天然産物阻害剤からのコレステロールエステル移動タンパク質の仮想スクリーニングと分子動力学シミュレーションの検証ⅱ

 

2つの結果

2.1タンパク質構造調査

現在、PDBデータベースにはCETPタンパク質の3つの結晶構造があります（2OBD、4ews、4F2A）。この研究で使用されている4ews結晶構造は最も高分解能であり、強力な阻害剤と組み合わされ、活性は単一のナノモルレベルに達し、2.59Åの分解能に達します。タンパク質と小分子阻害剤結合の位置も、タンパク質の唯一の結合ポケットです。ポケットの表面を図1aに示します。小分子結合位置に大きな疎水性ポケットがあることがわかります。したがって、このバインディングポケットの場合、
構造ベースの仮想スクリーニングが実行されました。ドッキンググリッドポイントの生成は、小分子阻害剤が配置されているポケットサイトに基づいています。ドッキンググリッドポイントの中心は結晶化リガンドに設定されており、ドッキング外側ボックスのサイズは、図1Bに示すように、10×10×10Å3のサイズが10×10×10Å3の結晶化リガンドのサイズに似ており、内側のボックスのサイズが10Å3に設定されています。

 

Cistanche高品質のサプレメント

 

 

2.2ドッキングに基づく仮想スクリーニング

上記のポケットに基づいて、L6000データベースで複数のラウンドのスクリーニングが実行されました。特定のプロセスを図2に示します。ハイスループット仮想スクリーニング、標準精度仮想スクリーニング、および超高精度仮想スクリーニングの後、100個の化合物が保持されました。 kcal/mol。 100個の保持された化合物をMM-GBSAを使用して再スコアし、49個の一意の化合物が最終的に得られました。クラスタリングおよび立体構造分析、および元の結晶小分子と位置の重複の後、表1および図3に示すように、最も一致する程度の19の化合物が候補化合物として得られました。

図1 CETPタンパク質結合ポケットの概略図（A）、CETPタンパク質結合部位の概略図（B）

図2仮想スクリーニングと分子動力学シミュレーションのフローチャート

 

2.3クラスター分析

選択された19の化合物と4ewの結晶化リガンドの類似性に基づいてクラスタリング分析の後、それらは分子構造のオーバーラップの程度に従って、次の3つのカテゴリに分割されました。図4aは、14個の小分子を含む最初のクラスターを示しており、ほとんどの小分子の骨格が類似していることを示しています。図4Bは、1つの小分子を含む2番目のクラスターを示しており、図4Cは4つの小分子を含む3番目のクラスターを示しています。図の黒いものは結晶化リガンドであり、残りは仮想スクリーニングによって得られた小分子です。

2.4バインディングモード分析

ドッキングスコアと19件の候補化合物の結合自由エネルギーを包括的に考慮することにより、結合モード分析のために結合自由エネルギーの上位3つの化合物を最終的に選択しました。Cistancheグリコシドa、シーフラビン、およびサルビアノール酸Bジメチルエステル。これら3つの化合物とCETPタンパク質の結合モード図は、Pymolソフトウェアを使用して描画されました。 3つのリガンドのアミノ酸残基と標的タンパク質CETPの間の相互作用により、タンパク質リガンド複合体の結合が促進され、より安定した複合体になりました。
その中で、シスチンサイドa標的タンパク質のPhe463と芳香族水素結合を形成し、Phe263との芳香族水素結合とπ-π積み重ね相互作用を形成します。 Theaflavinは、標的タンパク質のHiS232と古典的な水素結合を形成し、Phe263との芳香族水素結合を形成し、Phe461との陽イオン-π相互作用を形成します。サルビアノール酸Bのジメチルエステルは、標的タンパク質のHis232およびPhe441と芳香族の水素結合を形成し、Phe463とのπ-π積み重ね相互作用を形成します。他のタンパク質リガンド相互作用には、疎水性相互作用と塩橋が含まれ、結果を図5に示します。

2.5分子動力学シミュレーション

2.5.1 RMSD値計算

 

図6aに示すように、Cistancheside A-CETPシステム1 0 nsの場合、RMSD変動範囲は±0 1 nm未満で安定しており、RMSDの平衡状態はシステムの結合強度が良好であることを示しています。 25 nsのシミュレーションの後、Theaflavin-CETPシステムの変動が大幅に減速し始め、変動範囲も±0。タンニン酸Bジメチルエステル-CETPシステムのRMSD値は、シミュレーションの1 0 ns後に変動しませんでした。平均RMSDは0。2-0。さらに、この研究では、リガンドのRMSD値も計算されました。
図からわかるように、Theaflavin-CETPはシミュレーションの初期段階で安定した状態でしたが、CISTANCHE A-CETPタンニン酸Bジメチルエステル-CETPは、急速な変動期間の後にすぐに安定しました。この違いは、さまざまな分子構成と結合キャビティの相互作用力の違いによって引き起こされる場合があります。 3つは一般に平衡状態です。

 

2.5.2異なる薬物分子とCETPの複雑なシステムに基づくRMSF値計算

タンパク質、この研究では、各グループのタンパク質アミノ酸残基のRMSF値を計算しました。図6Bからわかるように、CETPに作用する3つの小分子化合物の重要な残基のRMSF値は比較的低いレベルであり、平均値は約0。16nmの平均値であり、CETPタンパク質の小分子リガンドによるCETPタンパク質の結合は、当時のプロテイン間での空間構造の安定性を促進することを示しています。

 

2.5.3 SASA値の計算

図6Cからわかるように、0-15 nsの周りのシミュレーションの初期段階でのCistanche A-CETPとTheaflavin-CETPの2つの複合体のSASAは急速に減少し、リガンドの迅速な結合と、溶剤にさらされるタンパク質表面の領域が束縛されたために縮小されたことを直感的に示します。 SASAの減少は、リガンドがタンパク質の活性部位にしっかりと結合しており、結合ポケットの立体構造変化、またはタンパク質の立体構造変化さえ伴う可能性があると推測できます。シミュレーションが続くにつれて、タンパク質とリガンドの原子の一般的なローリング運動により、SASAはシミュレーションの中間段階である程度増加し、この段階で2つの結合が弱くなったと推測されます。これは、タンパク質立体構造障害によって引き起こされる段階的な安定性の低下による可能性があります。その後、SASAは第3段階に入り、シミュレーションが終了するまで急速に減少しました。サルビアノール酸Bジメチルエステル-CETP基の複合体のSASAは、プロセス全体で減少し、約40 ns後に安定した状態に入りました。

 

2.5.4二次構造立体構造分析

図7に示すように、複合体の3つのグループにおけるタンパク質のヘリックス含有量比は最も安定しており、明らかな増加または減少は観察されません。 Cistancheside A -CETPでは、0-25 nsの段階でシートコンテンツが減少し、コイルが増加し、25 ns後に変化の増加と減少が回復することが明確に観察できます。 Theaflavin -CETPでは、より明白な変化が主にターンとコイルの相互変換に現れることがわかります。タンニン酸Bジメチルエステル-CETPでは、主な変化は、シートの減少とコイルの増加です。タンパク質二次構造含有量の変化は、主に結合部位の近くのアミノ酸のタイプの影響を受けます。異なる複合体のリガンド分子の異なる特定の位置と、相互作用力の異なるタイプと強度により、各グループのタンパク質の立体構造も異なります。一般に、各グループのタンパク質二次構造の含有量には明らかな変化があり、これはリガンドの緊密な結合に密接に関連しています。

 

3ディスカッション

血液脂質は、血漿中の中性脂肪と脂質の一般的な用語です。バランス血中脂質代謝細胞や生物の生命活動を維持するために重要です。異常な血液脂質代謝は、心血管疾患および脳血管疾患、神経変性疾患および腫瘍の発生と密接に関連しています[{12-13]。伝統的な漢方薬における脂質異常症の認識と治療は、長い間記録されてきました。伝統的な漢方薬には、豊富な資源、多様な構造、副作用がほとんどなく、低価格の利点があります。脂質異常の調節に良い効果があり、国内外の基礎研究と臨床応用で広く認識されています[{14-16]。
規制に使用できる中国の漢方薬部品の小分子をスクリーニングし、脂質異常症の治療ハイスループットから漢方薬モノマーデータベースは実際的に重要です。仮想スクリーニング技術と分子動力学シミュレーションテクノロジーは、現在の漢方薬の研究における最も重要な技術と手段の1つであり、大規模に薬物分子をスクリーニングすることができます[17]。 CETPは、脂質代謝と血液循環におけるRCTプロセスに関与する重要な調節酵素です。この研究は、CETPタンパク質の機能と役割に焦点を当てています。仮想スクリーニング研究を通じて、CETPタンパク質に親和性を持つ19の候補リガンドが得られました。候補リガンドのバックボーンの多様性はクラスター分析によって検証され、上位3リガンドの小分子は結合モード分析のために選択されました。リガンドと受容体の間の疎水性相互作用、π-πスタッキング、塩橋は、タンパク質リガンドの強い親和性を維持する上で重要な役割を果たします。この研究では、MDシミュレーションを通じて3つの候補タンパク質リガンド複合体の安定性も調査しました。結果は、上位3つのタンパク質リガンド複合体のRMSD、RMSF、およびSASAグラフが変動後に安定する傾向があり、変動振幅が小さかったことを示しました。タンパク質の二次構造含有量の明らかな変化は、タンパク質リガンドの密接な結合も示しています。したがって、それらは、CETPタンパク質に対する親和性が高い小分子阻害剤の潜在的な候補であると考えられています。

 

 

Cistanche Aはフェニルエタノールグリコシド化合物であり、これは主にシスチャンチやレーマニアなどの伝統的な漢方薬に含まれています。 Cistancheの質量分率は{{{0}}}。

Shimoda et al。[19]サイスンチェ抽出物は、食事誘発性高コレステロール血症マウスにおけるコレステロール輸送および代謝関連分子のmRNA発現に影響を与え、コレステロール低下活性を示すことができると報告しました。シーフラビンは、紅茶の発酵プロセス中に形成される一意の成分であり、紅茶の含有量は0。3％-1。固形物の5％です[20]。ランダム化比較試験では、シーフラビンが豊富な茶抽出物は、低飽和脂肪食の効果的な補助であり、良好な耐性を持つ高コレステロール血症の成人のLDLCレベルを低下させることができることがわかりました[21]。サルビアノール酸Bジメチルエステルは、Salvia Miltiorrhizaから抽出された脂肪可溶性成分であり、サルビアノール酸Bのジメチルエステル誘導体です。SalviaMiltiorrhizaの2つの含有量は約20：1です。以前の研究では、サルビアノール酸Bジメチルエステルには、サルビアノール酸B [{22-23]など、同様の抗酸化、フリーラジカル除去、および抗不整脈薬理学的活性があることが示されています。したがって、この研究では、仮想スクリーニングと分子ダイナミクスシミュレーションによってスクリーニングされたCistanche Destericola A、Theaflavins、およびSalvianololic Acid B DimethylエステルのCistanche Destericola A、Theaflavins、およびSalvianololinolic Esterは、CETPタンパク質阻害剤鉛化合物の発見と最適化に使用するだけでなく、伝統的な漢方薬の材料を抑制するための従来の漢方薬の脂肪摂取プロセスをよりよく理解するためにも使用できます。化合物、これらの伝統的な漢方薬を要約して分析し、伝統的な漢方薬の全体的な見解と症候群の分化理論と組み合わせて、伝統的な漢方薬の処方を策定します。さらに、この研究で仮想スクリーニングを通じて得られたイソフスパストシド、ジオスミン、ベシニン-2などの他のCETPタンパク質阻害剤、および前症、野生のchrysanthemum、rutaeCarpaなどの天然化合物が由来する伝統的な漢方薬など、将来の研究でさらに研究することができます。