循環エキソソームPD-L1の検出方法
Mar 31, 2022
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循環エキソソームPD-L1の検出のための受け入れられた主流の方法はまだ欠けている。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)やフロー分析などの従来のエキソソーム検出法は、循環エキソソーム中のPD-L1を検出するために使用することができ、ELISAは現在最も一般的に使用されている方法である。ELISA法は、循環エキソソーム中のPD-L1の含有量を定量的に検出することができ、操作が容易である。フローサイトメトリーは、大量のサンプル中の循環エキソソームPD-L1を定量的に検出するために使用できますが、高い検出装置が必要です。エキソソームの綿密な研究により、エキソソームタンパク質や核酸の検出方法も充実・開発され、循環エキソソームにおけるPD-L1検出の分野にもいくつかの新しい方法が導入されています(図)。
の検出循環エキソソームティッカー
1. デジタルPCR
エキソソームに含まれる核酸の量が少ないため、従来の検出方法では遺伝子コピー数を正確に検出することは困難でした。デジタルPCR技術は、極めて高感度で絶対定量性の高い核酸検出法です。その感度は単一の核酸分子のレベルに達することができるので、エキソソームの核酸含有量を検出するのに利点がある。研究者らは、デジタルPCR技術を用いて、メラノーマおよび非小細胞肺がん患者の血漿エキソソーム中のPD-L1 mRNAコピー数を正確に定量的に解析し、血漿エキソソームPD-L1 mRNAコピー数と抗PD1治療効果の関係を明らかにした。デジタルPCR技術の導入により、エキソソームPD-L1 mRNAの検出能力が大幅に向上し、エキソソームPD-L1の研究にとって大きな意義があります。しかしながら、エキソソームPD−L1 mRNAの含量とPD−L1タンパク質の発現との間には不整合があり得る。したがって、エキソソームPD-L1 mRNA単独の検出には特定の欠陥がある可能性があり、さらなる研究と解明が必要です。
2. エリサ
ELISAは従来の免疫学的分析法であり、血漿または培養培地中の小分子タンパク質を検出するためによく使用されます。高感度で定量分析が可能です。ELISAはまた、エキソソームPD-L1タンパク質を検出するために使用することができ、サンプルの大規模なバッチの定量的検出を達成することができる。ELISA法の原理に基づくPD-L1タンパク質検出キットは、血漿エキソソームPD-L1タンパク質の定量検出にも応用されている。ChenらはELISAの原理に基づいてエキソソームPD-L1タンパク質検出系を構築し、これを細胞培養培地または血漿由来のエキソソームPD-L1タンパク質の検出に使用した。線形検出範囲は0.2-12.0ng/mLであった。ELISAは、エキソソームPD-L1タンパク質を検出するための優れた方法であり、定量的に検出が容易であり、良好な再現性を有する。しかし、血漿中に遊離PD-L1タンパク質が存在するため、その精度を妨げます。したがって、この方法は循環を検出する。エキソソームPD-L1タンパク質の感度および特異性は、依然としてさらに調査する必要がある。
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3. フロー解析方法
フローサイトメトリーは、液体中に懸濁した細胞または他の生物学的粒子をタイプおよび計数するためにしばしば使用されるので、この方法はエキソソームの検出および計数にも導入されている。THEODORAKISらは、まずクロマトグラフィーを用いて頭頸部がん患者の血漿中のエキソソームを最初に分離し、次にフロー分析を用いてPD-L1陽性エキソソームを検出してカウントした。PD-L1タンパク質発現を蛍光強度として表した。この結果は、この方法がエキソソームPD-L1タンパク質を検出する際に良好な再現性を有し、単一の患者サンプルに対して複数の並列アッセイを行った場合、その個体内変動が7%であることを示している。同時に、この方法の精度を検証するために、研究者らは、エキソソームPD-L1タンパク質の検出のための参照方法として共焦点蛍光分析を使用した。3つのサンプルを並行して試験し、結果を比較したところ、フローサイトメトリーと共焦点蛍光分析の結果に高い一貫性があることが分かり、フローサイトメトリーがエキソソームPD-L1の定量分析の正確な方法であることが分かりました。また、LUXらも膵臓癌患者の血清中のエキソソームPD-L1およびc-Metタンパク質の発現をフローサイトメトリーによって検出することに成功したが、検出方法の性能はさらに研究する必要がある。現在、従来のフローアナライザーよりもエキソソームタンパク質検出に適したApogee超高感度ナノフローアナライザーなど、エキソソーム検出に特別に使用されるフローアナライザーも発売されています。
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4. 表面増強ラマン散乱技術
表面増強ラマン散乱(SERS)は、生物医学分野で広く使用されている高感度指紋分光法技術です。現在、学者はエキソソームPD-L1タンパク質を検出するためにSERS技術を使用しています。研究者らはまずTiO2修飾磁気ビーズを使用して血漿中のエキソソームを非特異的に吸着し、次にPD-L1抗体に連結されたSERSプローブを使用して金ナノ粒子を修飾し、次にエキソソームサンプルを金ナノ粒子と共にインキュベートした。磁気ビーズ - エキソソーム - 金ナノ粒子複合体構造を形成し、最後に磁場を使用して複合体を濃縮および分離し、次いで検出のためにレーザー共焦点ラマン分光計上に配置して、PD-L1陽性エキソソームの検出を実現する。本文の内容の検出。この方法は検出感度が高く、その最低検出限界は1 PD-L1+エキソソーム/μL血漿に達することができます。さらに、研究者らはこの方法を使用して、異なる濃度のサンプル群を検出した。この結果は、SERS強度がエキソソーム試料の濃度の対数と直線的に関係していることを示し、検出方法が安定性が良好であり、血漿中で直接使用できることを示している。追加のエキソソーム分離ステップなしでエキソソームを検出します。現在のところ、SERS技術をエキソソームPD-L1タンパク質の検出に直接応用する研究は少ないが、他のエキソソームの検出へのSERS技術の応用に関する研究が行われており、これもエキソソームPD-L1タンパク質値の検出にとって重要な基準となっている。
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5. ホームズ-エキソPD-L1法
HOLMES-ExoPD-L1法は、エキソソームPD-L1タンパク質の新規検出方法である。この方法では、PD-L1タンパク質を標的とした新しいMJ5Cアプタマーを設計し、エキソソーム膜上のPD-L1タンパク質を効率的に結合でき、PD-L1タンパク質の糖鎖付加によって妨げられない。この方法では、蛍光標識されたMJ5Cアプタマーとエキソソームをまず薄いキャピラリー内で共インキュベートして互いに結合させ、赤外線レーザーを薄いキャピラリーに集束させてミクロンスケールの温度勾配を形成した。遊離MJ5CアプタマーとエキソソームMJ5Cアプタマー複合体の熱泳動速度は有意に異なり、遊離アプタマーの熱泳動枯渇はエキソソーム-アプタマー複合体のそれよりも速かった。分離された。従って、励起光の作用下で、エキソソームPD-L1タンパク質の含有量は、蛍光標識されたアプタマーの蛍光強度を検出することにより求めることができる。この方法は、高感度であり、検出限界は17.6pg/mLである。さらに、サンプル量が少なく、検出時間が短いという利点もあります。エキソソームPD-L1タンパク質の検出のための非常に独創的な方法であり、エキソソームPD-L1タンパク質検出方法は啓発的な価値を有する新規の開発にとって非常に重要である。
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エキソソームPD-L1は、悪性腫瘍免疫療法の分野で幅広い応用の見込みがあり、エキソソーム研究の分野におけるホットスポットの1つとなっている。組織PD-L1発現の検出と比較して、循環エキソソームPD-L1の検出は、病理学的サンプリングによって引き起こされる組織不均一性の問題を回避しながら、標本を取得してリアルタイム検出を行うことが容易である。エキソソームPD-L1はまた、腫瘍免疫をもたらす。それは逃避の重要な原因であり、悪性腫瘍の進行に関連しており、疾患評価および予後予測のための重要な指標となる可能性がある。さらに、血漿エキソソームPD-L1レベルは、抗PD-L1免疫療法に適した患者をスクリーニングし、治療に対する反応を予測するために使用されることも期待されている。しかしながら、循環エキソソームPD−L1の検出のための認識された有効な方法が依然として欠如している。単純または無分離、より少ないサンプル要求、高感度、良好な再現性、および感受性の低い検出信号を備えた理想的な循環エキソソームを確立する必要があります。インビボでPD-L1を検出するための方法。循環型エキソソームPD-L1の検出方法はまだまだ詳細な研究が必要ですが、今後の新しい検出方法の開発と応用により、循環エキソソームPD-L1は抗PD1免疫療法をよりよく導き、悪性腫瘍の診断および治療に使用することができると考えられています。より重要な役割を果たします。
