カンクサのツブロシド B は PC12 神経細胞を1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン誘発性アポトーシスと酸化ストレスから救います

導入

病理学的には、散発性パーキンソン病 (PD) は通常、カテコールアミン作動性ニューロン、特に黒質緻密部 (SNc) のドーパミン作動性ニューロンの喪失、および特徴的なニューロン内存在を特徴とします。 影響を受けた脳領域にはレビー小体と呼ばれる封入体が存在します。 PD の病因にはさまざまな要因が関与しているとされているにもかかわらず、PD の発症と進行に関与するメカニズムは依然として不確かなままです。PD の原因はまだ解明されていないにもかかわらず、いくつかの証拠が酸化ストレスの関与を強く示唆しており、最終的にはフリーラジカルの過剰な生成による神経細胞死またはアポトーシス。 黒質ドーパミン作動性システムが高レベルのフリーラジカルを生成する可能性があり、比較的低レベルの酸化防御システムを備えているという事実は、この仮説をさらに裏付けます。 インビボおよびインビトロ研究の両方で、ドーパミン作動性ニューロンに対する1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP）の活性代謝物であるMPP ＋の酸化ストレス媒介神経毒性が示されました。 PDなどの神経変性疾患の直接の原因として、酸化ストレスによって過剰に生成されるフリーラジカルが関与していることは、抗酸化物質の重要な役割を示唆しています。 ツブロシド B (図 1) は、カンクサの茎から単離されたフェニルエタノイド化合物の 1 つでした。 以前の研究では、チューブロシド B を含む多くのフェニルエタノイドが強力なフリーラジカル消去活性を示すことが判明しました。

これらの発見を考慮して、私たちは本研究で、神経機能の研究に長年にわたって成功裏に使用されてきた交感神経褐色細胞腫細胞株 PC12 を使用して、MPP 誘発神経毒性に対するチューブンシド B の効果を in vitro で調査しました。{0}

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材料と方法

材料

Cistanche Salsa のツブロシド B は、Li Lei 博士 (北京大学薬学部天然物学科、北京、中国) のご厚意により提供されました。 化合物の純度は、ＨＰＬＣ分析により９８％以上であった。 ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、ウマ血清およびウシ胎児血清は GIBCO BRL から購入しました。1-メチル-フェニルピリジオニウム イオン (MPP+)、ポリ-L-リジン、3-(4,{ {8}}ジメチルチアゾール-2 -イル)-2、5-臭化ジフェニルテトラゾリウム (MTT)、ヨウ化プロピジウム (PI)、RNase A、プロテイナーゼ K、および 2; 7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)はSigmaから購入しました。

細胞培養

PCI2細胞は、10%のウマ血清、5%のウシ胎児血清、100U/mlのペニシリンおよび100ug/mlのストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。 細胞は、95% 空気と 5% CO2 を通気した 37 度の加湿インキュベーター内で培養されました。 すべての実験は、細胞を播種してから 24-48 時間後に実施されました。 細胞がサブコンフルエント段階に近づいたときに、0.25%のトリプシン処理によって細胞を日常的に回収し、1:8に分割した25cm培養フラスコに播種した。

細胞生存率の分析

細胞生存率は、以前に記載されているように修正された MTT アッセイを使用して決定されました [10]。簡単に説明すると、PC12 細胞をウェルあたり 1 × 104 細胞の密度で 96- ウェル プレートに播種しました。 培養物を 48 時間増殖させた後、培地をさまざまな濃度のバーンサイド B または MPP+ を含む培地に交換しました。 最大48時間および72時間のインキュベーション後、MTr溶液(DMEM中5mg/ml)を96-ウェルプレートに添加し、細胞を37℃で4時間インキュベートした。 培地を除去した後、２００μＬのＤＭＳＯを添加することによって細胞および色素結晶を可溶性飼料とし、モデル５５０マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて５７０ｎｍ（基準として５４０ｎｍ）で吸光度を測定した。 トリパンブルー排除法を使用して細胞生存率も分析しました。 細胞を収集し、穏やかにペレット化し、0.6%トリパンブルー溶液で3分間染色した。 その後、無色の細胞の割合を、ランダムに選択した 10 個の顕微鏡視野で評価しました。 陽性薬剤として、100 ng/mlの上皮成長因子（EGF）を使用した。

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フローサイトメトリーによるアポトーシスの検出

アポトーシス細胞は、ヨウ化プロピジウム (PI) を使用したフローサイトメトリーによって検出されました [11]。 簡単に説明すると、試験物質とインキュベートした約 1 × 106 細胞を遠心分離によって収集し、PBS で 1 回洗浄しました。 細胞を70%エタノールで- 20度で24時間固定し、PBSで1回洗浄しました。 次いで、細胞を、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡおよび０．５ｍｇ／ｍｌのＰＩを含有する３００μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。 さらに暗所で３０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ハイデルベルク、ドイツ）を用いてフローサイトメトリーを実施した。

電気泳動によるDNA断片化の解析

断片化された DNA のみを単離するムーアのプロトコル [12] を適用し、各試験グループからの同数の培養物を使用して実験を正規化しました。 簡単に説明すると、各処理サンプルからの 3 × 106 ニューロンをハンクス平衡塩類溶液で洗浄し (1000g で 10 分間)、チューブの底に形成されたペレットを均質化しました。 1 mlの溶解バッファー（10 mM Tris、pH 7.4、5 mM EDTA、1% Triton X-100）を用いて氷上で20分間。 4度、11,{25}}gで20分間遠心分離した後、断片化DNAを含む上清を除去し、20mg/ml RNase Aで37度で1時間、0.1mg/mlプロテイナーゼKで56度で消化した。さらに1時間。 断片化したDNAをフェノールとクロロホルムを使用して抽出し、4℃、10,{33}gで1分間遠心分離した。水相を新しいエッペンドルフチューブに移し、2倍量の氷冷エタノールと混合した。 20度で少なくとも1時間放置してDNAを沈殿させます。 15,{38}}g、4度で20分間遠心分離した後、上清を除去し、DNAペレットを80％エタノールで1回洗浄し（15,000g、4度で15分間）、風乾し、20μLに溶解したpH 7.6のTEバッファー。 次に、サンプル全体を 1.5% アガロースゲル上で 85 V で 1 時間電気泳動しました。ゲルを Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000、Bio-Rad、USA) によって検査し、写真撮影しました。

細胞内ROS形成の測定

細胞内過酸化物の形成は、非蛍光化合物である 2"7"-ジクロロフルオレセイン ジアセテート (DCFH-DA) [13] を使用する共焦点走査型レーザー顕微鏡で検出されました。この化合物は、内因性エステラーゼによって細胞内で脱エステル化されてイオン化遊離状態になります。酸、2;7"-ジクロロフルオレセイン。2",7-ジクロロフルオレセインは、ヒドロ抗酸化剤によって蛍光性の 2"7"-ジクロロフルオレセイン (DCF) に酸化されます。 細胞を10μM DCFH-DAとともに37℃で30分間インキュベートした。 培養物をハンクス平衡塩類溶液で２回洗浄し、同じ培地で画像化した。 イメージングは​​共焦点走査型レーザー顕微鏡を使用して行われ、DCF は 488 nm で励起され、発光フィルターは 510 nm バリアフィルターでした。有効な比較を提供するために、すべての観察に同じ取得パラメーターが使用されました。 セルの中央に最適な垂直位置が設定され、フィールドが迅速にスキャンされました。 488 nm の励起波長での照明は、この色素の酸化により蛍光の増加を引き起こすため、各フィールドを同時に光に曝露しました。 未刺激の細胞のベースライン値を対照値として使用し、MPP+ 処理細胞と比較しました。チューブロシドB。 スキャン後、顕微鏡視野あたりの 15-20 神経細胞体の平均相対蛍光強度が、治療条件ごとに 4 つの別々の培養物で定量されました。

統計分析

得られたすべての値は平均±SDとして表されました。 グループ間の差異の統計的有意性は、スチューデントの t 検定によって決定されました。 0.05 未満の計算された p 値は、統計的に有意であるとみなされます。

結果

図 2 に示すように、MPP+ は PCI2 細胞の生存率を用量依存的に減少させました。 対照的に、よく知られた神経栄養因子である EGF は、100ng/mL で細胞生存率を大幅に保護しましたが、MPP+ 誘発細胞毒性効果もチューブロシド B (5、10、50、または 100 ug-ml) の存在下では減弱されました。{{12} })、ただし参照よりも効力は劣ります。

薬剤（図３）． これらの濃度のチューブロシド B は用量依存的に細胞保護効果を示し、化合物単独では明らかな細胞毒性を引き起こしませんでした (データは示さず)。 200 μM MPP+ で 48 時間処理した PCI 2 細胞からの DNA 抽出物のゲル電気泳動により、DNA ラダー形成が示されました。 アポトーシスの古典的な特徴であるチューブロシド B を 10 および 100 μ g/ml の用量で投与すると、DNA ラダーの形成が誘導されました (図 4) ． 図 5 は、チューブロシドの存在下または非存在下での PC12 細胞における MPP+ によって誘導されるアポトーシス細胞死のフローサイトメトリー解析の典型的なヒストグラムを示します。 B. PI による細胞周期プロファイルの定量化により、亜二倍体特性を持つ細胞の数が明らかになりました (M1 領域)アポトーシスによる DNA 断片化を示します。 未処理の細胞では、アポトーシスを起こした亜二倍体の割合は、合計 10000 細胞の 5.94% までで最小でした (図 5 A)。 MPP+ に 48 時間曝露した後、アポトーシスの割合は 43.02;j; に増加しました (図 5 B)。 細胞培養物に添加すると、チューブロシド BMPP+-誘導アポトーシスを阻害した用量依存的に。 10μg・ml-1の濃度では、チューブロシドBによる保護は統計的に有意ではありませんでしたが、50μg・ml1 00μg・ml-1では、それぞれ45％と63％減少しました。観察されました。 生存細胞の割合が増加します(図5D、E)。

DCFH-DA を用いることで細胞内 ROS の蓄積を検出できます。200 uM MPP+ で 48 時間処理した PC12 細胞は、DCFH-DA 色素で染色すると細胞内部に強い蛍光を示しました（図６）。 チューブロシドBによる同時処理(用量10および100μg・ml)はMPP+誘発ROS産生を阻害した(減少率はそれぞれ24.52%および55.63%)。

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議論

PD の病因には、強い酸化ストレス、抗酸化レベルの低下、ミトコンドリアの欠損が含まれます。 これらはすべて、いくつかの細胞系でアポトーシスを誘導することが知られています。 特に、フリーラジカルはニューロンの活発な細胞死を引き起こすことが示されています[14]。 MPTP は不可逆的で重度のパーキンソン病様症候群を引き起こし、ヒトの黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの選択的変性を引き起こします。 この神経毒は作成するために使用されています。 MPTP はモノアミンオキシダーゼ B によって Mpp+ に変換され、ミトコンドリアに蓄積されます。 ミトコンドリア複合体 I とミトコンドリア障害を阻害する場合。 機能はアポトーシスを引き起こす[16]． したがって、ドーパミン作動性ニューロンにおける MPP+ 誘発神経毒性は、神経保護剤をスクリーニングするための PD の病因モデルとして広く使用されています。

本研究では、PC12 細胞における酸化ストレスを介して誘発される MPP+- がチューブロシド B によって軽減されることを実証しました。さらに、チューブロシド B が MPP{{0} に対しても用量依存的に保護することも実証しました。 3}} DNA ゲル電気泳動とフローサイトメトリー分析を使用して測定した、DNA ラダーリングとアポトーシスの誘導。 さらに、高濃度のチューブロシド B による同時処理は、MPP 誘導性 ROS 産生を阻害しました。 このように、チューブロシド B は多機能な神経保護効果を示しています。 チューブロシド B の作用には、いくつかの機構が個別にまたは連携して関与している可能性があります。抗酸化作用は、チューブロシド B を介した神経保護の考えられる機構です。 Xiong Qは、チューブロシドBが1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジルラジカルとキサンチン]キサンチンオキシダーゼにより生成されるスーパーオキシドアニオンラジカルに対して強力なフリーラジカル消去活性を示すことを発見しました。

最近、いくつかのフェニルエタノイドがフリーラジカル消去特性を持ち、酸化ストレス誘発性の毒性損傷を保護することが報告されています。 過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカルなどの MPP+ によって生成される ROS は、生体分子に容易に損傷を与え、最終的にはアポトーシスまたは壊死性の細胞死を引き起こす可能性があります。 したがって、チューブロシド B は ROS に対して直接的な除去効果を持っている可能性があります。 私たちのデータは、チューブロシド B が ROS 蓄積を抑制するために作用する正確な部位を確立していませんが、神経保護機構には抗酸化経路の刺激が関与していることを示唆しています。 チューブロシド B の分子構造の研究では、チューブロシド B が次のような強力な能力を持っていることも示しています。フリーラジカルを除去する（個人的なコミュニケーション）。

他のメカニズムも関連する可能性があります。 例えば、チューブロシド B は、ミトコンドリアの透過性遷移孔の開口と機能不全を阻害することにより、MPP+ の毒性に対抗する能力を有する可能性があります。 さらに、チューブロシド B が神経細胞に対して直接的な成長促進効果を有するかどうかも考慮する必要があります。 チューブロシド B の神経保護作用の正確なメカニズムは不明のままです。 その神経保護効果の全体像を解明するには、さらなる研究が必要です。

結論的には、チューブロシド B はカンカサルサエキスMPP+- 誘発アポトーシスと酸化ストレスに対して明らかな保護効果があります。 MPP ＋毒性に対するその神経保護効果は重要である可能性があり、PDの予防と治療において治療の可能性がある可能性があることを示唆しています。

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