初期の胚-胎児の発達に対する中国のハーブ薬Cistancheの効果
Mar 08, 2022
連絡先：Audrey Hu Whatsapp / hp：0086 13880143964メール：audrey.hu@wecistanche.com
Li Yufang 1、Xu Qinwei 2、Zhang Li 2、Zhang Wenchang 2、Feng Shutang 3 *
[概要]豚を使う胚研究と比較のための体外受精から。 追加の効果中国語薬材料Cistancheとレンゲの開発に初期胚媒体でNCSU{{0}}が証明されました。 実験により、次のことが証明されました。（1）体積比0.10％Cistancheそして0。10パーセントのレンゲが培養液に加えられ、Cistanche追加群胚盤胞率（15.76％）は、ブランク群（9.26％）よりも有意に高かった（P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0 .05）、それを示すCistancheニクジュヨウ大幅に促進することができます初期胚性発達。 （2）濃度（V / V）がCistancheは{{0}}です。05パーセントおよび0.10パーセント、胚盤胞率（17.02パーセントおよび16.75パーセント）はブランクグループ（0）よりも大幅に高くなっています（P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">中国語薬Cistanche2-細胞期の培地では、胚盤胞発生率（13.81％）は4-細胞期（7.53％）よりも有意に高かった（P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistanchebefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
invivoとinvitroでの発生環境の違いにより、胚初期のブタのinvitro培養中にフリーラジカルによって損傷を受けます胚、細胞代謝障害、またはDNA、RNA、およびタンパク質への損傷を引き起こします[1]。 凍結精液による体外受精の発生率をさらに向上させるために、この実験では、特定の濃度のCistancheとレンゲを改善する胚invitroでの開発環境。
1.材料と方法
1. 1培養条件：
ブタ卵母細胞のinvitro成熟、invitro受精、および初期胚のinvitro培養はすべて、5％CO2および最大飽和湿度39度のインキュベーター内で実施されました。
1.2試薬と培地：
卵母細胞成熟基礎液はNCSU{{0}}、卵母細胞洗浄液はPVA-TL-HEPES液、受精液は0。1％BSAを含むトリス緩衝液（mTBM）、精子洗浄液は、0。1パーセントのBSAを含むDubeccoのものです。 リン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、精子解凍液はBTS、精液は1 mg / mLヒアルロニダーゼPBS、卵母細胞操作液はHEPES緩衝NCSU -23、初期胚の基本培養液には0が補充されます。 .4パーセントBSANCSU-23、追加（V / V）0。05パーセント〜0.15パーセント必要に応じてCistanche、精液の解凍にBTSを使用します。 使用する前に、5％のCO2空気と39度の最大飽和湿度を含むインキュベーターで4時間以上予熱して平衡化します[2]。
1.3漢方薬Cistancheの煮沸方法：
Cistancheソリューション：5gを取り、1 0 0 mlビーカーに入れ、超純水を加えて超純水に浸し、強火で沸騰させ、20分間沸騰させてから収集します。スープ; 上記のプロセスを繰り返し、3回続けて収集し、100 mLまで一定容量、0.22μmフィルタースペア。 レンゲ液：5gを100mlビーカーに入れ、超純水を加えて浸し、強火で沸騰させ、20分間沸騰させた後、薬用スープを集めます。 上記のプロセスを繰り返し、3回続けて収集し、容量を100 mLに設定し、0.22μmのスペアをろ過します。
漢方薬ハーブ：Cistanche
1.4ブタ卵母細胞のinvitro成熟：
雌ブタの卵巣を北京鵬城食肉処理場から収集し、抗生物質を含む約38度の0 .9％生理食塩水に入れ、4時間以内に実験室に戻し、生理食塩水で3回洗浄しました。 12-ゲージの針が付いた10mLの注射器を使用して、卵巣の表面に直径2-6mmの卵胞を持つ卵母細胞を抽出します。 TL-HEPES溶液で3〜4回、二酸化炭素インキュベーターで4時間以上平衡化したNCSU -23で3〜4回洗浄します。 20〜30個の卵母細胞をグループとして100μLに移し、10％PFF、10 IU / mL HCG、10 IU / mL PMSG、10 ng / mL EGF NCSU -23液滴を加え、約22時間培養します。 10％PFF、10 ng / mL EGFを含む中程度からNCSU-23の液滴で、44〜46時間培養を続けます[3]。
1.5精子の受精能獲得と体外受精：
カフェインとBSAを含まないmTBM溶液を調製し、5％CO2、最大飽和湿度39度のインキュベーターで48時間平衡化し、pH値を7.2〜7.8の範囲に調整します。 使用の44時間前にカフェインとBSAを追加し、平衡化を続けます。 精液の品質をテストし、10mLを900 r / minで3分間遠心分離し、0.1％BSAを含む10 mLのDPBS溶液を懸濁液として添加し、900で遠心分離しました。 3分間のr/min [3]; 1 mLのTBM溶液を懸濁した後、60度傾けました。上流の環境発電処理は、5％CO2空気、最大飽和湿度39度のインキュベーターで1時間実行されます[3〜5]。 44〜46に成熟した卵母細胞-卵丘細胞複合体を0.1％ヒアルロニダーゼを含む卵母細胞洗浄液に入れ、卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、卵母細胞を露出させます。 バランスの取れたTBMで3回洗浄し、最後に各10-15個を50μLのTBMのグループに入れ、精子を待ちます[6、7]。 受精能獲得から上流の精液50μLをTBMを含む卵母細胞の液滴に注入し、5％CO2、最大飽和湿度39度のインキュベーターで6時間受精させます。
1.6受精卵の早期発生と検出：
受精の6時間後、卵母細胞は、胚培養液中の0.4パーセントBSAを含む操作液HEPESまたはNCSU- 23で緩衝されたNCSU-23で処理されました。 23 3回すすぎ、培地をバランスの取れた0。4パーセントのBSA NCSU -23液滴に変更し、8日以上インキュベートします。 2日目に仮想受精卵の分裂率を確認し、6日目に桑実胚率（プラス胚盤胞率）を確認し、8日目に胚盤胞率を確認します[8]。 すべてがボディミラーの下で検査され、記録されました。
1.7実験計画：
1.7.1初期胚発生に対する伝統的な漢方薬成分Cistancheの効果。
Wuzhishan pig [8]受精能獲得、体外受精後、受精が完了し、卵割が起こった後、胚は0 .1パーセント（V / V）になるまで交換されます。 ホンオニク、0。1パーセントのアストラガルス、および重要な成分を含まないNCSU -23（0。4パーセントのBSA）（ブランクグループ）を栽培して、受精卵と初期胚の発達を観察しました。 、および初期のinvitro胚発生の影響に対する2つの伝統的な漢方薬成分の影響を判断します。
1.7.2胚の初期発生に対するCistancheの濃度の影響。
Wuzhishan豚の精液は受精能を獲得し、体外受精を受けます。 受精が完了すると、液体は{{0}}パーセント（空白のグループ）、0。0 5パーセント、0。1パーセント、およびに変更されます。それぞれ0.1パーセント。 15パーセントのCistancheNCSU-23（0.4パーセントのBSA）で、受精卵の発達を観察し、初期のinvitro胚の発達に対するさまざまな濃度の漢方薬成分Cistancheの影響を判断します。
1.7.3初期胚発生に対するCistanche添加期間の影響。
Wuzhishan豚の精液は受精能獲得であり、体外受精を受けます。 受精終了後、受精卵は{{0}}細胞期に分裂し、受精卵は4-細胞期に分裂し、液体を交換して別々に添加します。 0。1パーセントCistancheNCSU-23（0.4パーセントBSA）、受精卵の発達を観察し、さまざまな段階での初期のinvitro胚発達に対するcistancheの添加の影響を判断します。
1.8統計分析：
SPSS13。0カイ2乗（χ2）検定と一元配置分散分析を使用します。
2.分析結果
2.1初期胚発生に対する漢方薬成分の影響
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0 .05）。 ２群の胚盤胞率はブランク群よりも高く、ホンオニク群の胚盤胞率はブランク群とは異なっていた。 重要（P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2初期胚発生に対する漢方薬成分Cistancheの濃度の影響
表2に示すように、胚培養液に0。0 5％から0.10％の体積濃度でCistancheを添加すると、WZSP凍結精子液の体外受精胚に対してより優れた促進効果があります。 、および胚盤胞の発生率は、ブランクグループのそれとは大幅に異なります（P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3初期胚発生に対する漢方薬成分Cistancheの期間の追加の影響
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0 .05）。 ただし、4セルの追加と比較して有意差がありました（P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3.ディスカッション
通常の開発と比較して胚インビボでは、体外受精の発生環境は受精しました胚大きく異なります。 のプロセス中に胚成長と分裂、大量のNo.、フリーラジカル、およびいくつかの有毒物質が生成され、これは胚の成長に不利です。 通常、体内で発生する胚は、内部環境の代謝を通じてこれらの好ましくない要因を排除することができます。 これらの不利な要因は、体外受精の胚成長環境に常に蓄積されます。 伝統的な中国語薬成分Cistanche凍結精液による体外受精の発生率をさらに改善するために、濃度を下げず、特定のフリーラジカルを排除する機能を持っている可能性があります。 実験では、特定の濃度を追加することを検討しましたCistancheとレンゲ。 その結果、レンゲはinvitro培養環境の改善に効果がないことが確認されました。 の適切な濃度Cistancheに一定の促進効果があります初期胚開発、しかし集中するときCistanche一定の濃度を超えると、抑制効果もあります胚発達。
さらに、のさまざまな効果を調査しましたCistanche、伝統的な中国語薬コンポーネント、さまざまな段階で、実験により、初期胚後の段階で開発率が高くなるcistanche2-セルの段階で追加されます。 考えられる理由は、受容体の外部環境によるものです。 一酸化窒素（NO）は、シグナル分子であり、幅広い生物学的活性を持つ細胞毒性因子です。 NOの影響初期胚開発は、にさかのぼる必要があります初期胚性哺乳類の胚培養における2-細胞ブロック（2-セルブロック）の原因の1つによって引き起こされる可能性のある発達段階、およびブタのinvitroブロックは4-細胞段階で発生します[{2}}細胞段階[ 9]。 伝統的なの追加中国語薬成分は、NOのフリーラジカルをある程度排除し、の不利な要因を軽減する可能性があります胚成長[10]。
Cistanche
参考文献
[1]ComportM.フリーラジカルによって誘発された細胞の激怒の3つのモデル[J]。 Chem Biol Interact、1989、72（1/2）：1- 56。
[2]パンデンケ。 クローン化されたブタ体細胞の発達に影響を与える要因に関する研究胚[D]。 北京：中国農業大学、2005年。
[3]張雲海。 クローン化されたブタの生産に関する研究胚体細胞核移植技術を使用する[D]。 北京：中国農業大学、2005年。
[4] Lu Shengsheng、Zhang Yanling、Shi Deshun、他。 成熟中のウシ血清およびブタ卵胞液の添加がブタ卵母細胞の核成熟に及ぼす影響および初期胚性体外受精後の発達[J]。 黒竜江省の畜産と獣医学、2002年、（8）：1- 3。