加齢に伴う神経変性疾患の前臨床研究の進歩への道: げっ歯類および HiPSC 由来モデルに関する展望 パート 3
Jul 09, 2024
同様のウイルスベクターアプローチがさまざまな PD モデルで評価されており、最も初期の表現では AAV2/2 または LV が使用されています 123-126。成体ラットの脳に注入されたこれらのベクターは、疾患に対してヒト a-syn の WT、A30P、または A53T 変異体を送達するために使用されました。誘導。
ウイルスは身体的な不快感や病気を引き起こすことが多いため、ウイルスと記憶の関係は多くの人にとって否定的に見えるかもしれません。しかし、主にウイルスの攻撃が免疫系の活動を促進する可能性があるため、ウイルスは記憶力の向上にプラスの効果をもたらす可能性もあります。
研究によると、ウイルスの攻撃により体の免疫システムが反応し、それによってウイルスに対する体の抵抗力が向上する可能性があることが示されています。この免疫系の反応には、白血球やその他の免疫細胞の生成数の増加、および抗体の生成が含まれます。これらの反応は、体がウイルスの侵入に抵抗するのに役立つだけでなく、免疫系の機能を強化し、体全体の健康状態を改善するのにも役立ちます。
ウイルスの攻撃は脳内の免疫細胞も活性化します。これらの免疫細胞は、脳から老廃物や破損した細胞を除去し、神経系の機能を改善し、情報伝達と記憶処理を促進します。研究では、特定のウイルスに感染している人は、記憶に関する作業を行う際にパフォーマンスが向上することも示されています。
さらに、一部の研究では、特定のウイルスが身体を刺激して、ニューロンの成長と発達を促進する物質である脳由来神経栄養因子 (BDNF) を生成する可能性があることが判明しました。この物質は脳の機能にプラスの効果をもたらし、身体の修復と記憶力の向上を促進します。
もちろん、ウイルスとの戦いでは、免疫システムを最高の状態に保つために、適切なアプローチと戦略を採用し、良好な衛生習慣を維持し、十分な睡眠と運動をする必要があります。つまり、ウイルスは私たちに身体的な不快感を引き起こす可能性がありますが、免疫システムの活動を促進し、私たちの健康と記憶にプラスの影響を与える可能性があるという証拠が増えています。私たちは記憶力を向上させる必要があることがわかります。Cistanche は記憶と学習に非常に重要なアセチルコリンや成長因子のレベルを高めるなど、神経伝達物質のバランスも調節できるため、Cistanche は記憶力を大幅に向上させることができます。さらに、シスタンシュは血流を改善し、酸素の供給を促進することで、脳に十分な栄養とエネルギーを確保し、それによって脳の活力と持久力を向上させることができます。
著者らは、黒質DAニューロンにおけるa-synの効率的な発現と、時間の経過とともに徐々に進行する分子および細胞の病理および黒質DA変性を伴うことを実証した。
それにもかかわらず、これらの研究で使用された第 1 世代の rAAV2/2 ベクターは進行性のニューロン喪失を示しましたが、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンの神経変性および時間経過は非常に多様でした (25% ～ 80%、6 週間から 1 年) 、それぞれ).123,124
対照的に、WT、A30P、または A53T 変異α-シンをコードする LV は、より遅れて、より一貫した方法でラットの神経細胞喪失を誘導することができました (それぞれ 25% ～ 40% および 5 か月)。 126 両方の研究で実証されました。神経突起の長さの進行性の減少と、残っている DA ニューロンの核周囲の腫れ。
さらに、α-syn の大量の細胞質蓄積が細胞体と神経突起の両方で見つかりました。これらの結果は、最近、両方のウイルスプラットフォームを利用した複数の研究で再現されています127-131。
LV はさまざまなマウスの PD モデルにも利用されています。例えば、Lauwers ら 125 は、α-syn の WT または A30P 変異体を保有する LV をマウスの線条体、扁桃体、または SN に注射すると、時間依存的に PD に関連する神経変性変化を誘発することができ、α 非依存性の神経突起拡大が含まれることを示しました。そして細胞質封入体。
さらに、この研究は、A30P-a-syn の黒質過剰発現が 10 ～ 12 か月で約 25% の細胞損失をもたらすことを実証しました 125。LV を使用したラットの SN への A30P、E57K、および E35K の送達は、DA ニューロンでも同様の程度を実証しました。 WT (30%) と比較して減少 (約 50%) したが、同じ研究で使用されたより速い原線維形成変異体 A53T は DA 細胞数の有意な減少を示さなかった。
興味深いことに、マウスで観察された全体的な神経病理学的特徴（すなわち、発症および重症度）は、ラットと比較してそれほど深刻ではないように見えたが、これらの違いは、ウイルスの純度または注射されたウイルスの産生力価のアーチファクト、および/またはその他の関連する技術的な矛盾である可能性がある。
AD および PD ウイルスベクターモデルに関する重要な考慮事項
AAV2/1、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/8、AAVrh10、DJ、DJ8 などの新規血清型の開発により、細胞標的が広がり、AAV 形質導入効率が向上しました。
これらの新しいキャプシドで血清型別された AAV は、ラットおよびヒト以外の霊長類で a-syn を過剰発現するかどうか試験されています 132-137。AAV2/5 および AAV2/6 を介して送達される S129Aform の過剰発現は、神経変性プロセスにおいて一貫して毒性の増強を示します。134,138
これらの実験はまた、高力価で送達された蛍光レポーターのみを運ぶコントロールベクターでさえ非特異的な毒性効果を示す可能性があるため、過剰発現導入遺伝子の慎重な投与が重要であることを実証しました。
AAV に基づいてレスキュー実験を設計する場合は、この注意点を慎重に考慮する必要があります。例えば、ＳＮＣＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む治療用ＡＡＶは、高レベルの毒性をもたらし、黒質線条体ＤＡニューロンの重大な損失を引き起こすことが示されている。この研究は、動物研究における AAV 応用の限界をさらに強調しました。
しかし、神経毒性がラットモデルにおけるSNCAレベルの大幅な低下によって引き起こされた可能性を排除することはできず、asa-synはDAニューロンにおいて重要な生化学的役割を果たしており、その大幅な低下により細胞生存率が低下する可能性がある139。 まとめると、これは以下の重要性を強調するものである。遺伝子治療アプローチを設計するために、疾患関連遺伝子の発現を微調整するツールを開発しています。
この点に関して、より最近の CRISPR-dCas9- ベースのシステムは、正確かつ微調整された方法で遺伝子発現を調節するためのより有利なシステムを提供する可能性があります。
これに沿って、我々は最近、SNCA 遺伝子発現の正確かつ微調整を達成する LV-CRISPR-Cas9 システムを開発しました。この研究は、エピゲノム編集による遺伝子発現の操作（過剰発現の逆転など）が、遺伝子調節異常によって引き起こされるPD140などの神経疾患に対する貴重な治療戦略であるという概念の証拠を提供した。
したがって、α-synタンパク質の過剰発現にLVおよびAAVを使用するウイルスベクターPDモデルは、DA神経変性に関連するPD病態を示し、新規AAV血清型の使用により、AAV2/2と比較してDAニューロンにおけるα-syn発現が改善される。
全体として、AAV と LV は両方とも導入遺伝子の発現を誘導することができ、DA ニューロンに対して高レベルの指向性を示し、結果として同様のレベルの神経変性をもたらします。細胞のPD表現型の遅い進行と比較的低レベルの行動障害を回避するには、これらのウイルスシステムをさらに改善する必要がある。
In Vitro 細胞培養モデル現在の In Vitro AD および PD モデルの概要: 限界と機会
過去 40 年にわたり、関連する疾患の病態生理の重要な側面間の相互作用を調べるために、さまざまな AD および PD の in vitro モデルが開発され、その後前臨床治療スクリーニングに利用されてきました。
現在の AD および PD の in vitro モデルは、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレス、細胞生存、細胞内および/または細胞外タンパク質凝集体の存在などの分子および細胞疾患の特徴を再現することを主な目的としています。例えば、最も著名で広く使用されている AD の細胞モデルは、Ab40 42 凝集体またはタウの過剰リン酸化と凝集の誘導に基づいています 141,142 (表 1)。
同様に、PD の in vitro モデルは、前述の毒素誘発性ミトコンドリア機能障害 (例、MPTP、ロテノン、パラコート、6-OHDA) およびタンパク質恒常性の破壊 (例、タプシガルギン、イオノマイシン、ツニカマイシン)、α-syn 過剰発現、および発現に基づいています。変異した PD 家族性遺伝子 (例、a-syn、Parkin、PINK1)92 (表 2)。
これらの細胞培養モデルは、関連する神経生物学の理解を進める上で非常に貴重ですが、予防、発症の遅延、または疾患の進行の遅延を目的とした実行可能な DMT はまだ得られておらず、その関連性と翻訳の妥当性には疑問が生じています。
現在の前臨床実践を改善するには、これらのモデルのいくつかの明確な制限を認識することが重要です。
例えば、関連する疾患関連遺伝子の過剰発現およびノックアウト/ダウンに基づくモデルは、タンパク質レベルの定量的変化および遺伝子発現の変化を誘導するために使用される方法(すなわち、ウイルス媒介、育種ベース、構成的、または一過性の発現)が変動しやすいことで知られています。それは矛盾したデータと推論につながる可能性があります92。
疾患に関連する表現型を引き出す際の一貫性の欠如により、潜在的な DMT をテストするためにこれらのモデルを使用する前臨床研究には注意が必要です。さらに、前臨床NDDモデルで観察される細胞表現型と方法論の変動（タンパク質の過剰発現またはノックダウンの倍率変化など）は、現在の細胞モデルでは完全には調査できない、より大きな遺伝的不均一性を強く示唆しています。
この問題は、家族性変異が NDD 症例全体のごく少数に相当するにもかかわらず、家族コホートで特定された遺伝子変異に基づく細胞モデルの蔓延によってさらに複雑になっています。109,143
遺伝的原因が解明されていないため、前臨床モデルで非メンデル遺伝学を伴う散発性NDDコホートや疾患サブタイプを正確に表現することは依然として困難であり、関連する疾患メカニズムの解明、潜在的な治療標的の特定、および医薬品開発において大きな障壁となっています。
これらの課題を考慮すると、研究者はこれらのモデルを評価して改善の領域を特定し、新しい細胞培養技術によってもたらされる機会を評価する必要に迫られています。
近年、我々はこれらのモデルを構築し、新規遺伝子編集技術を組み込み、改良された組織培養モデルでGWASで得られた重要な遺伝病の関連性を評価しました。144,145
hiPSC 技術の組み込みの増加は、NDD in vitro モデリングの分野における大きな進歩を表しており、ヒトゲノムの文脈における疾患の病因を探索するために患者由来の疾患関連細胞型を利用する、これまで利用できなかった機会を提供します。
hiPSC 由来の NDD モデル、特に AD と PD に関する利点と限界の全範囲については、次のセクションで詳しく説明します。
HiPSC 由来の NDD モデル: 多用途で遺伝的に「忠実」
細胞培養技術の現代の進歩は、NDD 研究における最も刺激的な進歩の 1 つであり、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および個別化医療の改善の機会を提供します。
最近まで、死後脳検査は、ヒトの神経変性状態の病理学的プロセスについての洞察を得る上でのゴールドスタンダードのヒトベースの生物学的材料と考えられていました。
しかし、患者特有のニューロンやグリア細胞の分析を含む最新の幹細胞技術は、NDDの病理学的メカニズムを研究するための新たな道を切り開き、ADやADなどの遺伝的複雑性が高まったNDDの分子解剖にますます活用されています。 PD。
さまざまな代替生物学的サンプルに加えて、患者の皮膚サンプルの簡単で非侵襲的な生検を通じて、hiPSC を生成することで、研究者は、以前の細胞培養法では不可能だった方法で、NDD の根底にある分子経路と疾患メカニズムを明らかにすることができます。
現在、最も普及しているドナー細胞は線維芽細胞であり、公表されているすべての再プログラミング実験の 80% 以上で利用されています 146。しかしながら、hiPSC は、胚性臍帯幹細胞、臍帯血、角膜上皮細胞、末梢血単核球などの血液細胞147-149(図1)。
したがって、hiPSC 由来モデルは、既存の細胞疾患モデルの汎用性の高い代替品であり、プラスミド、ベクター (例、エピソーム)、ウイルス形質導入 (例、ウイルス導入) などのさまざまな再プログラミング ツールの使用を通じて多能性を強制された患者の体細胞組織から得られます。 、アデノウイルス、センダイウイルス、レンチウイルス;これらの方法はBrouweret al.150およびMalikおよびRao151で包括的にレビューされています。
これらの細胞は自己複製するため、倫理的配慮や社会的懸念を伴う胚性幹細胞 (ESC) の代替品となります。現在、サンプルを一元管理して研究者が容易に利用できるようにするために、NDD 患者および健康年齢が一致した対照から得られた hiPSC 株を収集および配布する hiPSC リポジトリがいくつかあります (表 S2)。
hiPSC の主な用途の 1 つは、特定の細胞型への分化であり、その結果、神経発達 152 および神経変性研究 144、体外移植 153,154 、疾患モデリング、標的検証、および創薬など、さまざまな生物学的状況で利用されてきました。
現在までに、一般的なニューロンだけでなく、興奮性ニューロン、コリン作動性ニューロン、DA ニューロン、抑制性 GABA 作動性ニューロンなどの特定のニューロン細胞タイプの集団も生成するいくつかの細胞分化プロトコルが開発されています。アストロサイト159-161オリゴデンドロサイト162,163およびミクログリア164-166を含む
CRISPR-Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ (TALENS) などのいくつかの新規遺伝子編集技術は、hiPSC 由来システムにさらなる次元、つまり同じ遺伝的背景を持つ同質遺伝子モデルの作成を導入しました。選択された突然変異のみが異なります。167
細胞分化プロトコールの多様性により機構研究が容易になり、同質遺伝子系の入手可能性により、遺伝子機能とNDDにおけるその病原性の役割の遺伝的解析がサポートされてきました。 hiPSC 由来モデルは、重要な疾患関連の特徴を示すため、これらの研究に適しています。
例えば、PS1 および PS2 変異 (それぞれ A246E および N14II) 168 および APP 重複変異 169 を有する fAD および sAD 由来の hiPSC ニューロンモデルは、Ab 分泌、Ab42:Ab40 比の増加、過剰リン酸化タウの上昇などの重要な AD 生化学的特徴を示します。
Ab 関連表現型を生成する hiPSC モデルの使用は、従来の異所性発現モデルまたは Ab 凝集体の補充および/または誘導を必要とするモデルと比較した場合、AD 神経変性における Ab 発現の役割を探索するより正確な手段となることに留意することが重要です。これらは、Ab 沈着に関連する「自然な」発生する病理学的プロセスを採用しています。
For more information:1950477648nn@gmail.com
