℃で直ちに凍結しました。 吸光度は、iMARK Microplate Absorbance Reader（Bio-Rad）を使用して450 nmで読み取り、前述のように570nmで波長補正と4-パラメーター適合標準曲線を使用しました。33
血球数
EDTA抗凝固処理された血液からの総細胞数と分化細胞数をSynlabで測定しました。 マウス血液用のADVIA2120i（Siemens）自動セルカウンターを備えた獣医ベルリン。
レポーター遺伝子アッセイ
ヒト胎児腎臓293細胞（DSMZ; No. ACC305;継代数3–10;マイコプラズマ陰性）は、10％ウシ胎児血清（Merck; No. F7524）。 細胞トランスフェクションは、1。67 - 105細胞/ウェルを含む12-ウェルプレートで実施しました。 記載されているように、各ウェルに333 ngのプラスミドDNA（うち1つはバニラコンストラクト）と1mlのFugene6トランスフェクション試薬（Promega; No. E2691）をトランスフェクトしました34。使用したすべてのコンストラクトを補足表S3に示します。 Passive Lysis buffer（Promega; No. E1941）でトランスフェクションしてから48時間後に細胞を溶解しました。 ルシフェラーゼ活性は、Beetle-JuiceキットとRenilla-Juiceキット（両方ともpjk GmbH、それぞれNo. 102511/102531）を使用して、LumatLB9501ルミノメーターで測定しました。 各実験は技術的に重複して実施され、平均値が計算に使用されました。
統計分析
In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1. 5-概日リズムの範囲を2倍にする）6つの概日発現遺伝子のうち4つ。 データはIBMSPSSStatistics 27を使用して分析され、中央値の付いた個々のドット、または平均とSDの付いたバーとして表示されます。 事後検定としてボンフェローニを使用したマンホイットニーU検定またはクラスカルウォリス検定が実行されました。
結果
Cry-nullマウスにおける概日Epo発現の除去
概日Epo調節の分子メカニズムを解明するために、WTおよびCry-null変異マウスにおけるEpomRNAおよびタンパク質発現を分析しました。 WT腎臓では、標準的な時計遺伝子は時刻に依存した発現を示しましたが、これは予想通りCry-nullマウスでは廃止されました（補足図S1）。 以前に、成体WTマウス腎臓の24時間にわたるEpo mRNA発現の概日振動を報告しました24。ここで最小値と最大値に注目すると、CT06（マウスの睡眠期間;予想される最小値）の間に有意なw9-倍の差が観察されました。 ）およびCT18（活動段階;予想される最大値;図1a）。 しかし、Cry-nullマウスの腎臓では、腎臓のEpomRNA発現に有意差は検出されませんでした。 特に、Cry-nullマウスでは、両方の時点での腎臓のEpo転写レベルの絶対量は、CT06とCT18のWT Epo mRNAレベルの中央値の間にありました（図1a）。 対応する肝臓のEPOmRNAは検出限界を下回っていました（データは示していません）。
Epo血清濃度の日内変化
概日EpomRNA発現の循環Epoタンパク質への翻訳を推定するために、酵素免疫測定法によって血清サンプルを分析しました。 臓器検体の前に血液サンプルを採取しました。 血清エポはWTマウスのCT06とCT18の間でw2。3-倍に増加しましたが、この違いはCry-nullマウスではなくなりました（図1b）。 特に、経時的に平均されたS-Epo濃度の中央値（CT06およびCT18）は、WTマウスとCry-nullマウスで類似していた（22 mU / ml [範囲、3〜59 mU /ml]対21mU / ml [範囲、7 –50 mU / ml]）。
動脈血ガスパラメータとパルスオキシメトリに関連する概日Epo発現
血液および組織の酸素レベルの潜在的な日内変化がEpo発現の概日振動を引き起こす可能性があるかどうかを調査するために、動脈血検体を採取し、CT06またはCT18で麻酔、気管切開、および機械的に換気したCry-nullおよびWTマウスで血液ガス分析を行いました。これは、それぞれ最低および最高の概日Epo mRNAレベルに対応します（図1a）。 CT06とCT18、またはWTマウスとCry-nullマウスの間で、動脈pH、CO2分圧、O2分圧、または標準塩基過剰濃度または乳酸塩濃度（図2a〜e）に有意差は検出されませんでした。 パルスオキシメトリで測定された酸素飽和度も、違いは見られませんでした（図2f）。 EPOマスターレギュレーターの低酸素誘導因子（HIF）2aの遺伝子発現は、WTマウスでもCry-nullマウスでも、CT06とCT18の間で違いはありませんでした（図3）。 したがって、正常酸素状態では、概日エポ調節は酸素分圧の変化によって引き起こされることはありません。
腎臓のEpo産生細胞におけるEpo発現の概日オンオフスイッチ
サーカディアンEpomRNA発現が、追加の腎Epo産生細胞（REPC）のスイッチを入れることによって媒介されるのか、細胞あたりのEpo発現を増加させることによってのみ媒介されるのかを研究するために、RNAscope in situハイブリダイゼーションを腎臓中央部の横断面で使用しました（補足図S2の例）。 WTマウスでは、REPCの数はCT 0 6（中央値、5;範囲、0 – 25）とCT18（中央値、22;範囲、5–82;4。{{ 11}} fold;P¼0.010）。 対照的に、Cry-null腎臓は、CT06（中央値18;範囲2–33）とCT18（中央値15;範囲4–87;有意ではない;図1c）で同様の数のREPCを示しました。 Cry-nullマウスは、インスリン様成長因子1（IGF1）のシグナル伝達障害により成長制限を示し、Cry-nullマウスとWTマウスの体重と臓器サイズの差が継続的に増加すると考えました。比較的若い動物では、Cry-nullマウスの絶対腎臓重量はWTマウスよりもわずかに低かった（Cry-nullマウスでは-12％）が、相対的な腎臓と体重の比率に差はなかった（補足図S3） 。 したがって、Epo mRNA発現の概日増加は、追加のREPCのスイッチで制御されているようです。
CLOCK/BMAL1による最小EPOプロモーターの活性化
概日Epo発現の原因となる調節配列を特定するために（図4a）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイをヒト胎児腎臓293細胞で実施しました。 ヒト胎児腎臓293細胞株は、その腎臓起源ではなく、内因性概日時計の欠如のために選択されました。 したがって、CLOCK / BMAL1の刺激効果は、低振動のCLOCK/BMAL1バックグラウンドでテストできます。 CLOCK / BMAL1の過剰発現は、最小のヒトEPOプロモーターの活性を有意に刺激しました（図4b、I対II）。 E-boxモチーフ（転写開始部位に対して–36〜–31 bp）が変異している場合35、この効果は鈍くなります（図4b、III）。
観察された概日調節が細胞型依存性であるかどうかを研究するために、ルシフェラーゼレポーターのBmal1プロモーターを介した振動を監視することにより、内因性時計活性についていくつかのEPO発現細胞株をスクリーニングしました。 内因性リズムを持つものには、ヒト肝細胞腫由来のHEP3B細胞、ヒト神経芽細胞腫由来のKELLY細胞、PDGFRbþマウス腎臓細胞（以前はEPO発現マウス細胞株FAIK 1-10）が含まれていました。 KELLY細胞は、EPOプロモーター駆動のルシフェラーゼ振動を示しました（補足図S4A）。 PDGFRbþ細胞はBmal1プロモーター活性の強い概日リズムを示しましたが、EPOプロモーターを介した振動は検出されなかったため、EPOプロモーター駆動レポーターコンストラクトの振幅が低いことが示唆されました（補足図S4B）。
Cry-null対WTマウスの腎臓におけるBmal1とEpoの共局在
（i）腎臓のEpo産生細胞を動員することによる腎臓のEpo産生の概日調節、および（ii）Bmal1とEpoの発現の共局在をさらに解明するために、RNAscopeinsituハイブリダイゼーションを行いました。 EpoとBmal1は共局在しており、低倍率での顕微鏡検査は、図1cで定量化されているように、REPCの動員の違いを表しています（図5）。
Cry1 / Cry2欠損症の血液学的所見（i）サーカディアンEpo発現の欠如による造血作用、および（ii）機能時計のないマウスにおけるその他の血液学的異常の可能性を評価するために、血球数を分析しました。 Epo mRNA発現とS-Epo濃度の時刻の違いは、WTマウスのCT06とCT18での末梢網状赤血球数の有意差によって反映されませんでした。 しかし、網状赤血球数は、WTマウスと比較してCry-null動物のCT06とCT18の両方で有意に低かった（図6a）。 WTマウスとCry-nullマウスの赤血球数またはヘマトクリット値に有意差はありませんでした。 ただし、両方のパラメーターは、両方の系統のCT06とCT18の間で変化せず（図6bおよびc）、Cry-nullマウスの末梢網状赤血球数の低下に対応していませんでした（図6a）。 IGF1シグナル伝達の障害による栄養不足（鉄や葉酸など）が網状赤血球の減少とCry-nullマウスの正常な赤血球数の不一致に関与しているかどうかをテストするために、赤血球のサイズと形状を分析しましたが、有意差は示されませんでしたCry-nullマウスとWTマウスの間（補足図S5）。
特に、Cry-nullマウスの血小板数の中央値はWTマウスよりも高い傾向がありましたが、血小板数は両方の系統のCT06とCT18の間で有意差はありませんでした（図6d）。 対照的に、白血球（WBC）数は、WTではCT06とCT18の間で有意に異なりましたが、Cry-nullマウスでは異なりませんでした。 CT06のWTマウスと同様に、Cry-nullマウスのWBC数の中央値は同様に高かった（図6e）。
討論
ここでは、概日Epoの発現が転写レベルで調節されていることを示します。 不整脈のCry1およびCry2欠損マウスにおけるEpomRNAおよびS-Epo濃度の分析は、「Epoの時計」の検索を、CRY1およびCRY2.26によって抑制される下流の標的転写因子CLOCKおよびBMAL1にリダイレクトしました。 CLOCK / BMAL1のリズミカルな抑制が失われ、WTマウスのCT06とCT18の中央値レベルの間にある一定のEpo転写レベルが得られました（図1a）。 RNAscopeによるinsituハイブリダイゼーションは、概日振動が間質細胞におけるEpo mRNA発現のスイッチを入れることによって達成されることを示し（図1c）、RNAscopeによるinsituハイブリダイゼーションもREPCにおけるBmal1の発現を明らかにしました（図5）。
さらに重要なことに、CT18での有意に高いS-Epoレベルは、概日性の転写Epo調節が、正常酸素状態下での循環Epoタンパク質の概日振動に変換されることを確認します（図1b）。 S-Epoレベルの実際の最大値はCT18よりわずかに遅いと予想されます。これは、EPOタンパク質のデノボ合成にw80〜120分が必要であり38、最大EpomRNAレベルに基づいてサーカディアン時間が選択されたためです。 24概日Epo調節は、CLOCK /BMAL1による5'EPOプロモーターのE-boxモチーフの転写活性化によって媒介される可能性が高いことを発見しました（図4および補足図S4）。これは、BMAL1タンパク質と急性出血のラットモデルにおけるS-Epoレベル。25
直接的なタンパク質間相互作用を介したCLOCK/BMAL1とHIF経路間の双方向調節の証拠があります。39,40EPOプロモーターの主要な活性化因子であるHIF2aのアップレギュレーション41,42により、ヒト肝細胞腫細胞における時計遺伝子の発現レベルが変化しました43。さらに、BMAL1はHIF1aおよびHIF2aタンパク質と二量体化します。44,45,また、HIF活性の概日時計制御は組織特異的に調節されています39。急性低酸素症（6％で4時間対21％O2）にさらされたマウスでは、EPO mRNAは過剰に増加しましたが、概日差は見られなくなりました。 .46したがって、概日Epo調節の分子メカニズムを分析するには、おそらく正常酸素状態が最も適切です。 しかし、げっ歯類では、血中および組織の酸素レベルの日変化が報告されています39,47。ラットでは、腎臓の酸素化にzD3パーセントのリズミカルな毎日の変化の範囲が低く、暗闇にピークがあります（1/4げっ歯類の活動） .47このような違いは、動物の規制上の理由から、麻酔、気管切開、および機械的に換気されたマウスのみを研究できる実験では検出できませんでした。 ただし、動脈pH、CO2分圧、O2分圧、標準塩基過剰または乳酸、および酸素飽和度の分析では、両方のCTでWTマウスとCry-nullマウスの間に大きな違いは示されませんでした（図2）。 さらに、腎臓のHif2a転写レベルもすべての条件で同様でした（図3）。 したがって、正常酸素状態では、概日エポ調節は酸素分圧の日変化とは無関係であるように思われます。 ただし、高地または低酸素症（低pO2）がEpo産生の概日振動にどの程度影響するかという問題には、さらに注意を払う必要があります。 人間のS-Epoレベルは一般に高地で高くなりますが、位相と振幅は変化しません17,22。常圧低酸素にさらされた健康なボランティアでは、S-Epo濃度は顕著な振動を示します。48
Circadian Epo規制は、おそらく臨床腎臓学および血液学に最も関連性がありますが、赤血球生成促進剤を投与するための血液検査などの検査室診断にも関連しています。 ドーピング分析で循環Epo濃度を評価するには、採血時の時刻（外部時間）と人の日内変動（内部時間）を考慮する必要があります49,50。
赤血球形成では、バースト形成単位（赤血球）が最初の系統特異的細胞であり、次にコロニー形成単位（赤血球）が続き、Epo受容体の豊富な発現を示します。 Epoで2日間培養した後、マウスのコロニー形成単位である赤血球は赤芽球のコロニーを生成します。 7日後にオルソクロマチック赤芽球の段階に達すると、細胞は核を押し出し、Epo受容体の発現を欠く網状赤血球になります51。コロニー形成ユニットである赤血球が網状赤血球または完全に成熟した赤血球に成熟するのにかかる時間を考慮すると、 WTマウスでCT06とCT18の間に違いが観察されなかったことはおそらく驚くべきことではありません（図6a–c）。 特に、全体的な網状赤血球数は、WTではCry-nullマウスよりも有意に高く（図6a）、Cry-nullマウスでは網状赤血球への分化が損なわれていることを示唆しています。 以前のデータは、初期の赤血球前駆細胞もDNA合成の概日パターンを示すことを示しています。 rhEpoのinvivo投与は、赤血球コロニー数の概日リズムを強化します52。Cry-nullマウスの全体的なS-Epo濃度が比較的高いにもかかわらず、網状赤血球数が少ないのは、赤血球前駆細胞のレベルでの概日DNA合成の廃止に起因する可能性があります。 このような高S-Epoと赤血球形成の減少のコンステレーションは、松果体メラトニン産生の遺伝的除去を伴うマウス（律速N-アセチルトランスフェラーゼを欠くC3H / HeNマウス）で観察されており53、赤血球前駆細胞の内因性概日活動を主張しているレベル。
特に、Cry-nullマウスはIGF1レベルが約80％減少し、WTと比較してIGF1シグナル伝達が減少し、体重と臓器サイズが30％減少します。この効果は、生涯にわたって悪化します。実験は比較的若かった（年齢の中央値、21–29 数週間）、Cry-nullマウスの全身および絶対腎臓重量に中程度の影響を示しましたが、腎臓と体重の比率は正常でした（補足図S3）。 後者の事実は、Epoタンパク質合成の能力に関連している可能性があります（図1b）。
ただし、赤血球のサイズまたは形状（MCV、MCH、およびMCHC;補足図S5）の分析では、Cry-における網状赤血球数の減少と正常な赤血球数の不一致の説明として栄養不足（鉄や葉酸など）は示唆されませんでした。ヌルマウス（図6aおよびb）。 特に、EpoとIGF1のシグナル伝達は、GATA -1 / GATA -1転写複合体の友人との相互作用を介して、赤血球形成中の細胞増殖と分化を同期させます54。このプロセスでは、Epoは細胞のAKT経路を活性化し、それによって増加します。赤血球形成の主要な転写調節因子であるGATA-1と、その補因子であるGATA-1との親和性。 しかし、IGF1シグナル伝達が廃止された場合、このメカニズムは阻害されます54。したがって、赤血球分化に対するCry-nullマウスの比較的高いEpoの正の効果は、ここで研究した比較的若いCry-nullマウスのIGF1活性の低下を上回る可能性があります。
造血における完全な概日リズムの不規則性の一般的な意味は、血小板とWBCの数の分析によってさらに解明されます。 ドミナントネガティブ型の時計（ClockD19 / D19）を発現するマウスからの以前の結果は、トロンボポエチン（巨核球形成の主要な調節因子）とその受容体Mplの発現の破壊が、成熟骨髄巨核球の数と循環血小板数の増加をもたらすことを示しました。 55 WTマウスのzeitgeber時間（ZT）20でピークにある血小板数の記載された有意な概日振動、およびClockD19 / D19マウスのZT08でのより高い血小板数55は、血小板数の概日振動の欠如をもたらしました。私たちのマウスモデルで確認されています（図6d）。 もう1つの重要な発見は、WTマウスとは対照的にCry-nullマウスの循環WBCの時刻差が失われることです（図6e）。これは、成熟したWBC産生に対するCLOCK/BMAL1の報告された活性と一致しています。56,57
私たちのデータを解釈するには、マウスと人間の昼夜の活動の違いを考慮する必要があります。人間の時間CT06はおおよそ真夜中（睡眠段階）に対応し、CT18はおおよそ正午（活動段階）に対応します。 夜行性マウスの場合は逆になりますが、どちらの生物も同じ概日Epo発現パターンを示します（CT / ZT06で低く、CT / ZT18で高い）。 これは、追加のメカニズム（代謝因子など）が両方の生物のEpo発現のリズムを変える可能性があることを示しています。 初期の赤血球前駆細胞（バースト形成単位-赤血球、さらにはコロニー形成単位-赤血球細胞）におけるEpoピークレベルとEpo受容体発現の間の同期52 rhEpo治療を受けている患者（例えば、末期腎貧血または血液疾患）は、夜間にハイポを適用することにより、通常の概日生理を模倣することで恩恵を受けることを示唆しています。 造血障害は、CRY1（男性のオンラインメンデル遺伝* 601933）またはCRY2（男性のオンラインメンデル継承* 603732）の機能喪失型変異を有するヒトではまだ報告されていません。 臨床報告は、CRY1変異体を主に注意欠陥/多動性障害と関連付けており、不眠症、不安神経症、うつ病、または睡眠相後退症候群を伴うことがよくあります。58,59このような病気は貧血や造血障害によって悪化する可能性があるため、これはさらに調査する価値があります。
結論として、この研究は、正常酸素状態の成体ネズミ腎臓における概日Epo発現が、5'EPOプロモーターのE-box要素のCLOCK /BMAL1-媒介活性化によって転写レベルで調節されるという最初の証拠を提供します。 EPOは赤血球形成の複雑な調節ネットワーク内で明確に作用するため、腎不全の患者におけるレポの最適な使用には、夜間の生理的概日最大値の直前に適用することが含まれる場合があります。
