対側腎摘出術後の腎線維症に対するタイミングと虚血の影響

導入

の発生率急性腎障害(AKI) は近年世界中で劇的に増加しています [1]。 AKIは、臨床現場における臓器移植、灌流下での術後、出血、脱水、ショック、敗血症によって引き起こされる可能性があります[2]。最近の疫学研究や実験研究では、AKI の重症度、頻度、期間がその後の AKI の発生率と密接に関連していることが示されています。慢性腎臓病（CKD）。 AKI後の腎線維化はCKDを引き起こす可能性があり、さらには末期の腎臓病(ESKD) [3-5]、これは AKI と CKD が関連する症候群であることを示唆しています [6]。しかし、AKI から CKD への移行の根底にあるメカニズムは、数多くの実験研究や臨床研究にもかかわらず依然として不明です。動物モデルは、AKI が CKD を引き起こすメカニズムを研究するための重要なツールです。腎虚血再灌流障害（IRI）は AKI の主な原因の 1 つであり、両側 IRI（bIRI）モデル、無傷の対側腎臓を備えた片側 IRI モデルなど、IRI 誘発性 AKI のいくつかの動物モデルが開発されています [7]。 、同時対側腎摘出術を伴う uIRI モデル、および遅延対側腎摘出術を伴う uIRI モデル。

両方の腎臓の虚血性損傷が軽すぎる場合、長期的には重大な線維性変化が存在しないため、bIRI モデルの一貫性は低くなります。 AKIが重度すぎる場合、マウスは急性損傷段階で死亡する可能性があります。さらに、2 つの腎臓の損傷の小さな違いが、数週間後の慢性腎臓の病理に大きな違いをもたらす可能性があります [8,9]。同時に対側腎切除術を行う uIRI モデルは、反対側の腎摘出術により損傷した腎臓のみが残るため、bIRI モデルに似ています [10]。無傷の対側腎臓を備えた IRI モデルでは、虚血腎臓の線維化が重篤です [11、12]。このモデルは非常に一貫性があり、研究者による長期観察にとって信頼性が高くなります。ただし、損傷を受けていない反対側の腎臓が存在するため、推定糸球体濾過率 (eGFR)、血清クレアチニン (SCr)、血中尿素窒素 (BUN) の評価には使用できません [11-14]。上記の 2 つの uIRI モデルと比較して、遅延対側腎摘出術を伴う uIRI モデルはこれらの問題を克服し、AKI 後の長期観察と腎機能モニタリングの両方に使用できます。したがって、このモデルは AKI-CKD 移行の研究に適しています [15]。

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それにもかかわらず、異なる虚血状態および対側腎摘出術とuIRIの間の間隔は、AKI後のCKDの進行および重症度に重大な影響を与える可能性がある。これまでの研究は、虚血期間が AKI 後の腎線維症に及ぼす影響に焦点を当てており、虚血中の深部体温にはあまり注目していませんでした。たとえば、Skrypnyk et al. [12] は、水浴システムによって虚血温度を 38℃に制御し、虚血期間を 30 分間とし、uIRI の 8 日後に対側の無傷の腎臓を摘出しました。その結果、uIRI の 28 日後に虚血腎臓に重大な線維化変化が見られたことが示されました。同じ虚血期間で、Xiao et al. [8]は、虚血温度を37℃〜38℃に制御し、uIRIと対側腎摘出術との間の時間間隔を10日とした場合、uIRIの11日後に顕著な線維性変化が起こることを示した。コロンバロらのような一部の研究者は、 [14]およびLiら。 [16] は研究で虚血温度について言及していません。

一方、このモデルにおける対側腎摘出術とuIRIの間の時間間隔の影響を研究した人はほとんどいなかったため、研究室ごとに結果が大きく異なり、その後の実験にも劇的な影響を与えました。この研究では、対側腎摘出術とuIRIの間の時間間隔、虚血中の深部体温、虚血期間など、AKI後の腎線維化に影響を与える主な要因の影響を調査しました。私たちは、AKI CKD 移行を研究するための適切な動物モデルを作成するための参考資料を提供することを目的としました。

材料と方法 動物モデル

雄の C57BL/6J マウス (8 ～ 10 週齢、体重約 22 g、GemPharmatech Co., Ltd.、南京、中国) には、山西医科大学の動物実験センターで餌と水を自由に摂取させました。飼育条件は次のとおりでした:湿度40〜70%、温度23℃、空気清浄度クラス7、病原体が存在しない条件下での制御された12-時間の明暗サイクル、飼料のCo60照射、および精製水。この研究のすべての手順は、山西医科大学第二病院の動物倫理委員会によって承認されました（倫理番号：DW2022028）。

プロトコル

虚血期間、虚血中の深部体温、および対側の損傷を受けていない腎臓の切除タイミングがすべて、AKI およびその後の腎線維化の重症度に影響を与える可能性があることを考慮して、他の 2 つを固定して、上記 3 つの要因の影響を個別に調査しました。以下に示す 3 つの実験を行った。

プロトコール 1: 腎機能および AKI 後の線維症に対する対側腎摘出術と uIRI の間の間隔の影響を観察するために、左腎臓の虚血時間を 24 分に固定し、腎臓の間中核体温を 37℃に固定しました。その間虚血。右腎臓切除は、左腎臓 IRI 後、それぞれ 7 日目、10 日目、および 14 日目に実施されました (グループあたり n=8)。我々は、以前の研究[8、10、12、15]の結果と事前実験の結果に基づいて、虚血と腎臓切除の期間を決定しました。研究プロトコルについては、図 1(A–C) を参照してください。

プロトコール 2: AKI-CKD 移行に対する虚血中の深部体温の影響を観察するために、左腎臓の虚血時間を 24 分に固定し、左腎臓 IRI の 14 日後に右腎臓を摘出しました。中核体温は、それぞれ 36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、および 38℃に制御されました (グループあたり n=8)。研究プロトコルについては図 1(D) を参照してください。

プロトコール 3: AKI から CKD への移行に対する腎臓虚血期間の影響を観察するために、虚血中中核体温を 37℃に固定し、左腎臓 IRI の 14 日後に右腎臓を摘出しました。我々がこの時点を選択したのは、報告書[8、10、12、15]および我々の事前実験結果によれば、AKIからCKDへの典型的な変化である腎線維化が非常に明白であったためである。左腎臓の虚血時間は、それぞれ 21 分、24 分、27 分、および 30 分に制御されました (グループあたり n=8)。研究プロトコルについては図 1(E) を参照してください。

左腎臓のIRI後8週間ですべてのマウスを安楽死させた。左腎臓組織の一部は、その後のRT-PCRおよびウェスタンブロット分析のために70℃で保存し、他の部分は組織病理学的分析のために中性ホルマリンで固定した。血液サンプルは生化学検査のために眼窩後洞を介して収集されました。

図 1. 遅延対側腎切除術を伴う片側虚血再灌流障害 (uIRI) のプロトコル。 (A–C): 左腎臓は 0 日目に IRI を受け、右腎臓切除は虚血期間を考慮して異なる時点 (7 日目、1 日目 0、14 日目) に実施されました。腎虚血中は深部体温を 37℃に固定し、24 分に固定しました。 (D): 左腎臓は 0 日目に IRI を受け、右腎臓切除は虚血状態で異なる深部体温 (36 ℃、36.5 ℃、37 ℃、37.5 ℃、38 ℃) の下で行われました。左腎臓の時間を24分に固定し、左腎臓IRIの14日後に右腎臓を摘出した。 (E): 左腎臓は 0 日目に IRI を受け、右腎臓切除は、腎臓の間中核体温を 37℃ に固定して、異なる虚血期間 (21 分、24 分、27 分、および 30 分) で実施されました。虚血のため、左腎臓 IRI の 14 日後に右腎臓を摘出した。腎臓重量、腎機能、腎臓の組織学的損傷、および腎臓の線維化を56日目まで評価しました。

手術手順

手術前に、すべてのマウスは水を自由に摂取できる状態で 12 時間絶食させ、3% ペントバルビタール ナトリウム 50 mg/kg を腹腔内に注射しました。麻酔中、直腸温度は、異なる実験群でそれぞれ36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、または38℃に維持された。これを達成するために、マウスの背中を加熱パッド（CW{{10}}、BARBAROUS GROWTH、浙江省、中国）の上に置き、気道が確保されるように頭と首を伸ばした位置に置きました。目は遮るものがなく、処置中の乾燥を避けるために温かい生理食塩水ガーゼで覆われました。麻酔後、マウスの左背中の毛をバリカンで剃った。次に、手術領域の皮膚を 75% アルコール綿棒できれいに拭きました。一般に、毛を剃るとマウスの体温は下がります。手術は深部体温が一定になったときに行われ、所要時間は約 15 分です。左腎臓は、マウスの左背部皮膚を正中線の隣０．５ｃｍおよび胸郭の下端で０．５ｃｍ切断することによって見ることができた。次に、片手で左腹部を圧迫して左腎臓を体腔の外に出し、鈍く湾曲した鉗子で腎臓を持ち上げ（腎臓を損傷しないように注意）、腎臓茎を取り外して素早くクランプし、クランプした腎臓を配置しました。腎臓は皮膚の下にあり、保温と保湿を保ちます。成功した虚血は、腎臓の色が赤から暗紫に徐々に変化することを特徴とし、異なる実験グループにおいて、それはそれぞれ21分、24分、27分、および30分続いた。腎臓の色は、クランプを解除してから 2 ～ 5 分以内に赤色に戻りました。次に、腹腔を層状縫合糸で閉じました。異なる実験群において、uIRI後7日目、10日目、14日目に右背部皮膚と筋肉をそれぞれ切開し、右腎臓を切除した。次に、標準的な縫合糸で傷を閉じます。各手術の後、手術中の体液損失を補うために、500μLの生理食塩水を腹腔内に注射した。同時に、マウスは完全な意識を得るまで約 2 ～ 3 時間加熱パッド上に置かれ、その後収容ケージに移されました。偽群は腎臓茎をクランプせず、残りの外科手術はuIRI群と同じであった。すべての外科手術は、このモデルの手術において 2 年以上の経験を持つ同一人物によって行われました。

腎機能検査

SCrレベルは、クレアチニンキット(Jaffe Method、100020170、Biosino Biotechnology and Science)によって測定した。 BUN レベルは尿素キット (ウレアーゼ-グルタミン酸デヒドロゲナーゼ法、Biosino Biotechnology and Science) によって測定されました。

腎臓重量アッセイ

排尿後、マウスの体重を精密電子秤で測定した。新鮮な腎臓をあらかじめ冷却した生理食塩水で3回洗浄し、腎臓上の余分な水を濾紙で吸い取りました。腎臓のカプセルを氷上で剥がし、腎臓の重量を直ちに測定した。体重に対する腎臓重量の比を計算して、修正腎臓重量をmg/gで評価した。

ヘマトキシリン・エオシン (HE) 染色と腎損傷スコア

中性ホルマリン固定腎臓組織を日常的に脱水し、パラフィンに包埋し、切片化し（３μｍ）、ＨＥ染色して腎臓組織の損傷を観察した。各切片の腎皮質のランダムに選択した 10 個の領域を倍率 400 の光学顕微鏡で撮影しました。 2人の病理学者が糸球体と尿細管の損傷を別々に採点した。尿細管損傷は、次の基準を使用して {{20}}-4 のスケールで採点されました [17]: 0、損傷なし。 1、腎臓領域の 1 ～ 25% に影響を及ぼします。 2、腎臓領域の26〜50%に影響を及ぼします。 3、腎臓領域の 51 ～ 75% に影響を及ぼします。 4 は腎臓領域の 75 ～ 100% に影響を及ぼします。尿細管損傷の程度は、腎尿細管損傷の面積を計算することにより半定量的に評価した。糸球体損傷は、以下の基準を使用してメサンギウム拡大または硬化の面積パーセントに従って 0 ～ 4 のスケールで評価およびスコア付けされました [17]: 0、正常な糸球体。 1、面積の 1 ～ 25% が負傷。 2、面積の 26 ～ 50% が負傷。 3、面積の51～75%が負傷。 4、面積の 76 ～ 100% が負傷。最終的な糸球体損傷スコアは、= 0 (% グレード 0 糸球体) þ 1 (% グレード 1 糸球体) þ 2 (% グレード 2 糸球体) þ 3 (% グレード 3 糸球体) þ 4 (% グレード 4 糸球体)。マウスあたり 50 を超える糸球体が記録されました。

マッソンのトリクローム染色

中性ホルマリン固定腎臓組織を日常的に脱水し、パラフィンに包埋し、切片化し（３μｍ）、マッソントリクロームで染色して腎線維症を観察した。マッソンのトリクローム染色スライスでは、腎臓皮質の重複しない 20 の領域が 200 倍で捕捉されました。自動計測・解析には画像解析ソフトウェアImage-Pro Plusを使用しました。線維化領域のパーセンテージは、腎臓の間質性線維症のレベルを把握するために使用されました [8]。

RT-PCR

各群の腎臓組織からTrizolを用いて全mRNAを抽出し、その濃度を測定した後、cDNAに変換した（Taka Reverse Transcription Kit）。 Taqman 蛍光法 (TB Green Premix Ex Taq II リアルタイム RT-PCR) を使用して、腎臓組織におけるフィブロネクチン (FN) およびコラーゲン I (COL-I) RNA 発現を定量しました。 FN (順方向: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 および逆方向: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30) および COL-I (順方向: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} およびその逆: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (中国、上海の Sangon Biotech Co., Ltd. 提供)。増幅条件は次のとおりです。95℃で30秒間、95℃で5秒間、60℃で30秒間、40サイクル。 95℃で10秒間、65℃で5秒間、および95℃/5℃。生成物の増幅曲線と溶解度曲線を分析した後、相対的なmRNAレベルを比較CT法（2-DDCt）によって決定しました。内部参照として 18SrRNA (順方向: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30、逆方向: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30) を使用します。

ウェスタンブロット

ラジオ免疫沈降アッセイ (RIPA) 溶解バッファーを使用して腎臓組織を溶解し、タンパク質の濃度を BCA 法によって測定しました。勾配ゲル電気泳動を使用して、50 μg のサンプルからタンパク質を分離しました。次に、タンパク質をニトロセルロース膜に転写しました。 5％無脂肪乳で2時間ブロッキングした後、α-平滑筋アクチン（α-SMA）に対するウサギ抗マウスモノクローナル抗体（1:1000、No.19245、Cell Signaling Technology）を用いて膜を4℃で一晩ブロットした。 ）、FN（1:1000、No.ab2413、ABCam）、またはCOL-I（1:1000、No.72026、Cell Signaling Technology）。翌日、膜を室温で0.5時間再び温めた。 TBSTで洗浄した後、メンブレンをHRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG(HþL)(1:1000、No.BA1054、BOSTER Biological Technology)とともに2時間インキュベートしました。再度TBSTで洗浄した後、超高感度ECL化学発光試薬で染色し、イムノブロットを可視化しました。 β-アクチンは内部標準と同じ膜上で測定されました。タンパク質発現は、β-アクチンに対する標的タンパク質の相対的な発現を定量することによって決定されました。

データと統計分析

検査されたすべてのデータは、平均 ± 標準偏差として表されます。 2 つのグループ間の比較は、独立した t 検定によって行われました。複数のグループ間の比較は、データ分布が正規で分散が均一である場合には一元配置分散分析によってアクセスされ、分散が不均一である場合にはウェルチ分散分析を使用して統計的有意性を評価し、その後、多重比較についてはテューキーの事後検定を使用しました。すべての統計分析は、GraphPad Prism 8.0 ソフトウェアによって実行されました。 p < 0.05 は統計的に有意であると考えられました。