卵巣摘出マウスの骨代謝に対するシスタノシドAの治療効果

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要約

シスタノシドA(Cis A)から単離された活性フェニルエタノイド配糖体であるシスタンチェ・デゼルティコーラ Y・C・マーの治療におけるその可能な役割のために私たちの注意を受けている骨粗鬆症.本研究では、卵巣摘出(OVX)マウスモデルに対するシスAの効果を評価し、その根底にある分子作用機序を調べた。経口投与介入の12週間後、Cis A(20、40、および80mg / kg体重/日)は、OVXマウスに対して有意な抗骨粗鬆症効果を示し、骨強度、骨塩密度、および線維柱帯骨マイクロアーキテクチャの改善によって証明された。一方、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)、デオキシピリジノリン(DPD)、カテプシンKなどの骨吸収マーカーの活性が低下し、骨形成マーカーアルカリホスファターゼ(ALP)の生理活性が上昇した。機構的には、シスAは、活性化B細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー(NF-κB)およびホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/Akt経路の両方によって共有される上流分子であるTNF受容体関連因子6(TRAF6)の発現を阻害し、続いて核因子κBリガンド(RANKL)の受容体活性化剤のレベルを抑制し、NF-κBおよびアップレギュレートされたオステオプロテゲリン(OPG)の発現をダウンレギュレートし、 PI3KおよびAktは、Cis AがTRAF6媒介NF-kappaB不活性化およびPI3K/Akt活性化を介して卵巣摘出マウスにおいて抗骨粗鬆症活性を有していたことを意味する。まとめると、我々は、Cis AがTRAF6をダウンレギュレートすることによって、NF-κBの阻害とPI3K/Akt経路の刺激を調整して骨形成を促進し、骨吸収を防止するという新しい知見を提示する。これらのデータは、骨粗鬆症病気。

キーワード: シスタノシドA;卵巣摘出マウス;抗骨粗鬆症;トラフ6;ランクル

紹介

骨粗鬆症全身骨格の「サイレントキラー」は、近年、世界中で20億人以上の人々を苦しめる大きな健康被害となっています[1]。それは、骨形成に対する過剰な骨吸収に由来し、最終的に骨粗鬆症性骨折をもたらす低い骨量密度(BMD)およびマイクロアーキテクチャの悪化によって特徴付けられる[2,3]。今日、破骨細胞の分化および再吸収をブロックする薬剤の同定は、骨粗鬆症[4]、そして確かに多くの合成剤があります, 吉草酸エストラジオールとアレンドロネートナトリウムを含みます, 予防し、治療することができます骨粗鬆症.しかし、病気のための薬は理想からはほど遠いです。これらの薬物のいくつかは、子宮内膜および乳癌のリスクを高める可能性があり、また、高カルシウム血症、高カルシウム尿症など[5]などの副作用の程度を有し、臨床応用を制限する。したがって、千年以上にわたり、伝統的な漢方薬(TCM)、特に単離された生理活性化合物および画分を含む食用TCMは、アジア諸国で安全かつ効果的に、以下の様々な疾患を予防および治療するために広く使用されてきた。骨粗鬆症[6,7].

骨粗鬆症は、骨細胞形成の増加による骨吸収の増強として特徴付けられ、このプロセスは、造血単球の破骨細胞前駆体への関与を含み、破骨細胞前駆体は、リモデリングを受けている骨部位を標的とする多核破骨細胞を形成するために融合する[4]。骨芽細胞から分泌される重要な因子である核因子-κBリガンド(RANKL)の受容体活性化剤は、破骨細胞への単球分化を刺激する[8,9]。RANKLとその受容体RANKとの相互作用は、アダプターシグナルタンパク質TNF受容体関連因子(TRAF6)をリクルートすることによって、NF-κB、PI3K/Akt、カルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼを含む細胞内イベントのカスケードをもたらす。その結果、TRAP、カテプシンKおよびDPDを含むいくつかの破骨細胞関連マーカー遺伝子がアップレギュレートされ、骨吸収のプロセスが加速される。

フェニルエタノイド配糖体は、グリコシド結合を介してβ-グルコピラノース(アピオース、ガラクトース、ラムノース、キシロースなど)に結合している桂皮酸およびヒドロキシルフェニルエチル部分によって特徴付けられ、これらは薬用植物に広く分布している[10]。シスタノシドA(Cis A)は、活性なフェニルエタノイド配糖体である。シスタンチェ・デゼルティコーラ Y・C・マー.中国薬局方の記録によると、C. deserticolaは伝統的に腎臓陰欠乏症、筋力低下、腰椎衰弱などの治療に使用されており、フェニレタノイド配糖体はこのハーブの主な生理活性成分です[11]。TCMの「腎臓」理論に基づいて、腎臓は骨系を支配することができ、それは骨の発達と機能が腎臓の本質に依存することを意味し、この腎臓の本質は骨髄に変換して骨に栄養を与え、骨格の成長と修復を促進し、骨格を強化することができます[12]。C.デゼルティコーラは腎臓を強化することができるので、シスAは予防と治療ができると考えていました骨粗鬆症.したがって、本研究は、予防におけるシスAの可能性を検証するために設計された。骨粗鬆症卵巣摘出マウスモデルを用いて、骨形成および再吸収マーカー、ならびに関連する潜在的なメカニズムを、この薬剤の抗骨粗鬆症性生理活性を推定するために決定した。

業績

骨3点曲げ試験に対するシスAの影響

Cis Aによる治療が骨をより強くするかどうかを分析するために、我々は大腿骨を3点曲げ試験に供した。図1に示すように、骨折時に加えられた最大荷重は、卵巣摘出術(OVX)群の動物と比較して、20mg/kgおよび80mg/kgのCis Aで処置された動物において、それぞれ21.5%および22.0%高かった(p< 0.05).="" meanwhile,="" treatment="" with="" cis="" a="" also="" enhanced="" the="" bone="" stiffness;="" all="" of="" the="" cis="" a-treated="" mice="" showed="" significantly="" increased="" stiffness="" with="" data="" of="" 121.0="" ±="" 12.1="" (p="">< 0.05),="" 124.1="" ±="" 16.2="" (p="">< 0.05),="" and="" 127.7="" ±="" 9.6="" (p="">< 0.01),="" respectively,="" when="" compared="" to="" 102.2="" ±="" 10.7="" of="" the="" ovx="" mice.="" the="" results="" indicate="" that="" the="" increased="" bone="" strength="" in="" the="" ovx="" mice="" treated="" with="" cis="" a="" was="" due="" to="" an="" increased="" amount="" of="" bone="" and="" an="" enhancement="" of="" bone="">

骨マイクロアーキテクチャに対するシスAの効果

マイクロCTによって測定されたマウスの3次元骨マイクロアーキテクチャ(図2および表1)は、OVX群のマウスが偽群と比較した場合、骨梁面積および骨梁数の顕著な減少を示したことを直感的に示しており、卵巣摘出術が骨量密度(BMD、−46%)、骨塩分(BMC、 −66%)、組織ミネラル含量(TMC、−85%)、骨体積分率(BVF、−82%)、線維柱帯数(Tb.N、-76%)および線維柱帯分離の増加(Tb. Sp、+80%)は、12週間の手術後の総組織ミネラル密度(TMD)および線維柱体厚さ(Tb. Th)に何ら変化をもたらさなかった。

しかしながら、Cis Aで処置されたOVXマウスは、OVX群と比較して、用量依存的にBMD(+43%〜57%)、BMC(+65%〜73%)、TMC(+83%〜90%)、BVF(+80%〜88%)、Tb. Spのより大きな減少(−79%〜88%)およびさらなるTb.N(+73%〜82%)の増強をもたらした。TMDは卵巣摘出術の影響を受けていないようであったが、吉草酸エストラジオール(EV)による治療によって有意に増加した。

骨形成マーカーと再吸収マーカーの両方に対するシスAの影響

TRAP、DPD、カテプシンK、骨形成指標ALPおよび骨Glaタンパク質(BGP)を含む骨吸収マーカーに対するシスAの効果を図3に示す。卵巣摘出術の12週間後、OVX群におけるTRAP、DPD、およびカテプシンKの活性は有意に増加し、特にDPDはほぼ55.6%増加した。TRAPおよびカテプシンKは、偽群と比較して、それぞれ43.5%および38.1%増強された。12週間経口投与されたCis Aは、上記の骨吸収マーカーのすべて、特にDPDの活性をそれぞれ45.0%、TRAPを49.0%、カテプシンKを44.0%抑制するのに有意な効果を示す高用量(80mg/kg)を予防する顕著な可能性を示した(p< 0.01),="" as="" compared="" to="" the="" ovx="" group="" (figure="" 3).="" although="" an="" increasing="" trend="" of="" alp="" and="" bgp="" activities="" was="" demonstrated="" in="" the="" ovx="" group,="" no="" statistically="" significant="" changes="" were="" observed.="" however,="" a="" significant="" improvement="" of="" alp="" activity="" was="" observed="" in="" low="" and="" high="" cis="" a-treated="" groups="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group="" (p=""><>

TRAF6、NF-κB PI3K、Akt、OPGおよびRANKLのタンパク質発現レベルに対するシスAの効果

ウェスタンブロット解析により、偽群と比較して、OVX群のTRAF6、NF-κB、およびRANKLのタンパク質レベルが有意に増加したことが明らかになった(p< 0.05),="" while="" opg,="" pi3k,="" and="" akt="" were="" significantly="" decreased="" (figure="" 4).="" cis="" a="" (20="" mg/kg="" or="" 80="" mg/kg)="" significantly="" downregulated="" traf6="" expression="" (p="">< 0.05),="" followed="" by="" the="" rankl="" expression="" being="" decreased="" and="" opg="" increased,="" which="" means="" the="" opg/rankl="" ratio="" was="" upregulated.="" consequently,="" the="" signaling="" cascades="" of="" nf-κb="" were="" downregulated="" and="" pi3k/akt="" were="" upregulated="" by="" cis="" a="" treatment="" (p="">< 0.05).="" molecules="" 2017,="" 22,="" 197="" 5="" of="" 11="" 2.1.4.="" effects="" of="" cis="" a="" on="" protein="" expression="" levels="" of="" traf6,="" nf-κb="" pi3k,="" akt,="" opg,="" and="" rankl="" western="" blot="" analysis="" revealed="" that="" compared="" to="" the="" sham="" group,="" the="" protein="" levels="" of="" traf6,="" nf-κb,="" and="" rankl="" in="" the="" ovx="" group="" were="" significantly="" increased="" (p="">< 0.05),="" while="" opg,="" pi3k,="" and="" akt="" were="" significantly="" decreased="" (figure="" 4).="" cis="" a="" (20="" mg/kg="" or="" 80="" mg/kg)="" significantly="" downregulated="" traf6="" expression="" (p="">< 0.05),="" followed="" by="" the="" rankl="" expression="" being="" decreased="" and="" opg="" increased,="" which="" means="" the="" opg/rankl="" ratio="" was="" upregulated.="" consequently,="" the="" signaling="" cascades="" of="" nf-κb="" were="" downregulated="" and="" of="" pi3k/akt="" were="" upregulated="" by="" cis="" a="" treatment="" (p=""><>

議論

現在の治療選択肢の限界を考えると、骨粗鬆症病気、食品または天然の食用薬用植物からの代替物が必要である。TCMから効果的な抗骨粗鬆症薬を発見するための継続的な努力の一環として、我々は抗骨粗鬆症特性の効果を有する一連の抽出物、画分、および化合物を発見した[13,14]。シスタンチェ・デゼルティコーラ重要な古典的なTCMであり、腎臓欠乏症などの治療に好ましい安全性プロファイル[15]および広範な薬効を有することが見出された[16]。TCMの理論によると、腎臓を活性化させる効果を有するTCMは、通常、治療に使用されていました骨粗鬆症;フェニルエタノイド配糖体は、このハーブの主な生理活性成分であり、したがって、C. deserticolaに含まれるフェニルエタノイド配糖体が抗骨粗鬆症特性を有し得ることを示唆している。C. deserticola 抽出物がBMDの減少を有意に阻害し、OVXによって引き起こされる線維柱帯マイクロアーキテクチャの悪化を防ぐことができることが証明された[17]。in vitro実験では、ALP、骨形成タンパク質-2、オステオポンチンmRNAだけでなく、培養骨芽細胞の骨石灰化も有意に増加しました[18]。中国薬局方に公式に記録されたC. deserticolaの主要な生理活性成分であるエキナコシド[11]は、30〜270mg/kg体重/日の高用量で抗骨粗鬆症活性を示し[19]、さらにインビトロの結果は、MC3T3-E1サブクローン14細胞におけるOPG/RANKL比を増加させることによって骨再生を促進することができることを示した[20]。Cis AはC. deserticolaから単離されたフェニルエタノイド配糖体の1つであり、いくつかの報告により、この化合物が抗酸化活性[21]および抗炎症特性を有することが明らかになった[22,23]。最近発表された論文では、Cis AがマウスのCCl4とアルコール誘発肝毒性の両方に対して保護活性を示し、インビトロで初代培養マウス肝細胞におけるエタノール誘発損傷に対する保護特性も示したことが判明しました[24]。本研究では、卵巣摘出マウスモデルを用いて、シスAが低用量(20~80mg/kg体重/日)で抗骨粗鬆症活性を有し、TRAF6のレベルをダウンレギュレートし、RANKLおよびNF-κBの発現を抑制し、OPG、PI3K、およびAktを刺激することによってこの生理活性が発揮された結果となった。Akt のアクティブ化。

卵巣摘出術が引き起こす可能性があることはよく知られています骨粗鬆症BMD、生体力学的強度、骨質、および骨梁骨マイクロアーキテクチャの明らかな低下を伴うが、上記の変化は部分的にはエストロゲン欠乏症によるものである[25]。さて、現在のin vivo実験において、我々の研究は卵巣摘出術が誘導することを実証する。骨粗鬆症BMD、BMC、TMC、およびTb.Nを含む生体機械的強度および線維柱帯構造パラメータの有意な減少をもたらし、Tb. Spを増加させる。Cis Aの治療は、最大荷重および剛性を含む骨機械的特性を有意に改善し、BMDを増強し、OVX群のマウスと比較して骨線維柱帯マイクロアーキテクチャ構造パラメータの大部分を改善し、Cis AがOVXマウスにおける骨質および骨梁マイクロアーキテクチャの改善に有効であったことを示す。

総BMDに加えて、3点曲げ試験と骨梁マイクロアーキテクチャ測定は直接診断することができます骨粗鬆症ALPおよびBGPを含む骨形成マーカー、ならびにTRAP、DPD、およびカテプシンKを含む骨吸収指数も、シスAの関連する抗骨粗鬆症メカニズムを解明するために使用された。我々の研究では、OVX群マウスにおけるALP活性は有意でない増加傾向を示し、閉経後における骨代謝回転率の増加を示す[26,27]。骨粗鬆症;Cis A治療の高用量(80mg / kg体重/日)および低用量(20mg / kg体重/日)は、偽群と比較してALP活性の有意な増強を示したが、BGP活性はすべての治療群において卵巣摘出術の影響を受けないようであった。TRAP、DPD、およびカテプシンKはOVX群で有意に増加し、Cis A投与は3つの骨吸収マーカーすべてを著しく減少させた。上記のデータは、Cis Aが潜在的な抗骨粗鬆症活性を有していることを示唆しており、この効果は、骨吸収の抑制と骨形成の増加の両方を含む骨代謝の調節によって発揮された。

骨芽細胞と破骨細胞との間の調整は、骨格完全性の維持において重要な要素である。TRAPを発現する破骨細胞は、アクチン結合シーリングゾーンの形成を介して骨の表面に付着し、その中でカテプシンKなどのタンパク質分解酵素が放出され、再吸収ピットの形成につながる。骨芽細胞系譜の未熟細胞による骨細胞形成の調節は、RANKLおよびOPGによって媒介される[28]。OPGは、骨細胞形成のRANKL活性化を阻害し、それによって骨吸収を減少させるおとり受容体である。破骨細胞前駆細胞に重要なシグナルを提供するRANKLは、破骨細胞の形成を促進する腫瘍壊死因子リガンドファミリーの膜結合分子である。OPG/RANKL発現の比は、骨細胞形成活性の重要なパラメータであると考えられており、RANKLによって活性化されるシグナル伝達カスケードにはNF-κBおよびPI3K経路が含まれる[29]。破骨細胞形成に対するNF-κB経路の重要性は、マウスにおけるNF-κBの欠失が成熟破骨細胞の不在をもたらしたという事実によって実証される[30]。TRAF6は、新規抗骨粗鬆症薬の有望な標的として証明された。したがって、破骨細胞形成不全および重度の骨ペトロシスを示すTRAF6欠損マウスは、骨代謝におけるTRAF6の重要性を実証した。新たな証拠は、RANKL/RANK媒介シグナル伝達カスケードにおけるTRAF6の重要な調節機能を指摘している[4,31]。現在の研究のデータは、OVXマウスにおけるシスA処置が、TRAF6タンパク質発現レベルのダウンレギュレーション、RANKLの低下、およびOPG発現の増加をもたらし、それによって下流NF−κBのRANKL活性化を防止し、PI3K / Aktシグナル経路を活性化することを示し、シスAがTRAF6媒介NF−κB不活性化およびPI3K / Akt活性化による破骨細胞分化を阻害し、OPG / RANKL比を増加させることを示唆する、 その後、骨細胞形成を阻害し、骨形成を促進する。

参照

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