シスタンチェ・デゼルティコーラの全配糖体は、MCAO/RラットのNrf-2/Keap-1経路を介した神経血管再生を誘導することにより、神経機能回復を促進する

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福建王 , 瑞燕李 , 鵬飛桂 , 陳建平 , 九呉 智 , 永江

バックグラウンド：伝統的な漢方薬のシスタンチェ・デゼルティコーラは、心血管疾患および脳血管疾患に有効であることが報告されている。しかしながら、虚血性脳卒中の保護のためのその活性成分は明らかではない。私たちは、C. デゼルティコーラ虚血性脳卒中およびその潜在的なメカニズムに対して。メソッド：我々は、抽出物の脳保護効果を調査したC. デゼルティコーラ、中大脳動脈閉塞再灌流(MCAO/R)のラットモデルにおける全配糖体(TG)、多糖類(PSs)、およびオリゴ糖(OS)。2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色を用いて脳梗塞体積を評価し、血液脳関門(BBB)透過性を評価するためにエバンスブルーアッセイを採用した。次いで、CD31、a−SMA、PDGFRb、SYN、PSD95、MAP−2、ZO−1、クローディン−5、オクルジン、キープ−1、およびNrf−2の発現をウェスタンブロッティングまたは免疫蛍光を用いて分析し、活性MDA、SOD、CAT、およびGSH−Pxをキットを用いて分析した。業績：TGs治療は、モデル群と比較して、神経学的欠損スコアおよび梗塞量を著しく減少させ、血管新生および神経リモデリングを促進し、血液脳関門の完全性を効果的に維持した。さらに、TGはMDAレベルを有意に低下させ、脳内の抗酸化活性(SOD、CAT、およびGSH-Px)を増加させた。一方、TGsはKeap−1発現を著しくダウンレギュレートし、Nrf−2核移行を促進した。それどころか、PS群およびOS群に対して保護効果は観察されなかった。結論：TGsは、C. デゼルティコーラMCAO/R誘発性脳損傷に対して、および保護は主にNrf-2/Keap-1経路を介して行われる。

キーワード: シスタンチェ・デゼルティコラ, 脳損傷, 全配糖体, 多糖類, オリゴ糖, Nrf-2/Keap-1経路

紹介

脳卒中は、世界の死と障害の主な原因であると考えられています(Donnan et al., 2008)。すべての脳卒中症例のほぼ87%が虚血性脳卒中によって引き起こされる(Ovbiagele and Nguyen-Huynh、2011)。現在、虚血性脳卒中治療に使用される最も効果的な薬剤および唯一のFDA承認薬は、組換え組織プラスミノーゲンアクチベーターである。しかし、多数の脳卒中患者が、その狭い治療時間枠および出血性合併症の重篤なリスクのために、この薬剤に反応しない(Lee et al., 2012;Schellinger and Kohrmann, 2014)。血栓溶解治療の主な課題は虚血/再灌流(I/R)損傷であり、これは脳損傷および機能破壊の主な原因と考えられている。脳虚血後の再灌流は、脳出血のリスクを高め、神経血管損傷をもたらし、血液脳関門を損傷する過剰な活性酸素種(ROS)を産生する(Alluri et al., 2015)。いくつかの研究は、BBBの破壊が虚血性脳卒中の病因の主な原因であることを確認している(Cao et al., 2016b)。

BBBは主に内皮細胞、周皮細胞、アストロサイト、ニューロン、および基底膜からなる。BBBの中核成分は、タイトジャンクションによって結合された脳微小血管内皮細胞であり、したがって、外因性分子を脳内に制限する。タイトジャンクション、特にオクルージン、クローディン-5、およびゾヌラオクルーデン-1(ZO-1)の病理学的変化は、虚血性脳卒中中のBBB機能、特にバリア透過性に有意に影響を及ぼす(Liu et al., 2014;Hu et al., 2018;Liu et al., 2019).I / R期間中、過剰なROSは脳ニューロンの直接的な損傷につながる主な要因の1つです(Ding et al., 2014)。ROSの過剰産生は、特定の接合部の分解およびBBB破壊をもたらし、その結果、外因性分子がBBBを介して脳に入り込み、脳損傷の悪化をもたらす(Cheon et al., 2016;Zhang Q. Y. et al., 2017).したがって、抗酸化物質によるBBBの保護は、再灌流傷害を防止する潜在的な方法とみなされてきた。

BBBの分解に加えて、I / Rは神経血管損傷およびニューロン死をもたらし得る(Jung et al., 2010)。脳卒中中、神経細胞死の増加は酸化ストレスに起因する可能性があり(Chi et al., 2018)、ROSが脳卒中の重症度および神経学的損傷を悪化させることが多くの研究によって示されている(Kondo et al., 1997;Crack et al., 2001;Crack et al., 2006).臨床試験では満足のいく結果が得られていないが、神経保護は依然として急性虚血性脳卒中の治療のための有望な戦略である(Moretti et al., 2015)。したがって、脳卒中を治療するのに有効な神経保護薬を見つけることは、脳卒中患者にとって有益である。

伝統的な漢方薬(TCM)は、身体の内部不均衡(Gaire、2018)に対して介入するための措置を講じています。虚血性脳卒中の複雑な病因のために、TCMおよびその活性成分の多因子効果は、脳卒中の治療において重要な役割を果たす。Cistanche deserticola Y. C. Maは、モンゴルと中国北西部の乾燥または半乾燥地域に広まっており、中国で1,000年以上にわたり、物忘れやうつ病などのさまざまな病気の治療に広く使用されているTCMハーブです。モダン薬理学的研究は、粗抽出物がC. デゼルティコーラ学習および記憶機能の増強、神経保護、免疫力の増強、抗酸化、抗老化、および抗疲労効果(Ko and Leung、2007;Wang et al., 2012;Li et al., 2015).C. deserticolaの化学分析は、その主な構成がフェニルエタノイド配糖体、イリドイド配糖体、多糖類、およびオリゴ糖を含むことを示した(Jiang and Tu、2009)。しかし、脳保護のためのC.デゼルティコーラの活性成分はあまり明確ではありません。C. deserticolaの神経保護特性は、脳卒中やうつ病などの認知関連疾患、ならびにアルツハイマー病におけるその治療可能性を示唆している(Wang et al., 2017)。しかし、その影響に関する研究C. デゼルティコーラその活性成分および作用機構を含む脳卒中において、非常に限られている。今回の研究では、C. deserticolaからの3つの抽出物、全配糖体(TG、フェニルエタノイド配糖体、および他の配糖体)、多糖類(PSs)、およびオリゴ糖(OS)が脳I/R損傷に及ぼす保護効果を調べた。我々の知見は、の正確な臨床応用に貢献する可能性がある。C. デゼルティコーラ虚血性脳卒中療法の候補剤を提供する。

材料と方法

化学薬品および試薬

Cistanche deserticolaの茎は、内モンゴルのアラシャンから購入され、著者の一人によって同定された(P.-F.Tu).TG、PSs、およびOSは、以前に報告された方法に従って調製された(Gao et al., 2015)。TGsの定量分析は、前述のように高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により行い(Li et al, 2019)、そのクロマトグラムを図1に示す。TGsの主成分は、エキナコシド、チューブロシドA、アクテオシド、イソアクテオシド、および2'−アセチルアクテオシドである。それらの含有量は、それぞれ163.05 mg / g、4.125 mg / g、41.66 mg / g、22.655 mg / g、および12.045 mg / gである。PSおよびOSの内容物は、HPLCおよびフェノール硫酸分析によってそれぞれ決定されるように、それぞれ69.42%および65.24%である(Zhang A. et al., 2018;Shi et al, 2019).

エキナコシド(A0282)、チューブロシドA(A0942)、アクテオシド(A0280)、イソアクテオシド(A0281)、および2'-アセチルアクテオシド(A0943)の標準参照は、成都マストバイオテクノロジー(中国、四川省)から購入した。すべての規格の純度は98%以上です。Nisslの染色H&Eキットは、ボスター(中国武漢)から購入しました。エダラボン(T0407-1)はターゲットモル(中国・上海)から購入した。ウサギ抗ラットMAP−2(ab32454)、Nrf−2(ab31163)、PDGFRb(ab32570)、Keap−1(ab66620)、およびマウス抗ラットCD31(ab24590)はAbcam Inc.(米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)から購入した。ウサギ抗ラットClaudin5(BS1069)、ZO-1(BS9802M)、およびオクルジン(BS72035)は、バイオワールドテクノロジー(中国、南京)から購入しました。Cell Signaling Technology Inc.(ボストン、マサチューセッツ州、米国)は、ウサギ抗ラットシナプシン−1(SYN、5297T)、PSD95(3450T)、a−平滑筋アクチン(a−SMA、19245T)の供給源であった。GAPDH(HRP-60004)は、Proteintech Group, Inc.(米国シカゴ)から購入されました。二次抗体は、中山ゴールデンブリッジバイオテクノロジー(中国、北京)によって供給された。ヘキスト33258は、Beyotime(江蘇省、中国)から入手しました。

動物

Sprague-Dawleyラット(雄、体重250〜300g)は、Vital River Laboratory Animal Technology(中国、北京)から入手し、12時間の明暗サイクルで保たれたエアコン付きの部屋に収容された。全ての動物実験は、動物研究ARRIVEガイドラインにより実施した(Kilkenny et al., 2010;McGrath et al., 2010)、北京大学健康科学センター(LA2019123)の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。

動物実験プロトコル

ラットを、前述のようにMCAO/Rに供した(Wang et al., 2018)。簡単に説明すると、左総頚動脈(CCA)、外頸動脈(ECA)、および内頸動脈(ICA)を露出させ、ECAからICAに3-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を挿入し、中大脳動脈(MCA)に到達した。MCA閉塞の1.5時間後、フィラメントを除去することによって再灌流をシミュレートした。外科的処置の間、すべてのラットの体温は37.0°Cに維持された。

薬物投与

ラットを、記載されているようにSPSSソフトウェアバージョン22.0を用いて無作為に6つの群に分離した(Jiang et al., 2014):正常群(NOR);モデルグループ (MOD);エダラボン群(陽性薬物、6mL / kg、EDI);TGs群 (280 mg/kg, TGs);PS群(280 mg/kg、PSs)、およびOS群(280 mg/kg、OS)。TG、PS、および OS は、MCAO/R の後、14 日間、1 日に 1 回管理されました。NORおよびMOD群を正常な生理食塩水で処理した。動物番号を表1に示す。

体重の測定と修正神経学的欠損スコア(mNSS)

体重は、ADVENTURE™デジタルスケール(米国ニュージャージー州オーハウス)を用いて14日目にモニターした。mNSSは、FJ Wang(Wang et al., 2018)によって記述された方法に従って評価され、若干の改訂が加えられた。

2, 3, 5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色

梗塞体積は、前述のようにして測定した(Wang et al., 2015)。要するに、脳は7つの等間隔の冠状ブロック(2mm)に切片化された。これらの切片を2%TTC(中国・北京・クーラベル)で37°Cで15分間染色した。梗塞体積(%)=(同側虚血性半球体積−対側虚血性半球体積)/対側虚血性半球体積×100である。

ニッスルおよびH&E染色

ラットを深く麻酔し、その後、頭蓋骨から脳全体を急速に除去し、4%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、パラフィンワックスに包埋し、厚さ7μmのスライスに切片化した。切片をNisslおよびH&Eで染色した。この研究では、6つのランダムな200×200μmフィールドを、各組織標本に光学顕微鏡で捕捉した。Nisslの遺体の数は、IPPソフトウェアバージョン6.0(Media Cybernetics、Bethesda、米国)でカウントされました。

エバンスブルーアッセイ

ラットに、MCAO/Rの後に2%EB(Coolaber Science & Technology Co., LTD)を注射した。2時間後、ラットを麻酔し、その後、脳全体を急速に除去し、アセトン中でホモジナイズした。上清を、800TS吸光度リーダー(BioTek、米国)によって620nmで分析した。

カタラーゼ(CAT)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、マロンジアルデヒド(MDA)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-Px)の活性の測定

すべての血清サンプルを4,000 × rpmで4°Cで15分間遠心分離し、その後分析して、製造元の指示に従ってMDA、CAT、SOD、およびGSH-Pxの活性を検出しました(江蘇省梅明安工業有限公司、中国)。

ウェスタンブロッティング分析

各ラットから採取した脳組織(100mg)をホモジナイズし、RIPA溶解バッファーで溶解し、BCAキット(北京トランスジェンバイオテック社製)を用いてタンパク質濃度を検出して分析した。組織総タンパク質を10%SDS−PAGEゲルにロードし、ニトロセルロース膜上に転写した。膜を5%スキムミルクを用いてブロッキングし、次いで4°Cで一次抗体と共に一晩インキュベートした。 次いで、メンブレンを二次抗体と共にインキュベートした。ウェスタンブロット分析は、コダックデジタルイメージングシステム(5200 Multi、タノン、中国)を使用して分析した。

免疫蛍光分析

CD31、a−SMA、ZO−1、クローディン5、オクルジン、PDGFRb、SYN、PSD95、MAP−2、Nrf−2、およびKeap−1についての免疫蛍光染色を行った。Nrf−2、CD31、a−SMA、ZO−1、クローディン5、オクルジン、PDGFRb、SYN、PSD95、MAP−2、およびKeap−1に対する一次抗体を、それぞれ1:200および1:100に希釈した。Alexa Flur 488マウス抗ウサギIgGおよびローダミン(TRITC)ヤギ抗ウサギIgGの二次抗体を、いずれも1:200に希釈した。核はヘキスト33258によって染色された。画像は、Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System(PerkinElmer、米国)を用いて撮影した。タンパク質発現を、IPPソフトウェアバージョン6.0を用いて解析した。

統計分析

すべてのデータは、平均±として記載され、SPSSソフトウェアバージョン22.0は統計分析のために実行された。一元配置分散分析は、異なるグループを比較するときに使用されました。P< 0.05="" was="" considered="" to="" be="" the="" statistical="">

業績

TGはMCAO/Rラットの体重を増加させ、脳損傷を減少させる

TG、PSs、Oss、およびEDIによる14日間の治癒後、I/Rラットの体重、神経学的欠損、および梗塞量を評価した。その結果、MOD群では体重が大幅に減少し、TG、PSs、EDI群では体重が減少していることが分かりました(図2A)。神経学的欠損スコアは、EDIおよびTGによって実質的に低下した(図2B)。NOR群ラットの脳切片は真っ赤で梗塞がなかったが、MOD群のラットは大きな同側性脳梗塞を示した。TGs治療後、梗塞容積は有意に減少した(図2C、D)。PSsおよびOSs治療は、上記の指標に明らかな影響を示さなかった。上記のデータは、TGがI/Rによる脳損傷を顕著に緩和できることを示したが、PSおよびOSはそうできなかった。

TGはMCAO/Rラットの病理組織学的損傷を改善する

TG、PSs、OS治療が病理組織学的損傷に及ぼす影響のいくつかを決定するために、病理学的損傷を明らかにするためにH&E染色が行われた。NOR群の脳の組織形態学的構造は規則的に配列された。TGs群の形態変化は、MOD群の形態変化よりも僅かであった。しかしながら、PSsおよびOSs処置群では、形態変化の有意な改善を示さなかった(図3)。

TGは、I/R誘発ラット後のニューロン損傷を減弱させる

Nissl染色は、虚血領域の半影におけるニューロンの組織病理学的変化を示した。図4に示すように、正常なニューロンは、明瞭な核小体と無傷の構造を有していた。MOD群では、ニューロンは細胞間空間を拡大していた。ニッスルの遺体は姿を消し、縮み、深く染まった。しかし、これらの変化は、EDI、TG、およびPSs群ではめったに観察されなかった。これらの結果は、TGおよびPSが虚血/再灌流誘発ニューロン損傷を有意に減弱させることができることを示した。

TGはI/R処理ラット後のBBB破壊を減衰させる

エバンスブルーアッセイは、BBB透過性の変化を研究するための古典的な方法である。実験結果は、MOD群ではエバンスブルーの増加が観察されたが、TGおよびEDI処理ラットではエバンスブルーが有意に減少したことを示した。さらに、PSs療法群とOS療法群の間に有意差はなかった(図5)。これらの結果は、TGがBBB破壊を有意に減衰させる可能性があることを示唆した。

TGはI/R損傷ラットの血管新生を促進する

より最近の研究は、血管新生が急性虚血性脳卒中後の神経学的機能回復および予後転帰において重要な役割を果たすことを示している(Yuen et al., 2015)。血管新生に対するTG、PSs、およびOSの効果を評価するために、CD31およびa−SMAを使用して毛細血管数を定量化した。免疫蛍光染色は、MOD群が、正常ラットと比較して、I/Rラットの虚血領域の半影においてCD31(図6A、B)およびa-SMA(図6C、D)の発現の顕著な減少を引き起こしたことを示した。この結果は、I/Rが虚血性半球の皮質半影に血管損傷を引き起こす可能性があることを示した。しかしながら、TGsおよびEDI処置は、CD31およびa−SMAの発現の増加によって示されるように毛細血管密度、血管新生、および動脈形成を著しく増加させた。これらの結果は、TGsがI/Rラットの虚血性半影において血管新生を促進する可能性があることを示唆しているが、PSおよびOSはそうできなかった。

TGsはI/R傷害ラットにおけるタイトジャンクションタンパク質の発現を増加させる

BBB破壊は、脳水分含有量および組織の腫脹を上昇させ、脳損傷につながる可能性がある。タイトジャンクションタンパク質はBBBの重要な構造成分である(Tenreiro et al., 2016;Jiang et al., 2018).脳卒中後のTG、PSs、およびOS治療がBBBの完全性に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ZO-1、クローディン-5、およびオクルジンの発現を免疫蛍光分析によって実施した。結果は、クローディン-5、オクルージンおよびZO-1の発現がMOD群において目に見えて減少したことを示した。しかしながら、それらはTGs投与の14日後に実質的に増加した。PS群およびOS群は、これらのタンパク質発現に有意な変化を示さなかった(図7)。これらのデータは、TGがタイトジャンクションタンパク質発現を調節し、おそらくI / R損傷後にBBB完全性を維持できることを示した。TGsはI/R損傷ラットの毛細血管上の周皮細胞カバレッジを増加させる毛細血管上の周皮細胞カバレッジはBBBの完全性を維持する上で重要な役割を果たしている(Armulik et al., 2010;Daneman et al., 2010).したがって、我々は、TG、PSs、およびOSs治療によって周皮細胞カバレッジを増加させることができるかどうかを試験した。免疫蛍光強度解析結果は、PDGFRbおよびCD31発現の両方がMOD群において劇的に減少したことを示した。I/RラットへのTGsの投与は、PDGFRbおよびCD31の発現強度を有意に回復または増加させたが、PSおよびOSs治療群において差は認められなかった(図8)。したがって、TGsの治療は、周皮細胞の被覆率を有意に増加させることができる。これらの知見は、TGがI/R後にBBBの完全性を維持できることをさらに確認した。

TGはI/R損傷ラットの神経リモデリングを促進する

多くの研究によると、脳卒中後の神経新生は機能回復を有意に改善することができる(Grefkes and Ward、2014;Zhang et al., 2019).シナプトフィジン(SYN)、シナプス後密度95(PSD−95)タンパク質、および微小管関連タンパク質2(MAP−2)を、皮質の虚血性半影におけるニューロン可塑性を調べるためのマーカーとして使用した。I/R損傷ラットの神経新生に対するTG、PSs、およびOS治療の効果を評価するために、SYN、PSD95、およびMAP-2発現の免疫蛍光およびウェスタンブロットを実施した。図9および10に示すように、再灌流14日後のI/RラットにおけるSYN、PSD95、およびMAP-2発現レベルは、NORラットと比較して減少したが、TGおよびPSの治癒は、それらの発現レベルを有意に上昇調節する可能性がある。OS群はMOD群と比較して大きな変化はなかった。データは、TGsおよびPSsの治癒がI / R損傷後の神経リモデリングを劇的に促進することができたことを示した。

TGは、I/R傷害ラットにおけるNrf-2およびKeap-1発現を変化させる

酸化ストレスはI/R傷害における主要な病原性メカニズムである(Ya et al., 2018;Yu et al., 2018).これらの研究は、Nrf-2が抗酸化応答のマスターレギュレーターであることを確認した(Thompson et al., 2015)。I/R損傷後のNrf-2およびKeap-1媒介酸化応答を調べるために、我々はKeap-1の細胞質発現ならびに核移行を評価した。一方、I/R損傷ラットの脳組織におけるNrf-2の発現もアッセイされた(図10および11)。免疫蛍光解析によれば、Nrf-2は主にNOR群において細胞質に位置することがわかった。TGs群では、細胞質局在化におけるNrf-2の発現はダウンレギュレートされたが、核内ではアップレギュレートされ、Keap-1発現の低下も観察された。データは、TGの脳保護がNrf-2およびKeap-1の変調と関連している可能性があることを示した。

TGはI/R損傷ラットの脳組織酸化ストレスを減弱させる

TGsの抗酸化効果を確認するために、SOD、CAT、GSH-PX、およびMDAの活性をI/R傷害ラットで評価した。図12では、MDAの含有量がMOD群で顕著に増加し、同時に、正常ラットと比較して、SOD、CAT、およびGSH-Pxの活性が低下した。逆に、TGs治療は、MDAの含有量の有意な減少およびSOD、CAT、およびGSH-Pxの活性の増加をもたらした。これらの結果は、TGsの抗酸化活性をさらに確認した。

議論

多くの研究は、TCMがC. デゼルティコーラ広範な生物学的活動、例えば学習能力、記憶能力、および免疫力を高める(Dong et al., 2007;江と火, 2009;Wang et al., 2017;Xia et al., 2018).しかしながら、神経保護のためのC. deserticolaの活性成分は不明のままである。現在の作業は、アクティブなコンポーネントをスクリーニングすることを目的としていますC. デゼルティコーラMCAO/Rモデルの虚血性脳卒中に対して。C. deserticolaからの3つの抽出物(TG、PSs、およびOS)を用いて、MCAO/Rラットに対するそれらの効果、ならびに可能なメカニズムを評価した。

脳卒中は一般的な急性脳血管疾患である。疫学研究は、脳卒中が女性よりも男性でより一般的であることを示している(Sealy-Jefferson et al., 2012;Guzik and Bushnell, 2017)。したがって、我々の実験では、雄ラットを試験に採用した。我々の結果は、I/R誘導が酸化ストレスおよび梗塞体積を加速させ、BBBを破壊し、神経および脳血管損傷を引き起こすことを証明した。スクリーニング後、TGsは梗塞量を減少させ、神経リモデリングおよび血管新生を促進することが見出された。さらに、TGはI/R損傷後にBBBの完全性を維持することが観察された。それどころか、PSとOSはI / R損傷に大きな緩和をもたらしません。したがって、TGsは、C. デゼルティコーラ神経保護のために、潜在的にNrf−2/Keap−1経路を活性化することによる神経リモデリング、血管新生、およびBBB完全性の促進を介して。

蓄積された証拠は、効果的な側副血行路の確立が梗塞および虚血性半影の形成を避けるために有意に重要であり、虚血性脳卒中の初期段階における重要な治療法であることを示している(ElAli、2016;岩澤ら, 2016).虚血性梗塞後の血管内皮細胞および平滑筋細胞の増殖は、側副血行路の確立を決定する。しかしながら、虚血モデルには共通の現象、すなわち脳微小血管系に酸化ストレスが広く存在していた。研究データは、多数の抗酸化物質がBBBの機能および血管新生の特性を乱す可能性があることを示している(Mentor and Fisher、2017)。CD31およびa−SMAは、それぞれ血管内皮細胞ならびに平滑筋細胞のマーカーである(Saboor et al., 2016)。からの抽出物の上記細胞増殖への影響を調べるためC. デゼルティコーラ、脳虚血性半影ホモジネートにおけるCD31およびa-SMAの発現を調べた。我々のデータは、TGがCD31およびa-SMAの発現を顕著に増強することを示した。しかし、PS群とOS群で有意差はなかった。したがって、TGはCD31およびa-SMAの発現を増加させることによって血管新生を促進することによって脳損傷を減少させる可能性があるが、PSおよびOSは脳損傷からのそのような保護を提供しなかった。これらの結果はさらに、TGのみが脳I/R損傷を予防できることを確認した。

虚血性脳卒中は、ニューロン可塑性の障害または脳領域のリモデリングによって引き起こされる脳虚血の結果として考えることができる。脳卒中患者の大部分は神経学的欠損に苦しんでいる。神経新生の活性化は、脳卒中患者が神経学的機能を改善するための有望な戦略である(Cramer and Chopp、2000)。神経新生は、脳I/R損傷後の神経機能回復に直接関与する(Zhang et al., 2019)。以前の研究は、TGsが海馬錐体細胞の生存率を改善し、神経新生を誘導することができることを示している(Lian et al., 2017)。酸化ストレスは、パーキンソン病、脳卒中などの多くの疾患の間にニューロンの損失を引き起こす(Duan and Si、2019;Singh et al., 2019).Nrf-2は、主にSOD、MDA、CAT、およびグルタミルシステインリガーゼなどを含む、プロモーター領域における神経保護に関連する多くの遺伝子を転写する(Satoh et al., 2006)。シナプス形成および神経伝達と密接に関連しているSYN、PSD-95、およびMAP−2タンパク質は、虚血性半影領域における研究ニューロン可塑性のマーカーと考えることができる。研究の結果、TGによる治癒がPSD95、SYN、およびMAP-2の発現を有意に増加させ得ることを見出し、TGの脳保護がI / R中のニューロン可塑性の増強と相関していることを示した。しかし、PSとOSグループで明らかな違いがないのは残念です。これらの結果は、TGが脳I/R損傷後の神経可塑性を増強できることを示した。脳卒中患者に対する画像研究は、BBB機能障害が周虚血性脳の顕著な属性と考えることができることを示した(Bang et al., 2007)。細胞質タンパク質、膜貫通タンパク質、および毛細血管内皮細胞間の接合接着分子で構成されるTJは、BBBの完全性を維持する上で非常に重要です(Ye et al., 2019)。その中で、ZO-1、クローディン-5、およびオクルジンはTJにおいて最も重要なタンパク質である。Page et al., 2016;Yu et al., 2017;Liu et al., 2018).この研究では、TGがMCAO誘導脳組織におけるZO-1、クローディン-5、およびオクルジンタンパク質の発現を有意に増加させることができるが、PSもOSも有意に増加しないことが実証された。BBBは脳内皮細胞からなり、周皮細胞と密接に関連している(Nyul-Toth et al., 2016)。周皮細胞はBBBの完全性に不可欠である(Bell et al., 2010)。虚血性脳卒中は、急性期に周皮細胞の死および脳内皮細胞からの剥離を引き起こし、したがって微小血管系を不安定にし、BBB特性を変化させる(Zechariah et al., 2013)。我々のデータは、TGが毛細血管の周皮細胞被覆率を高め、ZO-1、クローディン-5、およびオクルジンの発現レベルを増加させることができることを示した。これらの現象は、TGが脳I/R損傷後のBBB完全性を効果的に保護できることを証明した。要約すると、TGsは、血管新生の促進、ニューロン可塑性の改善、BBBの完全性の維持など、複数の方法で大脳損傷を減弱させ得る。

次に、TGs脳保護の根底にあるメカニズムを探るためにシグナル伝達経路を調べた。I/R損傷のプロセスは多因子性であり、したがって多数のメカニズムが病因に関与している。酸化ストレスは、BBB構造損傷、血管内皮機能障害、虚血性ニューロン損傷の悪化など、I/R誘発性脳損傷(Suda et al., 2013)に寄与する基本的な危険因子である(Xiong et al., 2015;Caglayan et al., 2019;Priestley et al., 2019).したがって、酸化ストレスは、I/R誘発性脳損傷における魅力的な治療標的となっている。核因子E2関連因子-2(Nrf-2)によって媒介される第2相酵素は、ニューロンが酸化ストレスから身を守る重要な手段として考えられてきた(Suzuki and Yamamoto, 2015;Ya et al., 2018).マウントエビデンスは、I/R中のNrf-2の活性化が神経保護の潜在的な治療標的であることを示している(Ding et al., 2015;Zhang R. et al., 2017).Nrf−2は、内因性抗酸化防御の重要な調節因子として、ヘムオキシゲナーゼ1(HO−1)および他の抗酸化酵素、例えばNAD(P)Hキノン酸化還元酵素1(NQO1)、SOD、CAT、GSH、およびMDAのレベルを媒介する(Siow et al., 2007;Ding et al., 2014).さらに、Nrf−2は血管新生において重要な調節因子の役割を果たす。本研究は、Nrf-2が血管発達の過程で有意に増強および活性化され得ることを示している(Wei et al., 2013)。

前述のように(Jiang and Tu, 2009)、TGは多くの生理活性化合物、例えばエキナコシド、チューブロシドA、アクテオシド、イソアクテオシド、および2'-アセチルアクテオシドを含み、そのうちのいくつかは脳I / R損傷後に神経保護機能を示した(Peng et al., 2016)。エキナコシドは、抗酸化、抗老化、神経保護、抗炎症、シカトリゼーションの促進、肝保護、骨形成の促進、および抗腫瘍活性などの多くの薬理学的効果を有する(Yu et al., 2016;Li et al., 2018;Zhang Y. et al., 2018;Ji et al., 2019;Xu et al., 2019).最近、エキナコシドは中枢神経系における強力な抗酸化物質として同定されている(Lu et al., 2016)。エキナコシドはMDA含量を低減し、虚血性脳損傷におけるSODおよびGSHPxの活性を改善することができ、分子ドッキング分析は、エキナコシドがKeap-1に結合し、Nrf-2核移行につながる可能性があることを示した(Li et al., 2018)。Xiaの研究は、アクテオシドが酸化ストレスを緩和することによってMCAO / Rラットの神経学的欠損を改善するために梗塞量および脳水分量を減少させることができることを示した(Xia et al., 2018)。他の研究では、イソアクテオシドがH2O2処理V79-4細胞における細胞抗酸化酵素、SOD、およびCATの活性を増加させる可能性があることが実証されている(Chae et al., 2005)。TGsに含まれる活性化合物の上記の報告に基づいて、TGsが抗酸化経路を介して虚血性脳卒中に対して保護し得ると推論することができる。

Liは、Nrf2/ARE経路を介したPC12細胞上のH2O2誘導性アポトーシスに対するフェニルエタノイド配糖体(PhGs)の神経保護効果について報告した(Li et al., 2018)。これらのPhGは、Nrf2核移行を誘発し、HO-1、NQO1、グルタミン酸-システインリガーゼ触媒サブユニット(GCLC)、およびグルタミン酸-システインリガーゼ修飾剤サブユニット(GCLM)の発現を増加させることによって有意に抑制された(Li et al., 2018;Gong et al., 2019).したがって、これらの知見は、Nrf-2/ARE経路が神経細胞に対するPhGs媒介性保護効果において重要な役割を果たしていることを示唆している。同様に、この研究では、TGがI/RラットのMDAレベルを低下させ、SOD、CAT、およびGSH-Pxのレベルを増加させる可能性があることを発見しました。一方、TGsは、核内のNrf2発現を上方制御し、細胞質における対応する発現をダウンレギュレートし、Keap−1発現を有意に低下させる可能性がある。したがって、Nrf-2/Keap-1経路はTGs媒介性神経保護効果に関与している可能性がある。この経路のさらなる検証は、将来的には酸素-グルコース欠乏/再酸素化傷害モデルを用いてインビトロ細胞培養が行われるであろう。さらにC. デゼルティコーラ抽出物は、我々の研究において14日間連続して投与された。成人の神経新生は、再灌流の14日間に神経保護効果の解釈に影響を与えるため、CTの神経保護効果を探索する際の現在の実験計画では、神経新生を排除することはできない。これが私たちの研究の限界です。

結論として、それはTGsですC. デゼルティコーラそれは血管新生および神経新生を増強し、I / R傷害ラットにおけるBBBの完全性を維持することができるが、PSおよびOSは維持できない。この効果は、Nrf-2/Keap-1経路の活性化によって媒介され得る。