腫瘍細胞は、がん遺伝子由来の MHC-II 制限エピトープを CD4+ T 細胞に提示できません
Oct 09, 2023
CD4+ T 細胞は、MHC クラス II (MHC-II) 上に提示されるペプチド抗原の認識を介して、抗腫瘍免疫において重要な役割を果たします。 一部の固形がんでは MHC-II の発現を誘導できますが、これによって腫瘍特異的 CD4+ T 細胞による直接認識がどの程度可能になるかは不明です。 私たちは、頭頸部扁平上皮癌患者の 2 つの癌タンパク質、HPV-16 E6、および活性化 KRASG12V 変異に特異的な自然にプライミングされた CD4+ T 細胞から T 細胞抗原受容体 (TCR) を単離し、特性評価しました。それぞれ、膵管腺がんと膵管腺がんを検出し、自己またはヒトの白血球抗原が一致する抗原を発現する腫瘍細胞を認識する能力を調べました。 どちらの場合でも、抗原が内因的に発現され、エンドソーム経路に向けられているが、腫瘍を認識できない場合、TCR は関連する MHC-II または B 細胞抗原提示細胞 (APC) を発現するペプチドをロードした標的細胞を認識できることがわかりました。 IFN-による表面MHC-II発現の誘導後でも、ソースタンパク質を発現する細胞 またはCIITAによる変換。 これらの結果は、核（E6）腫瘍タンパク質と膜関連（KRAS）腫瘍タンパク質の両方のプライミングと機能的認識が、MHC-IIの発現が誘導された腫瘍細胞の直接認識を介するのではなく、主に交差提示APCに限定されることを示唆しています。
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導入
体細胞の悪性形質転換は、細胞増殖経路を調節不全にし、無制限の増殖を引き起こす活性化された癌遺伝子の作用によって開始されます (1)。 HPV 関連癌の場合、HPV 初期遺伝子 E6 および E7 の発現は、それぞれ腫瘍抑制遺伝子 p53 および Rb を阻害することにより発癌に寄与します (2)。 あるいは、構成的な癌遺伝子の活性化は、RAS ファミリーなどの細胞の成長および増殖経路を制御する遺伝子の体細胞突然変異によって発生する可能性があります。 実際、KRASG12V などの活性化 KRAS 変異は、膵臓がん、結腸がん、肺がんの患者によく見られます (3)。 がん遺伝子は病気を促進しますが、宿主の免疫系に標的を提供することもあります。 近年、HPV関連がんの制御における免疫系の役割が広く認識されるようになりました。 HPV E6 および E7 および他の HPV タンパク質を認識する CD{9}} および CD4+ T 細胞が、HPV 関連患者の末梢血と腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) の両方で同定されています。がん（4～6）。 治療用がんワクチンや、TIL または TCR 改変 T 細胞を用いた養子細胞療法 (ACT) など、これらの抗原を標的とする免疫療法は、前臨床および臨床研究の活発な分野です (2)。 発がん性突然変異に対する T 細胞の応答も広く報告されています (7-9)。 さらに、変異型 KRAS を標的とする TIL を含む ACT が客観的な反応を促進できるという直接的な臨床証拠があります (10)。 癌遺伝子由来のエピトープを認識する CD8+ T 細胞は腫瘍細胞に対する直接的な細胞毒性を媒介しますが (11-13)、抗腫瘍免疫における CD4+ T 細胞の役割はあまりよく理解されていません。 最近の研究は、ヒトの癌においてグランザイム B (GrzmB) などの細胞傷害性マーカーを発現する CD4+ T 細胞のサブセットに焦点を当てています (14、15)。 しかし、これらの細胞の抗原特異性、したがってそれらの治療可能性はほとんど不明のままです。 さらに、これらの細胞傷害性 CD4+ T 細胞が腫瘍細胞を認識して殺すためには、腫瘍細胞が MHC-II を発現するだけでなく、関連する抗原が適切な提示経路に向けられなければなりません。 この研究では、腫瘍タンパク質HPV-16 E6およびKRASG12Vに特異的なCD4+ T細胞が抗原発現腫瘍細胞を認識する能力を調査しました。 どちらのTCRも、内因的にプロセシングされ、HLA一致B細胞のエンドソームコンパートメントに向けられた抗原を提示する抗原を直接認識できましたが、どちらもMHC-IIの発現が誘導された抗原発現腫瘍細胞を認識することはできませんでした。 全体として、我々の結果は、特定の抗原のみがMHC-II+腫瘍細胞に直接提示され、それが腫瘍細胞を直接認識して排除できるCD4+ T細胞のプールを制限する可能性があることを示唆しています。
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結果
頭頸部扁平上皮癌の TIL からの HPV-16 E6- 特異的 CD4+ および CD8+ T 細胞反応の同定。 HPV-16+頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の患者（Hu-56）からの2〜4 mmの腫瘍断片から単離された一連の個々のTIL培養物をスクリーニングしました（補足表1;補足資料）この記事でオンラインで入手可能; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1)、以下を含むペプチドプールを使用して、HPV-16 ウイルス腫瘍タンパク質 E6 および E7 に対する T 細胞応答を同定するための IFN-ELISPOT アッセイによるE6 タンパク質と E7 タンパク質の長さにまたがる重複する 15- mer。 特に、TIL フラグメント 12 および 29 は、E6 ペプチド プールで再刺激すると、バックグラウンド上にかなりの数のスポットを生成し、CD4+ および CD8+ T 細胞の両方を含んでいた (図 1A および補足図 1A)。 関連する T 細胞サブセットを特定するために、サイトカイン分泌アッセイを使用してこれらの TIL 培養物を分析しました。 これにより、TIL フラグメント 29 (F29) には E6- 反応性 CD8+ T 細胞が含まれているのに対し、フラグメント 12 (F12) には E4+ 反応性 CD8+ T 細胞の両方が含まれていることが明らかになりました。 E6 ペプチドプールを認識します (図 1B)。 CD4+ T細胞はいずれもE6再刺激に応答してIL-5を産生せず、Th1-様の表現型が確認されました。 E6-特異的TILのTCRクローン性を決定するために、F12からの単一のIFN-分泌CD4+ T細胞と、F12およびF29からのCD8+ T細胞を選別しました。 TCR配列決定により、IFN--分泌CD4+ T細胞（配列決定された31細胞中n=31）によって発現される単一のTCRと、IFN--分泌CD{{53}によって共有される単一のTCRクローンが明らかになりました。 }} F12 と F29 の両方からの T 細胞 (それぞれ配列された細胞数 41 個中 n=40 と 38 個中 37 個) (補足表 2)。 これらの結果は、E6 に反応するモノクローナル CD4+ および CD{62}} T 細胞がこの患者の TIL 内に存在することを示しています。 TIL 由来の HLA-A*02:01 – 拘束性 CD8+ T 細胞は、患者由来の腫瘍細胞株によって提示される E6 を認識します。 F29 由来の TIL は E629-38 ペプチドで再刺激されると IFN-α を産生し、これは F29 TCR が以前に記載されたこの HLA-A*02:01 拘束性エピトープを認識したことを示唆しています (補足図 1B) (11)。 これは、E629-38/HLA-A*02:01を使用してヒトCD8を発現するTCR欠損J76細胞を標識し、以前に記載されたE628-38特異的TCRを陽性として使用した四量体結合研究によって確認されました。コントロール (図 2A) (11)。 滴定濃度の E629-38 ペプチドでパルスした自家 B リンパ芽球様細胞株 (B-LCL) による刺激後の J76 上の急性活性化マーカー CD69 の上方制御によって実証されるように、両方の TCR は同様のレベルの機能的結合力を示しました (図 2、 B と C)。 これらのデータは、臨床現場で試験された TCR と同様の機能的特徴を持つ、E6 の既知のエピトープに特異的な CD8+ T 細胞クローンの存在を検証します (16)。 次に我々は、E{98}}特異的 CD{99}} TCR が内因的に発現した抗原を認識し、それによって抗腫瘍細胞毒性を媒介できるかどうかを判定しようとしました。 これを行うために、よく特徴付けられた HLA-A*02:01+ HPV-16+ 腫瘍株 CaSki と、HNSCC{105}} によって生成された自己腫瘍細胞株 HNSCC{105}} を使用しました。 in vitro 細胞毒性アッセイについては、以前に記載されている (17) 原発腫瘍組織の細胞再プログラミング。 RNA-Seq 分析により、原発腫瘍サンプルと自己細胞株の両方による E6 を含む HPV{108}} 初期遺伝子の発現が検証されました（補足図 1C）。 F29 TCRを発現する初代ヒトCD8+ T細胞は、インビトロでさまざまなエフェクター対標的比でCaSkiとHNSCC-56の両方の細胞死滅を媒介することができました（図2、D、およびE）。 これらのデータを総合すると、F29 TCR が内因的に発現された E6 抗原を認識することが検証されます。 TIL からの HLA-DQ 制限のある E6-特異的 CD4+ T 細胞の同定。 さらなる機能分析のためにE6-特異的なTILを拡大するために、OKT-3を使用した前述の急速拡大培養プロトコルを使用し、F12からのTILを拡大するために放射線を照射した同種異系PBMCを使用しました。 初代F12培養物にはもともとE6反応性を持つCD8+ T細胞とCD4+ T細胞の両方が含まれていましたが、急速増殖後の最終細胞産物には99%のCD4+ T細胞が含まれ、そのうち約38.33%でした。 ％は、ＩＦＮ－に対する細胞内サイトカイン染色によって証明されるように、Ｅ６に対する反応性を示した（図３Ａ）。
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IFN-に加えて、刺激されたE6-特異的CD4+ TILはTNF-を分泌できましたが、IL-2は分泌できませんでした（補足図2A）。 GrzmB+ 細胞の総頻度は抗原刺激によって増加しませんでしたが、TNF- - 分泌細胞のゲーティングにより、E6-特異的 CD4+ TIL には非特異的 TIL よりも多くの細胞内 GrzmB が含まれていることが明らかになりました（補足図 2B） ）。 IFN-分泌CD4+ TILは共抑制マーカーであるプログラム細胞死1（PD-1）も発現しており、これは腫瘍反応性CD4+ TILの公表されているサインと一致している（補足図2C）（ 18、19）。 E6-特異的 CD4+ TIL は、これらの細胞が 1 ug/mL 未満のペプチド濃度でサイトカインを分泌できるため、高い機能的結合力を示しました (図 3B)。 F12 TIL 培養の特異性を決定するために、元の E6 プールに含まれる 37 ペプチドのそれぞれに対応する個々のペプチドで自家 B-LCL をパルスしました (補足表 3)。 F12由来のCD4+ TILは、11アミノ酸のコア配列を共有するペプチドE61-15およびE65-19で刺激されると、IFN-αを分泌した（補足図2D）。 HLA ブロッキング Ab の存在下での共培養実験では、B-LCL が抗 HLA-DQ Ab でブロックされたが、抗 HLA-DR またはアイソタイプ コントロール Ab ではブロックされなかった場合、TIL による IFN 分泌が大幅に減少することが明らかになりました (図 3C)。 どの HLA-DQ 対立遺伝子がこのエピトープの提示に関与しているかを決定するために、既知の HLA-DQ 対立遺伝子 (補足表 4) を発現する B-LCL に E61-15 をパルスしたところ、HLA-DQA1*01 を発現する KAS011 細胞が存在することがわかりました。 :02 および DQB1*05:02 を発現するが、DQA1*05:05 および DQB1*03:01 を発現する Hu{65}} B-LCL は、自家 Hu-56 と同等の方法で TIL に抗原を提示できませんでした。 } B-LCL (図 3D)。 最後に、我々は、以前に同定された TCR 配列が実際に E6 認識に関与していることを検証しようとしました。 CD69およびPD-1の上方制御によって証明されるように、初代ヒト健康ドナーCD4+ T細胞におけるF12 TCRの発現は、E61-15ペプチドの認識を促進するのに十分であった（図3E） ）。 総合すると、これらの結果は、モノクローナル CD4+ TIL によって認識される E6 の HLA-DQ 制限エピトープの同定を示しています。 E6-特異的 CD4+ T 細胞は、MHC-II を発現する自己腫瘍細胞を認識したり殺したりしません。 最近の研究では、一部のヒトの癌における細胞傷害性 CD4+ TIL の遺伝的特徴が特定されました (14、15)。 しかし、細胞傷害性CD4+ T細胞がHPV駆動のがんに関与しているかどうかは不明です。 TIL 由来の E6-特異的 CD4+ T 細胞が HNSCC-56 を直接認識できるかどうかを判断するために、まずその MHC-II 発現状態を調査しました。 腫瘍細胞は培養中に検出可能な表面 MHC-II を発現しませんでしたが、IFN-II による 72 時間の処理は MHC-II の上方制御を誘導するのに十分でした (図 4A)。 次に、HNSCC-56をCD4+ F12 TILで培養しました。 重要なことに、IFN-分泌によって測定されるように、IFN-で前処理されたMHC-II+腫瘍細胞はCD{99}} TILを刺激できませんでした（図4B）。
図 1. HPV-16+ HNSCC からの E6- 反応性 CD4+ および CD8+ TIL の同定。 (A)
図 2. Hu-56 TIL からの HLA-A*02:01 限定の E6- 特異的 TCR の機能的特徴。 (A)
しかし、TIL の添加前に E61-15 でパルスした IFN 処理腫瘍細胞株は T 細胞応答を刺激できました。これは、内因的に発現する細胞株における制限 HLA-DQ 対立遺伝子の表面発現が示唆されています。 E6 は腫瘍認識には十分ではありませんでしたが、標的ペプチドの外因性ローディングが必要でした。 外因性標的ペプチド負荷の同じ要件は、高レベルの表面 MHC-II を構成的に発現する CIITA 形質導入腫瘍細胞 (HNSCC-56 CIITA) でも観察されました (図 4B)。 CD4+ TILがAPC上で内因的にプロセシングされ提示されたバージョンのE6エピトープを認識できるかどうかをテストするために、MHCに融合したE6の最初の50アミノ酸をコードする発現構築物を自己B-LCLにレトロウイルスで形質導入しました。 I膜貫通ドメイン(E6-MITD)。融合アミノ酸配列の細胞膜への局在化を誘導し、エンドソーム輸送を介したMHC-II上での提示をサポートします(20)。 E6-MITD 構築物を発現する B-LCL は E6- 特異的 CD4+ TIL を刺激する可能性があり、これらの TIL によって認識されるペプチド エピトープが自然にプロセシングされ、MHC-II 上に提示される可能性があることを示しています。適切な経路に誘導されます (図 4C)。
図 3. クローン増殖した、HLA-DQ 制限のある E6- 特異的 CD4+ TIL の機能的特徴。 (A)
次に、F12 E6-特異的 CD4+ TIL が直接腫瘍細胞毒性を発揮できるかどうかを調べました。 私たちの認識アッセイのデータと一致して、E6-特異的 CD4+ TIL は、MHC-II を発現しない HNSCC-56 腫瘍細胞の増殖を制限できませんでした (図 4D) 。 さらに、HNSCC-56 CIITA 腫瘍細胞も CD4+ TIL の存在下で阻害されずに増殖しました。 しかし、E61-15ペプチドでパルスされたHNSCC-56 CIITA腫瘍細胞の増殖は、エフェクター細胞の用量依存的に阻害されました。 全体として、これらのデータは、HNSCC-56 は CD8+ T 細胞に E6 エピトープを提示できるものの、E6- 特異的 CD4+ TIL は MHC を直接認識して溶解することができないことを示唆しています。 II+ 自己腫瘍細胞。 抗原提示に関与する遺伝子はがんにおいて頻繁に変異しており、これにより T 細胞による認識が妨げられる可能性があります (21)。 HNSCC-56 腫瘍細胞に MHC-II での抗原提示を妨げる体細胞変異が含まれているかどうかを判断するために、参照サンプルとして腫瘍細胞と Hu-56 からの PBMC の全エキソーム配列決定を実行しました。 同定された 104 個の非同義体細胞変異のうち、HLADMA、HLADMB、CD74 などの MHC-II 提示経路の構成要素に明らかな変異はありませんでした (補足表 5)。 膵管腺癌患者の血液からの HLA-DRB5*01:01 限定の KRASG12V 特異的 TCR の同定。 これらの結果を受けて、我々は、腫瘍細胞が MHC-II 上で抗原を提示できないことが他の癌遺伝子にも当てはまるかどうかを判断することに着手しました。 循環腫瘍特異的 T 細胞がヒトの癌患者で同定されていることを考慮して (8、22)、膵管腺癌患者 (Hu-66) の PBMC をペプチドのプールで刺激しました (補足表 1)。 ELISPOT によって関連する T 細胞応答を特定するために、個々のペプチドで再刺激する前に、一般的な発癌性変異 (補足表 6) に対応する 14 日間のテストを行います。 これらの結果は、KRASG12V アミノ酸 1 ～ 15 に応答してバックグラウンドを超える IFN スポット数の増加によって証明されるように、KRASG12V に対する T 細胞応答の存在を示しました (図 5A)。 この応答に関連する関連する TCR を特定するために、我々は再びサイトカイン分泌アッセイを使用して IFN-β 分泌細胞を分類しました。 サイトカイン分泌アッセイにより、KRASG12Vによる再刺激に応答したCD4+ T細胞によるIFN-αの特異的産生が明らかになった(図5B)。 選別された IFN-α 分泌細胞の TCR 鎖と、この患者の未拡張 PBMC に存在する TCR 鎖を比較すると、両方の集団の中で最も高い頻度で単一の TCR クロノタイプが存在することが明らかになりました (図 5C および補足表 2)。 これらの結果は、この T 細胞クローンの頻度が PBMC のベースラインで拡大したことを示しており、我々の拡大培養における in vitro プライミングではなく、自然に生じる in vivo 応答を示唆しています。 このTCRの抗原特異性を検証するために、レトロウイルス形質導入によって初代ヒトCD4+ T細胞でTCRを発現させ、変異体KRASG12Vまたは対応するWTペプチドのいずれかをパルスした自己B-LCLとともにこれらの細胞を培養しました。 改変された T 細胞は、変異型 KRAS ペプチドで刺激されると IFN-α を分泌しましたが、WT の KRAS ペプチドでは刺激されず、この TCR が KRASG12V に特異的であることが確認されました (図 5D)。 E6 TCRからの我々の結果と一致して、KRASG12V特異的TCRを発現する改変T細胞も、MITDを含めることによってエンドソームに向けられたKRASG12Vの断片を発現するB-LCLを認識できたが、WT KRASは認識できなかった。 TCR は、内因的にプロセシングされて提示された抗原を認識します (図 5D)。
図 4. 自己腫瘍細胞は、MHC-II 上の内因性 E61-15 を CD4+ T 細胞に提示しません。 (A)
図 5. 膵管腺癌患者の血液からの HLA-DRB5*01:01 拘束性 KRASG12V 特異的 TCR の同定。 (A)
制限的な HLA 対立遺伝子を同定するために、HLA 遺伝子のさまざまな組み合わせを発現する B-LCL を使用してこれらのペプチド刺激実験を繰り返しました。 共通の HLA-B7-DR15-DQ6 ハプロタイプを発現する B-LCL は、操作された T 細胞を刺激できましたが、これらの対立遺伝子を持たない B-LCL は刺激できませんでした (図 5E)。 最終的に、ヒトHLA-DRB5*01:01をトランスフェクトしたマウスDAP3細胞株であるペプチドパルスIHW03304によるこれらの細胞の刺激により、これが制限HLA分子であることが証明された(図5F)。 MHC-II+ NCI-H2444 および DAN-G 腫瘍細胞は、CD4+ T 細胞に対して KRASG12V 由来のエピトープを提示しません。 次に、腫瘍細胞が MHC-II 上で KRASG12V 由来のエピトープを直接提示する能力を調査しました。 これらの研究用に HLA 一致 MHC-II+ 細胞株を生成するために、ヒト肺がんおよび膵臓がんに由来する KRASG12V+ 細胞株 NCI-H2444 および DAN-G に、CIITA および HLA-DRB5*01 をコードする構築物を形質導入しました。切断されたCD34レポーター遺伝子を有する01(図6A)。 我々の以前の結果と一致して、制限的HLA対立遺伝子を発現するMHC-II+腫瘍細胞は、最初に標的細胞に外因性ペプチドをパルスしない限り、TCR改変T細胞を刺激できなかった（図6B）。 重要なことは、公的に利用可能な配列決定データでは、NCI-H2444 または DAN-G のいずれの MHC-II 提示遺伝子 (つまり、HLADMA、HLADMB、CD74) にリストされた体細胞変異が存在しなかったことです (23)。 NCI-H2444 CIITA 細胞は TCR 改変 T 細胞の存在下で阻害されずに増殖しましたが、KRASG12V ペプチドでパルスした NCI-H2444 CIITA 細胞は腫瘍増殖の遅延を経験しました (図 6C)。 HNSCC-56 で得られた結果と一致して、HLA-A*03:01-制限された KRASG12V 特異的 TCR を発現する CD8+ T 細胞 (24) は、NCI-H2444 細胞を認識できましたが、認識できませんでした。 CaSki 細胞。HLA-A*03:01 は発現しますが、KRASG12V は発現しません (図 6D)。 これらの結果は、サイトゾルに存在する別個の癌遺伝子が、MHC-I 上で効果的に提示されるにもかかわらず、MHC-II+ 腫瘍細胞によっても提示できないことを示しています。 腫瘍細胞によるプログラム細胞死リガンド 1 (PD-L1) などの共抑制リガンドの発現は、T 細胞における TCR シグナル伝達を制限します (25)。 この機構が CD4+ T 細胞による MHC-II+ 腫瘍細胞の認識を妨げている可能性があるかどうかを判断するために、KRASG12V 特異的 TCR または E6- 特異的 TCR を発現する CD4+ T 細胞を培養しました。それぞれ、抗 PD-L1 ブロック Abs の有無にかかわらず、NCI-H2444 CIITA および HNSCC-56 CIITA を含む F12 TCR。 PD-L1/PD-1 相互作用の遮断は、腫瘍細胞認識を促進するには十分ではありませんでした (補足図 3)。 同様に、抗 CD28 アゴニスト Ab の添加は腫瘍細胞認識を調節しませんでした。 これらの結果は、それぞれ共抑制または共刺激シグナルの有無ではなく、抗原提示の欠如がこの表現型の原因であることを示唆しています。 いくつかの研究は、原形質膜から内部移行した内因性タンパク質が、他の細胞内コンパートメントと比較して、提示のために MHC-II に優先的にロードされることを示唆しています (26)。 KRAS タンパク質は脂質修飾を介して膜と結合することがよくありますが、膜貫通ドメインを発現しておらず、これらの相互作用は安定していません (3, 27)。 したがって、KRASG12V の免疫原性フラグメントを腫瘍細胞の細胞膜に固定することで、CD{103}} T 細胞による直接の抗原認識が可能になるのではないかと考えました。 ただし、KRASG12V-MITD コンストラクトを発現する腫瘍細胞は、P2A 結合 EGFP レポーターの発現によって証明されるように、同様に TCR 操作 CD{109}} T 細胞を刺激できませんでした（補足図 4）。 これらの結果は、細胞内癌遺伝子の局在化が腫瘍細胞による MHC-II の直接提示の唯一の決定要因ではないことを示唆しています。 さらに、これらの結果は、抗原の過剰発現だけでは MHC-II の提示を促進するのに十分ではないことを示唆しています。 これまでの我々の結果は、腫瘍特異的CD4+ T細胞が腫瘍細胞自体よりもAPCによって提示される抗原を認識する可能性が高いことを示唆しています。 したがって、HLADRB5*01:01+ DCが外因性タンパク質に由来する抗原を提示する能力を評価しました。 in vitroで生成されたHLA適合DCは、未成熟DCにKRASG12V20-merペプチドをパルスするか、KRASG12V全タンパク質を与えた場合、KRASG12V特異的TCRを発現するTCR改変CD{120}T細胞を刺激することができたが、 KRAS WT タンパク質ではありません (図 6E)。 これらの結果は、TCR は腫瘍細胞によって提示された内因性抗原を認識できないが、DC との関連で交差提示された外因性抗原は認識できることを示唆しています。
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議論
この研究の目的は、癌患者から得られた自然にプライムされた T 細胞から単離された TCR が、癌遺伝子を発現する腫瘍細胞を認識できるかどうかを判断することでした。 HNSCC TIL から得られたクラス I (HLA-A*02:01) 限定の HPV-16 E629-38 TCR に関しては、おそらく当然のことながら、自家腫瘍細胞株の両方で認識が確認されました。そして、HLA が一致し、E6- を発現する腫瘍細胞である CaSki は、十分に特徴付けられています (重要なことに、図 2 を参照)。 同じ TIL (図 1) には、かなりの数の IFN- 産生 E6- 特異的 CD4+ T 細胞 (図 3) も含まれていましたが (図 3)、対照的に、E6- は認識されませんでした。腫瘍細胞は、IFN 処理または CIITA 形質導入によって正しい提示対立遺伝子 (DQA1*01:02/DQB1*05:02) の十分な表面 MHC クラス II を発現するように誘導された場合でも、腫瘍細胞を発現します (図 4)。 CIITA 発現は、MHC-II タンパク質の表面発現だけでなく、抗原のプロセシングと提示に必要な HLA-DM および不変鎖分子も誘導します (28)。 対照的に、HLA が一致する B 細胞は、抗原が MHC-II 経路に向けられた場合、この TCR によって認識されました。 同様の状況が、KRASG12V 特異的 HLA-DRB5*01:01 制限 TCR の場合にも観察されました。この TCR は、HLA 一致 B 細胞を認識できましたが、MHC-II 発現腫瘍細胞は認識できませんでした。 MHC-II プレゼンテーション経路。 どちらのTCRも、上記の条件下で内因的に発現した抗原の認識を媒介するのに十分な機能的結合力を有しており、両方ともペプチドを負荷した標的細胞の細胞毒性を媒介することができた。 この後者の観察は、細胞傷害性 CD4+ T 細胞に関するいくつかの報告で提示された状況を反映していますが、我々のデータは、ソース抗原の内因性発現と IFN-α による MHC-II の誘導がありそうもないことを示すことで、この観察の文脈を拡張しています。核抗原または膜関連抗原に対するTCRの生理学的標的を上皮由来腫瘍細胞上に生成します。 ヒト膀胱癌および黒色腫に関する最近の研究では、TIL の中で細胞傷害性 CD4+ T 細胞に対応する遺伝的特徴が同定されました (14、15)。 機能的には、これらの細胞傷害性 CD4+ TIL は MHC-II 依存性の腫瘍を直接認識することができ、最終的には CD8+ の対応物と同様の方法でグランザイムによる標的溶解を引き起こします。 しかし、これらの発見の治療的解釈は、MHC-II を発現する固形腫瘍がほとんどないという事実によって制限される可能性があります。 実際、2つの独立した研究の結果は、黒色腫患者の約3分の1のみがMHC-II+腫瘍細胞を有しており、腫瘍内のこれらの細胞の頻度は多くの場合10%未満であることを示唆しています(15、29)。 その代わりに、腫瘍微小環境における MHC-II の主な細胞源は浸潤白血球であると思われます (26)。
図 6. MHC-II+ KRASG12V+ 腫瘍細胞は、CD4+ T 細胞に KRASG12V 由来のエピトープを提示しません。 (A)
一部の固形腫瘍細胞は構成的または誘導性 MHC-II を発現しますが、我々の結果は、TIL および PBMC の中に癌遺伝子特異的 CD4+ T 細胞が存在するにもかかわらず、これらの細胞は抗原発現タンパク質を直接認識して溶解することができないことを示しています。 MHC-II+ 腫瘍細胞は、同じタンパク質に由来するエピトープが MHC-I 上の CD8+ T 細胞に効果的に提示される可能性があります (13)。 これは、単に標的抗原を発現するだけでは、MHC-II を発現する腫瘍のサブセットに対する CD4+ T 細胞による認識を与えるのに十分ではない可能性があることを示唆しています。 さらに、この研究で調べられた細胞株には HNSCC、肺腺がん、膵臓がん由来の細胞株が含まれているため、これらの結果は複数の腫瘍タイプにわたって一貫しているようです。 自然にまたはCIITA形質導入後にMHC-IIを発現する黒色腫細胞株を直接CD4+ T細胞で認識することが2件の研究で報告されている(30、31)。 しかし、これらの研究では両方とも、試験した TCR のかなりの部分が腫瘍細胞を直接認識しませんでした。 これらのTCRが腫瘍抗原を認識しない「傍観者」クロノタイプを表すのか、それともこの研究で強調されたような抗原提示欠陥により同族抗原を認識できない腫瘍特異的TCRを表すのかは不明である。 オリベイラら。 (31) CD4+ T 細胞による直接認識は、腫瘍変異量が極めて高い 2 つの黒色腫に限定されることを実証し、この表現型が腫瘍抗原の MHC-II 提示を可能にする追加の必要な変化を与える可能性があることを示唆しています。 KRASG12V の免疫原性断片に MITD を結合しても、CD4+ T 細胞による腫瘍細胞の直接認識は生じませんでしたが、研究では、MHC-II から溶出された膜結合タンパク質に由来する内因性ペプチドに対する偏りが報告されています。膜のリサイクルによるものです (26, 32)。 黒色腫抗原 Trp1 は細胞膜に存在し、B16 腫瘍細胞による CD4+ T 細胞への直接提示を促進する可能性があります (33)。 別の黒色腫関連抗原である gp100 は、gp100 の膜貫通ドメインに依存した様式で腫瘍細胞によって CD4+ T 細胞に提示されます (34)。 マウス肉腫モデルにおけるネオアンチゲン特異的 CD4+ T 細胞の役割を調査する最近の研究では、同じく膜結合タンパク質である変異インテグリン サブユニットに由来するエピトープが、CIITA 形質導入腫瘍上の MHC-II から溶出されました。セル（35）。 我々の結果は、膜結合タンパク質はMHC-II上で直接提示するためにエンドソームに優先的に輸送される可能性があるが、免疫原性膜タンパク質の存在だけではこの提示を促進するのに十分ではないことを示唆している。 細胞内タンパク質や抗原プロセシングに関連するトランスポーターのオートファジー関連提示など、サイトゾルまたは核タンパク質のMHC-IIへのアクセスを可能にする他の非古典的提示経路が報告されており、CD4+ T細胞への依存性提示により抗原性が示されます。ペプチドはおそらく膜のリサイクル中に MHC-I から MHC-II に転移されると考えられます (36、37)。 E7 エピトープに特異的な CD4+ T 細胞による自己腫瘍細胞の直接 MHC-II 依存性認識が報告されています (38, 39)。 しかし、これらの研究はどちらも、HLA-DR 分子上の子宮頸がん細胞によって提示される、あまり普及していない発がん性 HPV サブタイプ (つまり、HPV-33 および HPV-59) によって発現される E7 タンパク質に関するものでした。 したがって、HPV サブタイプ、腫瘍組織学、および制限 HLA 対立遺伝子も、MHC-II+ 腫瘍細胞上での核 HPV 抗原の示差に関連する因子である可能性があります。 私たちのデータは、直接的な腫瘍細胞毒性がE6-およびKRASG12V特異的CD4+ T細胞のメカニズムではないことを示唆していますが、CD4+ T細胞の他の抗腫瘍メカニズムが記載されており、癌患者における腫瘍特異的 CD4+ T 細胞の養子移入により、抗腫瘍活性が実証されています (7、40、41)。 したがって、この研究で同定されたような MHC-II 制限 TCR は、米国白人患者の 1.27% と 16.10% と推定される HLA ハプロタイプに限定されたドライバー腫瘍タンパク質由来のエピトープを TCR が標的とすることを考慮すると、ヒト患者の ACT に有用である可能性がある。それぞれ、HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 および HLA-DRB5*01:01 の母集団 (42)。 特に、CD4+ T 細胞は、CD40L 依存的に抗原保有 DC にライセンスを与えることにより、腫瘍特異的 CD8+ T 細胞のプライミングを助けます (43-45)。 我々は、この研究で同定されたKRASG12V特異的TCRがDCとの関連で交差提示された抗原を認識することを実証し、これらの細胞がこの機能を介して抗腫瘍免疫に寄与できる可能性を示唆している。 CD{100}} T 細胞は、IL{102}} や IFN-- などのサイトカインを分泌することで腫瘍内の CD{101}} T 細胞を局所的に助け、CD{104}} T 細胞の生存をサポートし、腫瘍への動員 (46)。 さらに、CD{106}} TIL は、マクロファージなどの骨髄細胞上の腫瘍微小環境内の抗原を認識する可能性があります。 実際、前臨床研究では、腫瘍細胞に MHC-II が存在しない場合でも、養子移入された Trp1 CD{109} T 細胞は依然として IFN に依存して抗腫瘍免疫を発揮でき、マクロファージの細胞傷害活性の増加と相関することが実証されています (47)。 しかし、この現象は腫瘍抗原の分泌に依存しているようであり、ほとんどの癌遺伝子の場合、その分泌は最小限であると我々は推測しています。 全体として、我々の研究は、MHC-II+ 腫瘍細胞による内因性抗原の直接提示の選択性を強調しており、CD による腫瘍細胞の直接認識を促進するには、CIITA 発現も膜結合抗原の存在も単独では十分ではないことを実証しています。{{115} } T細胞。 がんにおけるCD4+ T細胞の状況依存的な役割を完全に理解するには、どのような条件下でどの抗原がMHC-II+腫瘍細胞によって直接提示される可能性があるかを特徴付けるためにさらなる研究が必要です。
カンサス植物の免疫システムを高める
メソッド
細胞培養。 TIL は以前に記載されているように採取および培養されました (48)。 簡単に説明すると、原発腫瘍組織を 2 ～ 3 mm の断片に切り分け、24-ウェルプレートに配置し、1{{102}}% を添加した RPMI-1640 で培養しました。ヒト AB 血清、ペニシリン-ストレプトマイシン、HEPES、ゲンタマイシン、および 6,000 IU/mL IL-2。 血管外に遊出した TIL は、2 ～ 3 日ごとに半培地を交換して培養しました。 末梢血由来の初代ヒト T 細胞を、10% ヒト AB 血清、ペニシリン-ストレプトマイシン (100 U/各 mL; Gibco、Thermo Fisher Scientific)、300 IU/mL IL-2、5 ng/mL IL-7、および 5 ng/mL IL-15。 患者由来の腫瘍細胞株は、以前に記載されているように生成および培養されました (17)。 簡単に説明すると、原発腫瘍組織を 2 mm 未満の断片に切断し、GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) を使用して解離させました。 腫瘍細胞を5μM Rhoキナーゼ阻害剤を含むF-培地に再懸濁し、放射線照射（30Gy）した3T3線維芽細胞のベッド上に播種しました。 最初の培養後、腫瘍細胞は、照射済み 3T3- 馴化培地と 5 μM Rho キナーゼ阻害剤を含む F 培地の 3:1 混合物中で増殖させました。 CaSki (ATCC)、NCI-H2444 (ATCC)、DAN-G (ATCC)、J76 Jurkat (ATCC)、3T3-CD40L、および B-LCL は、l-グルタミンと HEPES を補充した RPMI 培地で維持されました ( 10 mM; Gibco、Thermo Fisher Scientific）、10% FBS、1 mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco、Thermo Fisher Scientific）、1× MEM 非必須アミノ酸（Gibco、Thermo Fisher Scientific）、およびペニシリン-ストレプトマイシン（100 U/各 mL; Gibco)。 10% FBS およびペニシリン-ストレプトマイシン (それぞれ 100 U/mL; Gibco、Thermo Fisher Scientific) を添加した DMEM 培地で 293GP (ATCC) を維持しました。 IHW03304、GM3107、KAS011、D8、および D66 細胞は、Alessandro Sette (La Jolla Institute for Immunology) から寄贈されました。 ELISPOT アッセイ。 TIL または PBMC を、抗 IFN-Abs (1-D1K、Mabtech) でコーティングした ELISPOT プレートにウェルあたり 100 μ 000 細胞でプレーティングしました。 細胞は、発現前 22 時間、HPV-16 E6 および E7 PepMix (JPT) ペプチド プール、選択された発癌性変異を表すペプチド プール、または示された個々のペプチドでプールの場合は 5 ug/mL、ペプチドの場合は 10 ug/mL で再刺激されました。 ELISPOT プレートは製造元 (Mabtech) の指示に従ってください。 陽性対照として、5μg/mLのフィトヘマグルチニン-Lを使用した。 体外拡大培養。 ＰＢＭＣを、選択された発癌性突然変異を表すペプチドプールとともに５μｇ／ｍＬでプレーティングした。 10 IU/mL IL-2を含む新鮮な培地を4、7、10日目に加えました。14日目に、ELISPOTまたはサイトカイン分泌アッセイで使用するためにPBMCを再刺激しました。 TCR シーケンス。 TIL または PBMC を 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) または KRASG12V ペプチドで再刺激し、メーカーの説明書 (Miltenyi Biotec) に従ってヒト IFN-分泌アッセイ キットを使用して IFN-分泌細胞を蛍光タグ付けしました。 。 FACSAria (BD Biosciences) を使用して単一の IFN- + 細胞を 96- ウェル プレートに選別し、Illumina Miseq を使用して RNA-Seq を実行して、ペアになった TCR と鎖を同定しました。 E6-特異的CD4+ TCRクローンを同定するために、IFN-分泌細胞を上記のように選別し、TCRおよびTCR配列をネステッドマルチプレックスPCRによって増幅した（49）。 PCR産物はサンガー配列決定（ETON Biosciences）に提出された。 TCR頻度分析のために、示されたペプチドによる14-日間のex vivo増殖の前後のPBMCをAdaptive Biotechnologiesに送った。 HPV発現解析。 RNA は Hu-56 原発腫瘍細胞および腫瘍細胞株から単離され、バルク RNA-Seq に提出されました。 ペアエンド シーケンシング リードは、BWA (v0.7.12) (50) を使用して HPV 完全ゲノム (GenBank アクセッション番号 NC{106}}.2) およびその対応するトランスクリプトームにマッピングされました。 結果として得られた配列アライメント マップ ファイルは、ソートされたバイナリ アライメント マップに変換され、インデックス付けされ、続いて SAMtools (v1.2) を使用してマップされたリードをカウントしました (50)。 全エクソームシーケンス。 全エクソームシークエンシングと RNA-Seq は、ラホーヤ免疫学研究所シーケンスコアで、それぞれ Agilent 全エクソームキャプチャーキットとイルミナキットを使用して実行されました。 FFPE 生体標本は、末梢血標本を使用した一致する参照 DNA とともに、次世代シークエンシングのためにムーアズがんセンターから Tempus に配布されました。 SpeedSeq Align (v0.1.0) を使用して、腫瘍サンプルと正常サンプルのエクソームシークエンシングから得られた配列リードを参照ゲノム GRCh38 と位置合わせしました (51)。 エクソーム変異体は SpeedSeq Somatic を使用して特定され、変異体には SNPeff (v4.3i) を使用して注釈が付けられました (52)。 この原稿の RNA-Seq および全エクソーム配列決定データは、NCBI BioProject (アクセッション番号 PRJNA924789) にアップロードされました。 T 細胞レトロウイルスの形質導入。 TCR ヌクレオチド配列を合成し、BioXP 3200 (Codex) を使用して MSGV1 レトロウイルス バックボーンにクローン化しました。 この配列は、ヒト細胞での発現のためにコドンが最適化されています。 ヒト TCR 定常領域は、表面発現を強化し、優先的なペアリングを促進する置換を含むマウス TCR 定常領域と交換されました (53、54)。 ヒト PBMC は軟膜から単離されました。 CD4+ または CD8+ T 細胞を磁気選択によって除去し、残りのすべてのリンパ球を含む陰性画分を、50 ng/mL 抗 CD3 Ab (OKT3) を含む T 細胞培地で 2 日間培養しました。日々。
カンクサの利点 - 抗腫瘍
TCR レトロウイルス上清は、関連する TCR 配列および RD113 プラスミドを含む MSGV1 ベクターによる 293GP 細胞のコトランスフェクションによって生成されました。 トランスフェクションの 2 日後、レトロウイルスの上清を採取し、新鮮な状態で使用するか、-80 度で冷凍して使用しました。 形質導入は、以前に記載されているように (5)、RetroNectin でコーティングされたプレート (Takara) 上で実行されました。 マウス TCR 定常領域の発現をフローサイトメトリーによって評価し、形質導入効率を決定しました。 TCR 改変 T 細胞は、最初の刺激後 7 日以内に使用されました。 T細胞機能アッセイ。 5 × 104 TIL、形質導入 T 細胞、または J76 Jurkat 細胞を、示された濃度のペプチドで一晩パルスした 1 × 105 B-LCL、または前日に {{16} に播種した 5 × 103 腫瘍細胞と共培養しました。 }ウェルはそれぞれU底プレートまたは平底プレートです。 示されている場合、抗 CD28 アゴニスト (クローン CD28.2、BioLegend) または抗 PD-L1 ブロッキング (クローン 29E.2A3、BioLegend) Ab をそれぞれ 5 および 10 ug/mL で T 細胞および腫瘍細胞の共培養物に添加しました。 サイトカインおよび活性化マーカーアッセイでは、PMA およびイオノマイシンを含む 1x Cell Activation Cocktail (BioLegend) をポジティブコントロールとして使用しました。 HLA ブロッキング研究では、T 細胞を添加する少なくとも 2 時間前に、ペプチドパルスした B-LCL に以下の Abs 20 ug/mL を添加しました: 抗 HLA-DQ (Tü169、BioLegend)、抗 HLA-DR (L243、BioLegend)、またはマウス IgG2a アイソタイプ コントロール (MOPC-173、BioLegend)。 示されている場合、T細胞を添加する前に、腫瘍細胞を10 ng/mLの組換えIFN-αとともに72時間培養した。 18 ～ 24 時間後に上清を回収し、ELISA (Thermo Fisher Scientific) によって IFN-α を測定し、フローサイトメトリー用に細胞ペレットを染色しました。 細胞毒性アッセイは、示されたエフェクター対標的比で T 細胞と腫瘍細胞を共培養することによって実行されました。 簡単に説明すると、5 × 103 個の腫瘍細胞を播種し、一晩培養した後、示された比率で T 細胞を添加しました。 標的細胞の溶解は、実験終了まで 30 分ごとに細胞接着による電気インピーダンスを評価する xCELLigence リアルタイム セル アナライザー (ACEA Biosciences) を使用して測定しました。 データはxCELLigence RTCAソフトウェアパッケージを使用して分析され、結果はT細胞が添加された時点で1に正規化された細胞インデックスとして報告されました。 MHC-II プレゼンテーション アッセイ。 以下をコードする合成 DNA 構築物を生成し、BioXP 3200 (Codex) を使用して MSGV1 にクローン化しました: ヒト HLA-B 遺伝子の N 末端 25 アミノ酸、その後に HPV-16 E6 の最初の 50 アミノ酸または、ヒト HLA-B、T2A 自己切断要素、および EGFP のコード配列の C 末端 55 アミノ酸に融合された KRASG12V の 25 アミノ酸。 ウイルス上清を上記のように生成し、ヒト CD40L (3T3-CD40L) を発現する照射 (0.5 Gy) 3T3 細胞のベッド上で一晩刺激した後、自己 B-LCL をレトロネクチンでコーティングしたプレート上に形質導入しました。 形質導入効率は、EGFP 発現のフローサイトメトリー定量化によって評価されました。 形質導入されたB-LCLは、自己TILと共培養する前に、200 IU/mLの組換えヒトIL-4（PeproTech）の存在下で3T3-CD40Lで2〜3日間連続2ラウンド刺激されました。 抗原提示アッセイ用の DC の生成。 DCはプラスチック接着法を使用して生成されました。 凍結したＰＢＭＣを解凍し、ＤＣ培地（Ｌ－グルタミン、５％熱不活化ヒトＡＢ血清、および各１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ｛８８｝）に３７℃で２時間プレーティングした。 非接着細胞を温かい PBS で洗浄することによって除去し、接着細胞を 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) および 500 U/mL IL-4 (PeproTech) を補充した DC 培地で 6 日間培養しました。 。 1 μg/mL KRASG12V ペプチドまたは 20 μg/mL KRASG12V または WT KRAS タンパク質 (Abcam) を未成熟 DC に一晩直接添加しました。 翌日、DCを採取し、TCR改変T細胞と1:1の比率で一晩共培養した後、フローサイトメトリーによってCD137の上方制御を評価した。 腫瘍細胞のレトロウイルス形質導入。 ヒト CIITA のコード配列を合成し (Integrated DNA Technologies)、Gibson Assembly によって MSGV1 にクローン化しました。 HLADRB5*01:01のコード配列およびP2A配列によって分離された鎖を合成し(Integrated DNA Technologies)、Gibson AssemblyによりT2A配列、その後に切断されたCD34レポーター配列の上流で修飾pHAGEレンチウイルスベクターにクローニングした。 レトロウイルス上清は、上記のように MSGV1 を使用して生成されました。 レンチウイルス上清は、pHAGE、tat、rev、gag/pol、および vsv-g プラスミドによる 293T 細胞のコトランスフェクションによって生成されました。 24時間後にウイルス上清を回収し、Amicon Ultra 5チューブ(MilliporeSigma)中で遠心分離により濃縮した。 腫瘍細胞を播種し、１日後、培地を、１０μｇ／ｍＬのポリブレンを補充したレトロウイルスまたはレンチウイルスの上清と交換した。 4時間後、ウイルスを含む上清を吸引し、培地と交換した。 MHC-II+ および CD34+ 腫瘍細胞は、FACS Fusion セルソーター (BD Biosciences) を使用して選別されました。 フローサイトメトリー。 細胞は、以下の抗原に対する蛍光色素結合モノクローナル抗体で標識されました: 抗ヒト CD3-PE (OKT3、Tonbo、Cytek Biosciences)、CD4-PE-Cyanine7 (SK3、Tonbo、Cytek Biosciences)、CD8-APC (Hit8a、Tonbo) 、Cytek Biosciences)、CD34–Alexa Fluor 647 (581、BioLegend)、CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50、BioLegend)、CD137–PE (4B4-1、Miltenyi Biotec)、PD-1 –BV650 (EH12.2H7、BioLegend)、HLA-II-APC (Tü39、BioLegend)、および抗マウス TCR -APC (H57-597、Tonbo、Cytek Biosciences)。 死細胞は、DAPI または LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific) で染色しました。 E629-38 – HLA-A*02:01 – PE 四量体は、NIH 四量体コア施設によって組み立てられ、標識されました。 細胞を氷上で１μｇ／ｍＬ四量体で１時間染色した。 表面抗原の Ab 染色を氷上で 15 分間実行しました。 細胞内サイトカイン染色 (ICS) の場合、Brefeldin A の存在下で、T 細胞をペプチドパルス APC と 4 ～ 6 時間共培養しました。細胞を透過処理し、表面染色後、Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) を使用して細胞内サイトカインを染色しました。 、メーカーの指示に従ってください。 サイトカイン染色には次の蛍光色素結合 Ab を使用しました: IFN- –APC (4S.B3、BioLegend)、IL-2 – FITC (MQ1- 17H12、BioLegend)、TNF- –BV785 (Mab11) 、BioLegend)、および Granzyme B–PE (QA16A02、BioLegend)。 データはFACSCelestaフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得し、FlowJo v10.7ソフトウェアで分析した。 統計。 統計分析は、Prism 8 (GraphPad Software) を使用して実行されました。 ICS の比較には、対応のない2-尾の t 検定が使用されました。 HLA ブロック Ab-Ab を介した T 細胞シグナル伝達の抑制を比較するために、2- 方法 ANOVA を使用しました。 P < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 研究の承認。 この研究で使用された匿名化されたヒトサンプルは、UCSD IRB プロトコル 101391CX「腫瘍環境の表現型解析と細胞分離」を通じてインフォームドコンセントの下で取得されました。 書面によるインフォームドコンセントが研究対象者によって提供されました。
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