カンクイの多肉茎-Ⅱのトランスクリプトームアセンブリと遺伝子発見

遺伝子オントロジーと KEGG データベースに基づくすべての発現転写物の機能分類

Gene Ontology (GO) アノテーションは、UniProt アノテーションおよびアイデンティティ関連ファイルから取得されました。合計で、全発現配列の 32.69% を占める 20,907 個の転写産物が、1,745 個の機能用語に割り当てられました。機能的 GO 用語の合計のうち、生物学的プロセスへの割り当てが大部分 (1,116、63.95%) を占め、続いて細胞成分 (329、18.85%) と分子機能 (300、17.20%) でした。発現された転写産物に割り当てられた機能は、広範囲の GO カテゴリをカバーしており、最も注釈が付けられた転写産物を含む上位 10 の GO 用語を表 3 にリストしました。当社では、すべての発現転写産物の分布を 3 つの遺伝子オントロジー カテゴリ (分子機能、細胞成分、および分子機能) で提供しています。生物学的プロセス) を補足ファイル (S3 データセット) に追加します。結合機能およびトランスフェラーゼ活性に関連する GO 用語は、主に分子機能カテゴリーで表されました。結合機能に関しては、カチオン結合 (4,394 転写物) が最も多く、次いでヌクレオチド/ヌクレオシド結合 (平均 3,404 転写物)、タンパク質結合 (2,422 転写物) でした。トランスフェラーゼ活性グループでは、ほとんどがリン含有グループを転移するものです (2,256 転写産物、65.77%)。細胞成分カテゴリーでは、転写物は細胞内に多く存在していた（平均 10,581 転写物）一方、生物学的プロセスカテゴリーでは、転写物は生体高分子代謝プロセスにより深く関与し（平均 6,683 転写物）、続いて細胞プロセスの調節に関与していた（4,841 転写物）。 ）、遺伝子発現（4,678 転写物）および輸送（3,512 転写物）。

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リグニンと PhG の生合成に関与する遺伝子を発掘するために、KEGG データベース内の 13 種類の植物生物の遺伝子配列に対して 21,358 個の非重複の潜在的なタンパク質配列が検索され、少なくとも 5 件のヒットを含む 275 個の KEGG 経路に割り当てられました。最も整列した配列を持つ上位 10 の経路を表 4 に示します。ほとんどの経路は、アミノ酸またはタンパク質の代謝 (ko01230、ko04141、および ko04120)、炭水化物の代謝 (ko01200 および ko00500)、およびヌクレオチドまたはタンパク質の代謝などの一次代謝プロセスに関与していました。ヌクレオシド代謝 (ko03018、ko00230、および ko00240)。さらに、テルペノイド骨格生合成、フェニルプロパノイド生合成、カロテノイド生合成、イソキノリンアルカロイド生合成、トロパン、ピペリジン、ピリジンアルカロイド生合成など、27の二次代謝関連経路（図2）があります。これらの結果は、活発な代謝プロセスが体内で進行していたことをさらに示唆しています。C. デスティコーラ茎組織。 KEGG 経路に関連するすべての発現転写物は補足ファイル (S4 データセット) にリストされています。 C. デスティコラとイネなどの他の植物の間には経路がいくつか大きく変化していますが(S5 データセット)、この研究の主な目的は、C. デスティコラの茎のトランスクリプトーム プロファイル全体を明らかにし、関連する PhG 生合成経路を描写することです。栽培の指導に役立つ可能性があります。

リグニンの生合成に関与する酵素をコードする候補遺伝子

リグニンは植物界で 2 番目に豊富な天然の陸生ポリマーであり、植物の細胞壁に含まれる物質の最大 3 分の 1 を構成します。リグニンは細胞壁の重要な構成要素として、水の輸送を助け、機械的サポートと構造的完全性を提供し、病原体や草食動物から身を守ります。リグニンのこれらの役割は、砂漠における C. デザートティコラの地下での直立的な成長をサポートする上で非常に貴重です。この研究では、C.deserticolaにおけるリグニン生合成経路の全体像を提示しました（図3）。この経路では、水酸化、メチル化、還元、酸化重合プロセスを含む一連の酵素反応を通じて、フェニルアラニンからリグニンモノマーが生合成されます。リグニン生合成関連酵素は、血管組織で主に合成される 3 つの形態 (p-ヒドロキシル-フェニル (H)、グアヤシル (G)、およびシリンギル (S) リグニン) と、唯一同定された 5- ヒドロキシル-グアヤシル リグニンで検出されました。 COMT（カフェ酸3-O-メチルトランスフェラーゼ、EC 2.1.1.68）欠損（ノックダウンなど）植物で。

フェニルアラニンアンモニアリアーゼ (PAL、EC 4.3.1.24) は、非酸化的脱アミノ化によってフェニルアラニンを桂皮酸に変換するリグニン生合成経路における最初の重要な酵素です (図 3)。合計 6,297 個の PAL リードの配列が決定され、C.deserticola で 7 個の PAL 転写物が組み立てられました (表 5)。配列類似性の比較により、そのうちの 4 つ (comp28550_c1_seq1/2/3/5) が C.deserticola の既知の mRNA 配列 (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|)、comp28550_c1_seq4 と comp25940_c0_seq1 の類似性はそれぞれ 77% と 82% でした。 ORF 予測により、5 つの転写産物がタンパク質をコードする可能性があり、芳香族アミノ酸リアーゼ ドメイン (PF00221.14) を保持していることが明らかになりました。その中で、comp28550_c1_seq4 転写物だけが 718 アミノ酸残基の完全なタンパク質配列をコードできました。 PAL は、シロイヌナズナでは 4 つ、Populus trichocarpa では 5 つ、Scutellaria baicalensis では 3 つ、Cucumis sativus では 7 つなど、ほとんどの植物種で小さな多重遺伝子ファミリーによってコードされていることが報告されています。我々の系統解析では、PAL が 4 つ存在することが示唆されました。 C の PAL をコードする遺伝子。

deserticola と私たちは、それぞれ CdPAL1、CdPAL2、CdPAL3、CdPAL4 と名付けました (S2 図)。 4-クマリン酸-CoA リガーゼ (4CL、EC 6.2.1.12) とトランス-桂皮酸 4- モノオキシゲナーゼ (CYP73A、EC 1.14.13.11) は、桂皮酸をジクマロール CoA に 2 つの逆変換を行う 2 つの酵素です。命令。それらはバックボーンにも存在し、その発現 FPKM 値はそれぞれ 39.57 と 51.93 です。

4 種類のリグニンは、3 つの主要な酵素、シンナモイル CoA レダクターゼ (CCR、EC 1.2.1.44)、シキミ酸 o-ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ (HCT、EC 2.3.1.133)、およびフェルラ酸によって制御される異なる経路によって生合成されました。{{1{ {56}}}}ヒドロキシラーゼ (F5H、EC 1.14.-.-)。 CCRは、X-CoA（Xにはジクマロール、カフェオイル、フェルロイル、5-ヒドロキシルフェルロイル、シナポイルを含む）を触媒してY-アルデヒド（Yにはpを含む）を生成するリグニン経路の制御点として報告されている[50、51]。 -クーガー、カフェオイル、コニフェリル、5-ヒドロキシル-コニフェリル、およびスナップ）、一方、HCTはp-クマロイル-CoAを触媒してp-クマロイルシキミ酸/p-クマロイルキナ酸を生成しました。この 2 つの酵素は、ちょうどスイッチのように、P-ヒドロキシル-フェニル リグニンまたは他の 3 種類のリグニンの生合成を制御します。 F5H は、シリンギル リグニンと 5- ヒドロキシル-グアヤシル リグニンを制御する別の分岐スイッチでした。カフェ酸3-O-メチルトランスフェラーゼ (COMT、EC 2.1.1.68)、カフェオイル-CoA O-メチルトランスフェラーゼ (CCoAOMT、EC 2.1.1.104)、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ (CAD、EC 1.1.1.195) などの他の重要な酵素) の発現も検出されました。詳細な発現情報を表 6 に示します。この研究で同定されたこれらの酵素遺伝子は、この重要な薬用植物の機能ゲノム研究に貴重なリソースを提供します。表 6 のリグニン生合成経路に関連する 10 個の遺伝子が、RNAseq 結果を確認するために RT-qPCR 検証用に選択され (図 4)、それらの高い相関 (ピアソン相関係数: 0.90343) は、トランスクリプトーム解析の高い精度と再現性を示しました。 S1 データセットには、この解析で使用したプライマー配列がリストされています。

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PhGの生合成に関与する酵素をコードする候補遺伝子

フェニルエタノイド配糖体 (PhG) は、性的能力の向上、フリーラジカルの除去、および老化防止の作用を持つ C. デスティコラの主な有効成分であることが知られています。 PhG の 3 つの化学成分は、有機酸、糖、フェニルエタノール アグリコンです (図 3)。カフェ酸、フェルラ酸、クマリン酸などの有機酸は、フェニルプロパノイド生合成経路の生成物です。糖質の構成成分であるグルコースやラムノースは、デンプンやスクロースの代謝、アミノ糖やヌクレオチド糖の代謝、フルクトースやマンノースの代謝などの糖質代謝経路の産物ですが、フェニルエタノール部分の生合成経路はまだ明らかになっていません。ここで、我々は配列データに基づいて、考えられる 2 つのフェニルエタノール生合成経路を提案しました。 1 つは報告されているカフェ酸またはフェルラ酸経路で、リグニン生合成骨格経路に似た桂皮酸経路としても知られています。もう1つは、フェニルアラニン代謝経路（図3）に基づいており、フェニルアラニンからフェニルエタノールへの反応は、1世紀前に酵母で初めて発見され、ペチュニアの花、トマト、バラでも検証された既知の「エンリッヒ経路」によって達成されました。フェニルアラニンからフェニルエタノールへの変換に関与するアスパラギン酸/チロシンアミノトランスフェラーゼ、ヒスチジンリン酸アミノトランスフェラーゼ、および第一級アミンオキシダーゼをコードする4つの酵素遺伝子が、C.deserticolaの茎で発現していることが検出された。フェニル エタノールの生成物は、モノオキシゲナーゼによってさらに酸化されるか、メチルトランスフェラーゼによってメチル化されて、PhG 生合成に関与する誘導体 (フェニル エタノール アグリコン) になります。要約すると、フェニルエタノール アグリコンの 2 つの推定生合成経路が提案されました。C. デスティコーラしかし、さらにさらなる研究が必要です。

ディスカッション

近年、植物ゲノミクスは次世代シーケンス技術の応用により急速に発展していますが、砂漠の薬用植物のゲノミクスに焦点を当てた研究はほとんどありません。干ばつおよび塩分環境への適応と主要な生理活性成分の生合成経路を理解するために、ゲノム研究またはトランスクリプトーム研究を実施することが緊急に必要です。いくつかの薬用植物の新たなトランスクリプトームの発見、

オタネニンジン、イチョウ、カンゾウなどは、読み取り長が長いため、Roche 454 プラットフォームを使用して最初に利用されました。短いリード、特に有利なペアエンドリードによる効果的なアセンブリ能力のため、イルミナベースのトランスクリプトームシークエンシングとアセンブリは、モデル生物および非モデル生物にも広く使用されています。本研究では、約 8G の 101 bp ペアエンドリードを生成し、平均長 725 bp のより長いユニジーン配列を生成しました。大規模な茎特異的トランスクリプトーム データは、有用な参照データを提供し、C. デザートティコラの生理活性成分の二次代謝を調べるために使用できる可能性があります。生のリードの合計の 81.62% がアセンブリ前に厳しい品質フィルター (アダプターのトリミングと低品質のリードの破棄を含む) を通過しており、シーケンス データの高品質が示唆され、高品質のリードの 82.08% がアセンブリに役立ちました。アセンブリに使用できなかったその他の読み取りは、シーケンス エラー、アセンブリ パラメータなどが原因である可能性があります。これらの未使用の高品質リードは、将来的に別のプラットフォーム (Roche 454 など) からのより長いリードと組み合わせた de novo アセンブリの改善に引き続き役立ちます。

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組み立てられた多数の転写物 (30,098) は、公共データベース内の既知の遺伝子と高い配列類似性を示し、イルミナに基づくペアエンド データが C. デザートティコラの転写物のかなりの部分をカバーしていることを示唆しています。 BLAST ヒットのない転写物は、3' または 5' 非翻訳領域、非コード RNA、または C. デザートティコラの新しい遺伝子配列に起因する可能性があります。発現された転写物は、広範囲の GO カテゴリおよび KEGG 経路に注釈が付けられ (表 3 および 4)、多くの転写物が二次代謝関連経路に割り当てられました。私たちが知っているように、フェニルプロパノイドは、地下生活に多大な利益をもたらす誘導性抗菌化合物として機能することができ[1]、薬効以外にも植物と微生物の相互作用におけるシグナル分子としても機能します[68、69]。テルペノイドは、生理活性成分（6- デオキシカタルポールなど）の生合成に使用されます [70]。私たちは、フェニルプロパノイドおよびテルペノイド骨格の生合成経路に関与する遺伝子が C.deserticola に非常に豊富に存在することを発見しました。さらに重要なことは、リグニン生合成のよく知られた経路の発見（図 3）により、C. デザートティコラの茎におけるリグニンの活発な代謝プロセスが示されたことです。リグニンの生合成に関与するすべての既知の酵素遺伝子 (図 3) の発現が検出され、PAL、CCR、HCT、および F5H を含む 4 つの主要な酵素の発現量は、リグニンの生合成に比べて低かった (それぞれ FPKM 26.47、3.89、3.4、および 3.83)。他の酵素遺伝子 (表 6)。これら 3 つの遺伝子の発現変化が C. デザートティコラのリグニン生産に影響を与えるかどうかは、さらなる研究の価値がある。 PAL はリグニン生合成における重要な酵素であり、フェニルプロパノイド、レスベラトロール、フラボノイド、およびクマリンの生合成にも関与しています [71-74]。我々は、C. デザートティコーラのゲノムで4つの異なるPAL遺伝子を検出しました（S2図）。これは、PALが小さな多重遺伝子ファミリーによってコードされていることと一致し[39、43、45-49]、さらにそれが代謝炭素フラックスにおいて重要な役割を果たしている可能性があることを証明しました。 。

PhG は C. デスティコーラの主な有効成分です。フェニルエタノールの生合成に関与する遺伝子は、C. デスティコーラの品質にとって重要です。我々は、C.deserticola の茎における PhG 生合成に関与するフェニル エタノールの 2 つの異なる生合成経路と 17 の酵素遺伝子を推定しました。考えられるカフェ酸/フェルラ酸後のプロセス (図 3) も、中間体の構造式と対応する酵素の触媒特性に基づいて初めて推定されました。このプロセスでは、コーヒー/フェルラ酸は最初にフェニルピルビン酸誘導体に酸化されます。次に、カルボキシル基が脱炭酸酵素によって奪われました。最後に、アルデヒド基はデヒドロゲナーゼによってアルコール基に戻されました。これは、C. デスティコーラの全トランスクリプトームを調査し、参照ゲノムなしで RNA 配列読み取りを組み立てるために、イルミナのペアエンド シーケンス技術を初めて応用したものです。この研究は、将来の C.deserticola の機能ゲノミクスおよびプロテオミクス研究に有用なリソースと遺伝子配列を提供するでしょう。

結論

この研究では、ハイスループットシークエンシングデータに基づいて C.deserticola 茎のトランスクリプトームをプロファイリングし、リグニンの生合成経路に関与する遺伝子を同定し、さらに PhG の潜在的な生合成経路を初めて推測しました。これにより理解が確実に加速されます。曖昧な生理学的プロセスと分子レベルでの大きな薬効の解明。これは、これまでのところ、イルミナベースの配列決定データセットを使用して、C. デスティコラ茎のトランスクリプトーム全体をデノボ構築し、薬効成分の生合成経路を検出する最初の試みです。私たちの研究は、天然医薬品の開発と薬効のある品種の選択を促進する可能性があります。

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