加齢に伴う神経変性疾患の前臨床研究の進歩への道: げっ歯類および HiPSC 由来モデルに関する展望 パート 4
Jul 10, 2024
hiPSC 由来の PD の in vitro モデルも、患者由来の hiPSC DA ニューロンモデルにおける家族性 PD 変異に関連する病態生理学的進行を解明する上で非常に有益です。
PD は神経変性疾患であり、通常、患者の記憶力と認知能力に一定の影響を与えます。しかし、現代医学の絶え間ない進歩により、患者が良好な記憶を維持できるようさまざまな方法を講じることができます。
まず、定期的な運動は PD 患者の認知能力と記憶力を向上させることができます。運動は血液循環を促進し、脳内の神経細胞への栄養補給を促進し、脳のさまざまな部分間の接続と調整を維持するのに役立ち、それによって全体的な認知レベルを向上させます。
第二に、食事も PD 患者の記憶力を向上させる鍵となります。高繊維、低脂肪、低コレステロールの食事は、脳の健康を維持するための鍵です。この食事は脳内の血液循環を促進し、健康的な栄養素を提供し、ニューロンを保護し、PD の進行を遅らせることができます。
最後に、前向きな姿勢と適切な休息も、PD 患者の記憶力を向上させる鍵となります。 PD は体と心に一定の打撃を与えますが、楽観的な姿勢を維持して休息を取ることができれば、精神的および心理的ストレスを軽減し、記憶力をより良く維持することができます。
つまり、PD は記憶に影響を与えますが、変更できないわけではありません。適切な運動、食事、心理管理を通じて、PD 患者は一定レベルの認知能力と記憶を維持できます。私たちは記憶力を向上させる必要があることが分かります。カンクサは多くのユニークな効果を持つ伝統的な漢方薬素材であり、そのうちの 1 つが記憶力の向上であるため、カンクサは記憶力を大幅に向上させることができます。シスタンケの効果は、タンニン酸、多糖類、フラボノイド配糖体など、含まれるさまざまな有効成分によってもたらされます。これらの成分は、さまざまな方法で脳の健康を促進します。
たとえば、LRRK2 GS2019S 変異を持つ患者の hiPSC 由来ニューロンは、酸化ストレスに対する脆弱性の増加 170 や神経突起の長さと数の減少など、疾患に関連した細胞表現型を示しました。
他の例としては、ミトコンドリア機能不全および酸化ストレス形態を示す PARK2 変異を有する患者から得られた hiPSC 由来 DA ニューロン 172 および、α-syn 凝集体の顕著な上昇と蓄積を示す A53T 変異および SNCA 三重重複を有する hiPSC 由来ニューロンが挙げられます。
さらに、いくつかの研究では、LRRK2、174PINK1、175 SNCA、140、176、GBA177 などの変異遺伝子の修正を目的とした介入によってこれらの疾患の表現型が改善されました。このようなモデルは、新規薬剤標的の同定と検証における hiPSC テクノロジーの有用性を実証し、概念実証を提供します。遺伝子治療のアプローチに。
その後、さまざまな NDD 用の hiPSC 由来モデルがさまざまな共培養 2D および 3D 構成に拡張され、モジュール性と基礎研究および前臨床応用の可能性が広がりました。
hiPSC 由来 NDD モデルの現在の構成2D 単一および共培養細胞モデル
hiPSC 由来の単一細胞タイプで構成される 2D 培養物を利用したかなりの量の研究が、過去 10 年間に発表されています。これらの単一細胞型モデルは、脊髄性筋萎縮症 178,179、AD、PD、筋側索硬化症 (ALS)180 などの NDD における個々の細胞集団の役割を明らかにする上で有益であり (図 1)、さらに、より優れた研究を可能にしました。疾患関連遺伝子が生物学的レベルでどのように作用して細胞の摂動に影響を与えるかについての理解。
hiPSC 細胞モデルは、個々の細胞集団における遺伝的多型および変異の役割と、それらが疾患にどのように寄与または影響を与えるかをよりよく理解するために、アルツハイマー病研究に採用されています。 hiPSC ベースの AD モデルでは、Kondo et al.181
APP E693D変異を含むsADおよびfAD患者から得られたhiPSC由来ニューロンおよびアストロサイトにおいて、小胞体機能不全および酸化ストレスの増加に関連するAbオリゴマー蓄積の増加が観察された。 hiPSC 由来の 2D 個別モデルは、さまざまな神経細胞モデルにおける、AD の最大かつ最も複製可能な遺伝的危険因子である APOEε4 の遺伝的寄与を研究する上で大きな価値があることも示されています 182。
Lin ら 183 は、2D 培養を使用して、同質遺伝子型 hiPSC 由来 APOEε4 アストロ サイトが、同質遺伝子型 APOEε3 細胞と比較して、コレステロール蓄積と Ab42 の内在化に関連する遺伝子発現の大規模な変化を示すことを明らかにしました。これらの変化はいずれもアストロ サイトの重要な恒常性機能です。さらに、同質遺伝子型 ε4 星状細胞は、APOE を発現および分泌する能力の低下を示し、その結果、脂質付加が減少しました。
これらのモデルでは、Ab 分泌の亢進に加えて、ニューロンの長さと数の両方において神経突起の成長が亢進し、不同質の APOEε4 ニューロンも病原性の寄与であることが判明しました。183
Zhao らは、APOEε3 および APOEε4 対立遺伝子が同質の定型神経個体から得られた星状細胞培養物を生成する際に、APOEε4 星状細胞が健康な APOEε3 対照と比較して APOE 脂質化状態が低いことを発見し、このようなモデルから得られた洞察をさらに強調しました。
2D 共培養の使用により、個々の細胞集団および細胞間相互作用の状況における APOEε4 の研究、およびこれらが AD の発症にどのように寄与するのかを研究することも可能になりました。
上記の実験を拡張して、hiPSC 由来 APOEε4 アストロ サイトをニューロンと共培養すると、ニューロンの形態的および機能的完全性が損なわれ、同質遺伝子型 ε3 コントロールと比較して成熟の阻害が実証されました。161
異なる神経細胞とグリア細胞の間の相互作用は、AD と PD の発生と進行において重要な役割を果たしており、したがって、hiPSC 技術を活用して細胞間相互作用を模倣する in vitro モデルを確立し、細胞微小環境は非常に有益であることが証明されています。
2D 特異培養モデルと共培養モデルの利点は、細胞生存率の低下やミトコンドリア機能不全など、疾患関連細胞表現型に対するいくつかの PD 原因変異の寄与を研究する際にも同様に実現されています。
これは、LRRK2 G2019S 変異を持つ PD 患者由来の hiPSC 神経モデルが、α-syn レベルの増加、酸化ストレス応答に関与する遺伝子の上方制御、および H2O に対する感受性の増加を示した Nguyen らによる研究で最初に実証されました 170。{{ 6}} 酸化ストレスと細胞死を誘発します。
同様に、Sánchez-Danésら171は、LRRK2 G2019S変異を欠くPD患者hiPSC由来のDAニューロンにおけるオートファジーの変化を評価し、α-シンナンドオートファジー機能不全の上昇を観察した。
PSC 由来の共培養モデル系により、細胞相互作用がどのように病態生理学を支えているかについてのより深い理解が達成されました。例えば、hiPSC 由来の星状細胞は、ミトコンドリア毒素、ロテノンおよびシアン化カリウムへの曝露後に PD 患者から得られた共培養神経前駆細胞 (NPC) において保護効果を発揮することが示されており、これは分化欠損およびミトコンドリア機能不全の救済によって証明されています 184。
別の研究では、ニューロン-星状細胞の共培養を利用して、PDの原因となるLRRK2G2019S変異がニューロン-星状細胞のクロストークに及ぼす影響を調査しました。著者らは、コントロールのhiPSC由来DAニューロンと、G2019S変異を持つ患者由来のアストロサイトとの共培養が、DAニューロンにおける神経変性とα-synの蓄積を誘導したと報告した185。
この研究は、細胞間相互作用および疾患関連変異の病原性影響を及ぼす細胞タイプを明らかにするために、細胞タイプごとに遺伝子変異/変異のさまざまな組み合わせを検査する際の共培養の有用性を例示しました。
しかし、2D 共培養は、異なる脳細胞タイプ間の相互作用のための微小環境を形成し、脳の複雑さを 3 次元組織としてモデル化する能力が依然として先天的に制限されており、翻訳関連性において固有の障害を抱えています。
3D hiPSC 由来モデル
新しい技術により、研究者は、生化学的および生理学的に堅牢な共培養およびオルガノイドを含む、NDD の 3D hiPSC 由来モデルの生成および評価を開始できるようになりました。オルガノイド モデル。 3D 人間の脳オルガノイド モデルは、人間の脳の複雑な空間構成を in vitro モデルにできるだけ近づけることを目的としています。
hiPSC から得られるこれらの脳オルガノイドは、自己組織化され、自己パターン化する 3D です。全体的なエピゲノムおよび転写の特徴に加えて、186,187グルタミン酸に対する神経細胞の反応性、本能的な Ca2+ シグナル伝達、細胞成熟表現型の発達などの 3D オルガノイドモデルの生理学的特性も、ヒトの脳組織を厳密に反映していることが示されています。 .188–190
最近の研究では、AD および PD の 3D hiPSC 由来モデルが生成および特徴付けられており、再現性の高い方法で病理学的特徴を示すことが示されています。
例えば、Gonzalezら191は、プラーク様構造およびアミロイド形成特性を有するAbペプチドの進行性の蓄積、ならびにリン酸化タウおよびNFTの出現を示すAD脳オルガノイドモデルを開発した。
Linet al.183 は、ミクログリア様細胞を運ぶ同質遺伝子型 APOEε3- または APOEε4- を、AD 関連 APP 重複変異を含む hiPSC から培養したすでに確立された大脳オルガノイドに導入することでこれらの発見を拡張し、かなり長い突起形成を観察しました。 APOEε4 ミクログリア様細胞では APOEε3 コントロールと比較して、細胞外 Ab に対する感覚能力および応答能力が限られていることを示唆しています。
ごく最近、Zhao et al.192 は、AD 患者と異なる APOE 遺伝子型を持つ健康な対照から得た hiPSC を使用して脳オルガノイド モデルを作成しました。 APOEε4 オルガノイド モデルは、異なるドナーに由来する APOEε3 オルガノイドおよび APOEε4 系統のゲノム編集によって作成された同質遺伝子型 APOEε3 オルガノイド モデルと比較して、疾患関連の表現型を示しました。
オルガノイドモデルにおけるAPOEε4遺伝子型の悪影響は、シナプスの完全性の喪失、アポトーシスによる細胞死、Abおよびリン酸化タウの蓄積、および可溶性APOEレベルの上昇を含む主要なADの病理学的特徴を再現し、したがって、非fADをモデル化するためのシステムの適合性を実証した。
さらに、これらの結果は、AD における APOEε4 の病原性の役割と、AD の創薬可能な標的としてのその可能性をさらに裏付けるものである。192 同様に、Smitset al.193 は、LRRK GS2019 変異を含む PD 患者組織に由来する PD の機能的中脳 DA オルガノイドモデルを作製した。
このオルガノイドモデルはDAを産生および分泌し、中脳DAニューロンの量と複雑さの減少など、オルガノイドに関連する顕著な病理を首尾よく示した193。しかし、LRRK変異を修正するGTアプローチは、このモデルにおける疾患表現型の改善には不十分であった。
Bologninet al.194 はまた、LRRK2 G2019S 変異を持つ PD 患者に由来する 3D DA ニューロンモデルを確立しました。このモデルは、同系対照株と比較した場合、ミトコンドリア機能不全の兆候と形態の変化、DA 分化と分岐の複雑さの減少、若いニューロンにおける早期細胞死の増加を示しました。これらの混乱の一部は、LRRK2 阻害剤 2 (Inh2) の投与によって回復されました。
ただし、3D オルガノイド モデルの使用において報告されているさまざまな制限、特に実験間の変動に寄与する細胞増殖と分化の自発的かつ制御されない方法に関連するものに注意することが重要です。
オルガノイドモデルにおける自発的自己組織化への依存は、異種細胞の割合、空間的配向、疾患表現型などのモデル間の変動を引き起こす可能性があり、3D 共培養モデルやオルガノイドモデルでは再現性が大きな懸念事項となっています。195
しかし、最近の進歩により、3D オルガノイドモデルの再現性が向上しており 196、終末細胞の同一性にはばらつきが残っており 195 、継続的な進歩が期待されています。
共培養システム。最近のバイオテクノロジーの進歩により、hiPSC 由来細胞が共培養ベースのモデルで増殖できるようにする洗練された三次元足場の生成が可能になりました。これにより、特に細胞型、成熟、組成、および細胞の種類に関して、上記のオルガノイドと比較してより制御されたアプローチが容易になります。細胞の均一な曝露。197
既存の共培養ベースのモデルには、ALS 患者由来の運動ニューロンおよび神経筋接合部のモデル、既知の変異 (LRRK2194 など) を持つ PD 患者由来の 180 DA ニューロン、および 180 DA ニューロンが含まれます。神経炎症性アルツハイマー病環境をモデル化するニューロン、星状細胞、およびミクログリアの三細胞モデル198および骨格筋組織。199
これらのモデルは、NDD の発症において主要な役割を果たす、空間的な組織組織、細胞間および細胞マトリックス結合の役割を調査するための改良されたツールを研究者に提供します。 Blanchard et al.200による最近の研究では、AD血管関連病態を高い忠実度でモデル化するために、脳内皮細胞、星状細胞、および周皮細胞からなるBBBのhiPSC由来3D共培養モデルを構築した。
この 3D モデルは、APOEε4- 由来細胞における周皮細胞の重要な役割を明らかにし、NFAT カルシニューリン周皮細胞シグナル伝達の増加の結果として、Ab ペプチドと線維アミロイドの BBB 蓄積の増加を示しました。
Park ら 198 はまた、マイクロ流体プラットフォームでニューロン、アストロ サイト、およびミクログリアで構成される hiPSC 3D tri-cultureAD モデルを開発しました。これは、Ab 凝集体のリン酸化タウの蓄積や神経炎症の特徴などの特徴的な AD 特性を再現することに成功しました。ミクログリアの動員、一酸化窒素の放出、およびその後の酸化ストレス。
3D 共培養システムは、オルガノイド モデルで観察される前述の制限を克服することを目的としていますが、固有の欠点でもあります。現在の hiPSC 由来モデルは、血管新生の欠如、必要な栄養素の循環、代謝老廃物の除去など、表現しようとしている脳組織の重要な特徴を欠いた神経ネットワークを生成しており 201、生物学的に代表的な神経細胞とグリア細胞の割合の生成にばらつきがある3D オルガノイド培養を使用する上で議論の余地のない強みである集団、特徴。
さらに、3D 共培養モデルは人工的な足場と細胞の連続播種を必要としますが、オルガノイド モデルはより「自然に」開発されました。それにもかかわらず、hiPSC 由来共培養の使用により、研究者は AD および PD 疾患の特徴の生成における各細胞型の積極的な役割を研究できるだけでなく、異なる遺伝子型に由来する細胞の相互作用も研究することができ、hiPSC が代表する革新的なツールキットを強調しています。 NDD の分子研究。
HiPSC ベースの in vitro モデルの利点と限界については、次のセクションで詳しく説明します。
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